小鼠肾脏驻留型CD8⁺ T细胞的分离及其流式细胞术分析

CD8+ T 细胞在不同组织中具有不同的特征，肾脏作为非黏膜和非淋巴组织的一个典型例子，尤为如此。要全面理解T细胞生物学，直接表征肾脏驻留的T细胞至关重要。本文将介绍我们便捷的方法，用于分离肾脏驻留的CD8+ T细胞，并适用于后续的流式细胞术分析。

该方法可为感染后产生的效应和记忆性CD8+T细胞以及自身免疫应答的研究提供见解。该实验步骤将由本实验室的研究科学家Dr.Chaoyu Ma执行。首先，将生物素标记的抗CD8α抗体用PBS稀释至每毫升15微克，确保每只小鼠可注射200微升。

注射前，使用上方的加热灯对小鼠尾静脉加热 5 至 10 分钟，使其扩张。用 28 号胰岛素注射器吸取 200 µL 预先稀释的抗体混合液，并通过上下推动活塞排除所有气泡。将针头弯曲，使针头与注射器之间形成 150 度角，斜面向上，从而使针头与尾静脉平行。

使用啮齿类动物固定器固定小鼠，并用70%乙醇喷洒尾部，使静脉清晰可见。用非优势手的拇指和中指夹住尾部远端，将食指置于注射部位下方。用优势手将针头平行于朝向心脏的方向插入静脉，缓慢注射200 µL抗体。

移除针头，并轻轻按压注射部位直至出血停止。处死小鼠后，用剪刀分离肾脏并转移至1.5毫升微量离心管中。将样品置于冰上，直至进一步处理。

每只小鼠使用一个孔，在六孔板中每孔加入三毫升消化液，共准备六孔板，并将其置于冰上保存。向每个样本管中加入300微升消化液，并用直头弹簧剪将肾脏样本剪碎。将剪碎的肾脏样本转移至含有消化液的六孔板中。

将样品在37摄氏度下轻轻振荡孵育45分钟，然后使用3毫升注射器的推杆凸缘匀浆组织，并将其转移至15毫升锥形管中。在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于3毫升含10% FCS的RPMI培养基中。

在4°C条件下，以500 × g离心样品5分钟，然后弃去上清液，并用5 mL 44%密度梯度介质与RPMI混合液重悬细胞沉淀。取一支含有3 mL 67%密度梯度介质与PBS混合液的3 mL移液器，将吸头直接插入每根试管底部，缓慢释放溶液，使较重的溶液在底部形成清晰的分层。将样品以900 × g离心20分钟，加速度和刹车设置调至较低水平，然后小心地从离心机中取出试管，避免扰动各层。

用移液管移除上层液体，注意不要触碰淋巴细胞层，将淋巴细胞层转移至新的15毫升离心管中。加入PBS和5%FCS至管中，然后通过缓慢倒置管体4到6次进行混匀。在4°C条件下以500 × g离心5分钟，随后弃去上清液，并用500 µL完全RPMI培养基重悬细胞沉淀。

细胞现在已准备好进行流式细胞术染色。即使经过密度梯度离心法富集淋巴细胞后，最终产物中仍常见大量非淋巴细胞。然而，在聚焦于活淋巴细胞后，CD8+T 淋巴细胞易于鉴定。

与预期一致，只有血管外的CD8+ T细胞能够有效获得组织驻留记忆T细胞表型，例如CD69的上调和Ly6C的下调。与感染小鼠不同，在SPF设施中饲养的年轻 naïve 小鼠体内分离出的绝大多数CD8+ T细胞被CD8α抗体标记，因此属于血管内室细胞。该技术显著加快了对高血管化器官中组织驻留免疫细胞的研究进程。