一种用于研究血管医疗器械血液相容性及宿主细胞激活的体外血流动力学回路模型

该血流动力学循环模型可使研究人员在标准化条件下测试血管类器械（如灌注管路或支架）的体外血液相容性。该技术不会通过机械力对血液产生影响，从而避免因血液成分的内在激活而导致的误导性结果。

在尝试进行实验之前，必须练习正确的机械部件组装、完美的回路闭合系统构建，以及缓慢地将血液加载到回路中。准备回路组装时，使用管子切割器在平坦表面上切割长度为250厘米、内径为5毫米的管路。然后将管子的开口端插入一段短的硅胶管中，该硅胶管的内径需与被测管路的外径相匹配，以形成回路形状。

小心拧紧张力带连接器的锁紧螺钉，并调节闭合力，使两个弯曲部分之间无任何间隙。若锁紧螺钉已完全拧紧，但聚碳酸酯带的张力仍显得不足，无法闭合两个弯曲部分之间的间隙，则应打开锁紧系统，剪除张力带的几毫米长度。为制备支架环组件，打开其中两个环，将管材从张力带系统中取出。

然后按照制造商的说明将支架插入管子的中部。当实验所需的环数制备完成后，将环固定在旋转装置的环架上，置于37摄氏度水浴外，并将环架连接到水浴内的旋转装置上。接下来，每采集两个环的血液，需准备一支10毫升注射器，每支注射器中加入150微升新鲜配制的肝素储备液，并使用21号蝶形针头轻柔地将血液收集到注射器中，注意避免因真空过大导致溶血或细胞活化。

当所有血液收集完毕后，将血液转移至玻璃烧杯中，并使用5 mL血清移液管轻轻混匀血液与肝素。当获得均匀溶液后，将移液管尖端不完全插入管内的状态下，小心地向每个环状容器中加入5 mL血液。每个环状容器加满后立即封闭，并确认环状容器、张力带和支架均已妥善固定。

然后以每分钟30转的速度旋转环状管3小时。旋转结束后，将环状管置于支架上静置2分钟，使血液积聚在环的底部，再小心打开连接器，将成对样本中的血液分别吸入各自的10毫升玻璃烧杯中。待所有血液收集完毕后，用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗每根管子，并用手术刀从每根管子的末端小心切割下一厘米长的样品。

将样品在4°C条件下于2%戊二醛中过夜孵育，随后在室温下用1%四氧化锇孵育15分钟。四氧化锇孵育结束后，将样品依次用浓度递增的乙醇系列进行脱水处理，每个浓度脱水20分钟，最后在100%乙醇中脱水30分钟。100%乙醇孵育结束后，将样品在室温下干燥过夜，然后使用X射线显微CT扫描仪在5千伏加速电压下通过扫描电子显微镜对样品进行成像。

用于血液样本的流式细胞术分析。将每个样本中的 100 微升血液转移至九个 5 毫升 FACS 管中的每一个管中，并通过每管加入 100 微升 4% 多聚甲醛，在室温下避光固定 15 分钟。洗涤后，每管中加入 1 毫升红细胞裂解缓冲液重悬各沉淀，在室温下避光孵育 5 分钟。

孵育结束后，每管加入一毫升 PBS，通过离心洗涤样本，并将去上清后的样本置于冰上。为制备单染补偿微珠，分别向一毫升 FACS 缓冲液中加入四滴阳性微珠和四滴阴性微珠，涡旋振荡使微珠悬浮液均匀。将每种悬浮液各取 100 微升加入预先标记好的四或五个毫升 FACS 管中，并每管加入一毫升 FACS 缓冲液洗涤微珠。

随后，向每管实验组和荧光减一对照管中加入100微升相应的涡旋抗体混合液，并轻轻混匀。室温避光孵育30分钟。孵育结束后，每份样品加入1毫升新鲜FACS缓冲液洗涤，并将沉淀重悬于每管250微升FACS缓冲液中。

在按照标准方案通过流式细胞术分析细胞样品中的微珠之前，可通过微计算机断层扫描和扫描电子显微镜成像观察拼接的两个环路整个表面的血细胞分布情况，而在无间隙的闭合环路中未观察到血凝块。全血细胞计数分析显示，在任何测试条件下红细胞数量均无显著差异，然而，乳胶环组中的血小板和白细胞数量显著减少，游离血红蛋白数量显著增加，表明乳胶的生物相容性极差。

尽管所有被测试的血管装置均会引起凝血系统和补体成分的活化程度升高，但与聚合物涂层的PVC环相比，肝素涂层的PVC环在两种活化指标上均呈现出降低的趋势。乳胶环的TNF、IL-6和中性粒细胞弹性蛋白酶水平最高，表明乳胶可强烈激活白细胞。

从乳胶管中回收的CD41阳性血小板表现出极高的CD62P中位荧光强度，而粒细胞和淋巴细胞上的整合表达则显著降低。值得注意的是，乳胶管中单核细胞的整合表达水平较高，提示单核细胞与活化血小板之间存在相互作用。事实上，对单核细胞-血小板聚集体的染色显示，乳胶管及支架环中聚集体形成的倾向增加。

尽管单核细胞在乳胶环中的出现频率有所降低。为避免血液成分的内在激活，确保乳胶环正确闭合并小心处理血液至关重要。因此，通过遵循此操作步骤，可分析同种异体蛋白或TRUCKs与炎症或药物研究中所用血液成分之间的相互作用。