Name: 研究血管医疗器械血细胞相容性和宿主细胞活化的体外血流循环模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 了解体外血流循环模型用于评估血管医疗器械血细胞相容性的标准化方法。该技术避免机械力对血液成分的影响，确保符合ISO 10993-4标准，为灌注管和支架的安全性测试提供可靠方案。

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作者感谢Elena Denks女士提供的技术协助。

本研究经马格德堡大学医院医学院伦理委员会批准（申请编号 88/18），受试者在采血前均签署了书面知情同意书。
1. 肝素储备液的配制与采血
<ol>
	<li>计算整个实验所需的血液量。 
	注意：每个血管装置（双份，即两个循环）大约需要 5 mL 肝素化血液。同样，每个基线和静态条件也需要 5 mL 血液，应置于室温下备用。</li>
	<li>通过将未分级肝素（例如 Rotexmedia）溶于去离子水中，配制浓度为 100 IU/mL 的肝素储备液。每 10 mL 新鲜血液使用 150 µL 该溶液进行肝素化处理。</li>
	<li>计算全血细胞计数、ELISA 和 FACS 检测所需的血液及血浆量。 
	注意：本研究中展示的测量数据来自并行运行的两个循环（其中一个为重复），总血容量为 10 mL。</li>
	<li>根据所需血液量，向 10 mL 注射器中加入 150 µL 肝素储备液，以防止血液凝固，最终肝素浓度为 1.5 IU/mL 血液。</li>
	<li>使用蝶形针头（规格：21 G）采血。应轻柔地填充注射器，避免因负压过大导致溶血或细胞激活。 
	注意：实验开始前应获得当地伦理委员会的批准。每位人血捐献者均需签署知情同意书。确保献血者健康，且未服用任何药物，尤其是实验前至少 10 天内未使用抗血小板药物或非甾体类抗炎药。值得注意的是，在首次比较不同类型血管装置时（如本文所述），建议使用同一供体。为进一步评估个体间差异，可使用不同供体重复该方案。</li>
	<li>将血液收集至玻璃烧杯中，避免剧烈震荡。</li>
</ol>
2. 体外血流动力学回路组装
<ol>
	<li>将水浴锅加水至水位达到旋转单元中心位置。将水温设定为 37 °C。</li>
	<li>用于测试不同管路材料（polyPVC、hepPVC、PVC 和乳胶）的环路组装
	<ol>
		<li>用管子切割器裁剪两段每种管材，每段长50 cm（内径5 mm）。确保切面平整，这对于小直径环路的完全闭合尤为关键，以保证血液在接合边缘处无扭曲流动。 
		注意：本实验方案全程使用内径为5 mm的试管。</li>
		<li>为便于操作并避免旋转后样品处理的延迟，应并行运行四个循环（两种材料各设两个重复）。</li>
		<li>为形成环状结构，将管子的开口端插入一段与被测管外径相匹配的短硅胶管中。</li>
		<li>使用聚碳酸酯张力带以确保环形结构正确闭合。首次使用时，通过剪刀将张力带裁剪至适合环外径的长度，并使用3 mm扭矩扳手固定。</li>
		<li>在检查管端对接情况的同时，小心拧紧张力带连接器的锁紧螺钉。调节闭合力，确保管端之间无任何间隙。若锁紧螺钉已完全拧紧，而聚碳酸酯带的张力仍显得不足，无法闭合管端间隙，则应打开锁定系统，裁剪掉几毫米的张力带。重复此操作，直至实现精确的环形闭合为止。图1A).</li>
		<li>如果管材非常柔软且容易在张力带内滑动，可用电工胶带将环固定在张力带上（图1B，C).</li>
		<li>准备一个额外的PVC环路用于温度控制，其尺寸与测试环路相同。</li>
		<li>将环圈固定在水浴外旋转装置的环圈托架中，然后将环圈托架连接到水浴内旋转装置上（图1E).</li>
		<li>部分松开张力带上的环，拔下每根管子的一端以打开环路。</li>
		<li>用5 mL血清移液管将5 mL血液轻轻加入每个环中。在将血液加入环之前，先在玻璃烧杯中用移液管缓慢吹打混匀2次。</li>
		<li>取一次性温度计并将其放入温度控制回路中。如果温度计过大，可用剪刀裁剪至适合较小管路的尺寸。在回路中加入5 mL室温的去离子水。</li>
		<li>闭合环路，并确认环路、张力带和支架是否安装到位。</li>
		<li>将转速设为30转每分钟（rpm），旋转3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于测试环路闭合不当（间隙）影响的环路组装
	<ol>
		<li>按照2.2节所述方法制备四个环状结构（polyPVC）。</li>
		<li>用张力带正确闭合其中两个环，确保管端之间无任何间隙。</li>
		<li>对于另外两个环，按照 2.2.3 中所述，将开口端插入较粗的导管中，但在环的末端之间保留 1–2 mm 的间隙。这些环无需使用张力带。图1D).</li>
		<li>按照2.2.7和2.2.11节所述，准备一个温度控制回路。</li>
		<li>按照2.2.10节所述，用血液充满所有环状结构。</li>
		<li>将转速设为30 rpm，旋转3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支架测试用环形组件
	<ol>
		<li>按照2.2节及后续步骤所述，制备四个环状结构。 
		注意：为了评估支架的血液相容性，应首先测试导管材料本身的生物相容性，以避免掩盖细胞活化现象。若缺乏相关数据，可按照2.2节所述方法对导管材料单独进行测试。此外，支架适用的直径范围（参见制造商说明）应与导管材料的内径相匹配。</li>
		<li>打开两个环扣，将试管从张力带系统中取出。</li>
		<li>根据制造商的说明，将支架插入管子的中部。</li>
		<li>使用另外两个无支架的环作为对照。按照2.2.10节所述，将所有环充满血液。</li>
		<li>将转速设为30 rpm，旋转3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>温度控制
	<ol>
		<li>在旋转停止后的任意时间内，可通过温度控制回路内的温度计读取环路中血液的温度。读取温度时，应先停止旋转，然后立即读取温度计所示的温度值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 血液样本处理
<ol>
	<li>旋转后，将环管在架子上直立静置 2 分钟，使血液积聚在环管底部，打开环管时避免溢出。</li>
	<li>检查残留血液的静置状态：如果血液发生凝固，则怀疑抗凝不充分。此时应重复实验，最好更换另一位献血者。</li>
	<li>小心将环管从架子上取出，打开连接器，让血液流入一个 10 mL 玻璃烧杯中。</li>
	<li>将平行运行的管路中的血液合并。</li>
	<li>按照 1.5 和 1.6 所述方法，从同一献血者采集新鲜血液用于基线分析。</li>
	<li>枸橼酸钠抗凝血的采集
	<ol>
		<li>采集枸橼酸钠抗凝血时，从已有的枸橼酸钠管中收集溶液，向四个 1.5 mL 离心管中每管加入 111 µL 枸橼酸钠溶液，使最终枸橼酸钠浓度为 3.2%。</li>
		<li>按照 1.6 和 3.3 所述方法，向每管中加入 1 mL 来自玻璃烧杯的血液。</li>
		<li>将血液置于室温保存，并按照 12 所述用于流式细胞术（FACS）分析。 
		注意：若需根据不同的实验设置调整环管长度，应根据所需检测项目数量合理规划分装体积。建议在正式实验前使用新鲜血液完成所有必要检测，以确保环管中的血量足以满足全部检测需求。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血及血浆样本的采集
	<ol>
		<li>从每个含有血液的玻璃烧杯（见 1.6 和 3.3）中转移 4.5 mL 血液至一个 5 mL EDTA 管中。每个 10 mL 玻璃烧杯中的血液需分装至两个 EDTA 管。</li>
		<li>轻轻混匀血液，并将其置于冰上保存。</li>
		<li>将 2 mL 血液转移至一个 2 mL 带锁离心管中，用于血细胞计数和游离血红蛋白测定，方法见 5 和 6。</li>
		<li>将剩余血液在 3,500 x g 条件下离心 20 分钟。</li>
		<li>小心收集上清液中的血浆，以每份 500 µL 分装，并立即在 -80 °C 冻存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 扫描电子显微镜与µCT图像
<ol>
	<li>血液样本处理后，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）分别冲洗按2.3步骤制备的已清空的环状工具。</li>
	<li>用手术刀仔细从每根管子的两端各切下一段1 cm长的样品。</li>
	<li>4 °C 条件下，在2%戊二醛溶液中将样品孵育过夜。 
	警告：吸入醛类蒸气可能引起鼻部症状，如流鼻涕或持续性鼻塞，以及呼吸道刺激；皮肤接触可导致皮炎。操作醛类物质时应在通风橱中进行，并佩戴手套、防护服和安全护目镜。</li>
	<li>用 PBS 冲洗样品（3 次）。</li>
	<li>配制1%的四氧化锇（OsO₄）溶液4) 加入去离子水中，在室温下孵育样品15分钟。 
	警告：OsO₄4 是一种强氧化剂，可通过光照被还原。为避免在制备过程中发生还原反应，请将 OsO₄ 储存于避光条件下。4 在棕色玻璃瓶中。OsO4 具有高度挥发性，其蒸气对眼睛、鼻子和喉咙有毒。操作时务必在通风橱中进行，并佩戴手套和防护服，确保身体任何部位均不接触OsO₄。4请查阅您所在机构关于废弃物处理与储存的相关规定。通常情况下，OsO₄4 可储存数月，但需使用带聚四氟乙烯衬垫的特殊玻璃瓶并置于干燥器中，因为OsO₄4 在有泄漏烟雾存在的情况下，可能会使冰箱的内表面及其内容物变色。</li>
	<li>取出样品，转移至新的15 mL离心管中，用PBS洗涤3次。</li>
	<li>配制一系列不同浓度的乙醇溶液（25%、50%、75%、95%、100%）</li>
	<li>在乙醇中脱水：分别在25%、50%、75%和90%乙醇中各孵育20分钟，然后在100%乙醇中孵育30分钟。</li>
	<li>从100%乙醇中取出样品，在室温下静置过夜晾干。</li>
	<li>在扫描电子显微镜下以5 kV的加速电压观察样品，并使用X射线µCT扫描仪进行检测。</li>
</ol>
5. 血细胞计数
<ol>
	<li>取 2 mL 按照 3.7.3 节所述方法获得的 EDTA 抗凝血。</li>
	<li>将试管插入全自动血液分析仪，并按照制造商的说明进行操作。</li>
</ol>
6. 血浆中游离血红蛋白（fHb）的测定
<ol>
	<li>按照3.7.5节所述方法获取各条件下的血浆样本，并解冻一份。解冻后置于冰上保存。 
	注意：冷冻血浆样本必须在37 °C水浴中解冻，并立即转移至含有少量水的冰上以降低温度。此步骤至关重要，可避免解冻过程中血液成分被激活。</li>
	<li>使用游离血红蛋白（fHb）试剂，并遵循制造商提供的操作说明。打开后避免污染，并防止试剂暴露于直射光（如阳光、紫外光）下。</li>
	<li>采用1:5稀释比例的加样方案（参见制造商说明书）。</li>
	<li>在一支1.6 mL半微量比色皿中加入1000 µL血红蛋白试剂，用于测定空白值。</li>
	<li>在另一支半微量比色皿中加入1000 µL血红蛋白试剂和250 µL血浆样本。</li>
	<li>通过反复吸取反应混合液并彻底冲洗移液器的方式混匀两个比色皿中的内容物，室温下孵育至少3分钟。</li>
	<li>以fHb试剂为空白对照，测定样本在540 nm与680 nm处的吸光度差值（E）。计算样本中fHb浓度（mmol/L）：E540－E680 × 0.452。</li>
</ol>
7. FPA 的测定
<ol>
	<li>按照3.7.5节所述方法获取各条件下的血浆样本，将其解冻后置于冰上保存。</li>
	<li>使用FPA ELISA试剂盒，并按照生产商提供的说明书操作。</li>
</ol>
8. sC5b9 的测定
<ol>
	<li>按照3.7.5节所述方法获取各条件下的血浆样本，解冻后置于冰上保存。</li>
	<li>使用sC5b-9 ELISA试剂盒，并按照制造商说明书操作。</li>
</ol>
9. 中性粒细胞的测定
<ol>
	<li>按照3.7.5节所述方法获取各条件下的血浆样本，将其解冻后置于冰上保存。</li>
	<li>使用PMN-弹性蛋白酶ELISA试剂盒，并按照制造商提供的说明书操作。</li>
</ol>
10. TNF 的测定
<ol>
	<li>进行ELISA实验前一天必须包被微孔板。包被时，向所有孔中加入100 µL捕获抗体溶液，密封微孔板，并在2 °C–8 °C条件下过夜孵育。</li>
	<li>将3.7.5节所述各条件下获得的一个血浆样本解冻，解冻后置于冰上保存。</li>
	<li>使用TNF ELISA试剂盒，并按照制造商的说明进行操作。</li>
</ol>
11. IL-6 的测定
<ol>
	<li>微量滴定板必须在实验前一天包被捕获抗体。包被时，向试剂盒提供的微量滴定板所有孔中各加入 100 µL 捕获抗体溶液，密封后于 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>将按照 3.7.5 节所述方法获得的各条件下血浆样本解冻，并在解冻后置于冰上保存。</li>
	<li>使用 IL-6 ELISA 试剂盒，并按照制造商说明书操作。</li>
</ol>
12. FACS 分析
<ol>
	<li>通过将10 mL胎牛血清和2 mL EDTA溶液（0.5 M）加入488 mL的1×PBS中，配制500 mL FACS缓冲液。FACS缓冲液可在4°C下保存4周。</li>
	<li>每次染色步骤（单核细胞-血小板聚集体（MPA）、血小板活化（PA）、白细胞整合素（LI））使用100 μL柠檬酸钠抗凝血（见3.6.3）。</li>
	<li>将每个样本的100 μL血液移入5 mL FACS管中。从每个样本准备3个管，分别标记为MPA（单核细胞-血小板聚集体）panel、PA（血小板聚集体）panel和LI（白细胞整合素）panel，用于抗体染色。</li>
	<li>将剩余4个样本的血液混合至一个5 mL FACS管中。此混合样本用于未染色对照和荧光减一（FMO）对照。</li>
	<li>通过将100 µL混合血液样本加入6个FACS管中，每管100 µL。标记其中3管为未染色对照，另3管分别标记为FMO-CD41、FMO-CD62P和FMO-CD162。</li>
	<li>向每管加入100 µL 4%多聚甲醛溶液，在室温避光条件下孵育15分钟。 
	注意：多聚甲醛对皮肤和眼睛有毒，吸入后可引起严重肺部刺激，长期暴露可能导致肺损伤。此外，其被归类为致癌物和生殖毒性物质。操作时务必佩戴手套和护目镜，并在通风橱内进行。</li>
	<li>向每管加入1 mL洗涤缓冲液，在287&#160;x g条件下离心5分钟。弃去上清液，并重复洗涤步骤两次。</li>
	<li>进行红细胞（RBC）裂解时，向每管加入1 mL 1×红细胞裂解缓冲液（将10×红细胞裂解缓冲液用去离子水稀释），通过缓慢吹打混匀，并在室温避光条件下孵育5分钟。</li>
	<li>准备用于单染的补偿微珠：向1 mL FACS缓冲液中加入每种阳性与阴性微珠各4滴，充分涡旋混匀后，取100 µL微珠溶液加入一个5 mL FACS管中。</li>
	<li>准备4个含微珠的管，分别标记为CD14-FITC、CD41-BV421、CD45-APC和CD62P-PE。向每管加入1 mL FACS缓冲液，在287&#160;x g条件下离心5分钟，弃去上清液后置于冰上保存。</li>
	<li>完成红细胞裂解后，向每管加入1 mL FACS缓冲液，按步骤12.7所述进行洗涤，弃去上清液。</li>
	<li>配制抗体混合液：
	<ol>
		<li>MPA panel：将4 µL CD45-APC、4 µL CD14-FITC和4 µL CD41-BV421加入388 µL FACS缓冲液中。</li>
		<li>PA panel：将1.6 µL CD41-BV421和12 µL CD62P-PE加入386.4 µL FACS缓冲液中。</li>
		<li>LI panel：将4 µL CD45-APC和8 µL CD162-BV421加入388 µL FACS缓冲液中。置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制单染抗体：将CD14-FITC、CD41-BV421和CD45-APC各0.5 µL分别加入499.5 µL FACS缓冲液中；将CD62P-PE 0.3 µL加入499.7 µL FACS缓冲液中。置于冰上保存。</li>
	<li>配制FMO对照：（i）MPA panel（FMO-CD41）：将1 µL CD14-FITC抗体和1 µL CD45-APC抗体加入98 µL FACS缓冲液中；（ii）PA panel（FMO-CD62P）：将0.4 µL CD41-BV421加入99.6 µL FACS缓冲液中；（iii）LI panel（FMO-CD162）：将1 µL CD45-APC加入99 µL FACS缓冲液中。FMO对照置于冰上保存。</li>
	<li>涡旋混匀抗体混合液，并按步骤12.12配制的抗体混合液，每种取100 µL分别加入对应标记的管（MPA、PA和LI panel）中（见步骤12.3），通过上下吹打轻轻混匀。避光室温孵育。</li>
	<li>涡旋混匀单染抗体稀释液，并按步骤12.13配制的单染抗体稀释液，每种取100 µL分别加入对应标记的微珠管中（见步骤12.7），通过上下吹打轻轻混匀。避光室温孵育。</li>
	<li>涡旋混匀FMO抗体混合液，并按步骤12.14配制的每种FMO-1抗体混合液，取100 µL分别加入对应标记的管（FMO对照）中（见步骤12.5），通过上下吹打轻轻混匀。避光室温孵育。</li>
	<li>将所有加有抗体的管在室温避光条件下孵育30分钟。</li>
	<li>取用于未染色对照的三个管（见步骤12.4），将沉淀重悬于250 µL FACS缓冲液中，置于冰上保存。</li>
	<li>孵育结束后，除未染色对照管外，其余各管按步骤12.7所述用FACS缓冲液洗涤一次。将沉淀重悬于250 µL FACS缓冲液中，并上流式细胞仪检测。</li>
	<li>在FACS软件中，使用未染色细胞设定阴性对照，使用补偿微珠设定阳性对照。此外，使用FMO对照优化设门策略，其中FMO-CD41用于MPA panel，FMO-CD62P用于PA panel，FMO-CD162用于LI panel。</li>
	<li>每管FACS检测采集约0.5 × 106 - 0.25 × 106个事件。保存数据并使用分析软件（版本9.9.6）进行分析。</li>
</ol>

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资助方 [ebo kunze industriedesign，德国诺芬登特尔大街17号，邮编72639] 向本文作者 [Max Wacker] 提供了实验耗材和出版费用形式的资金支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写方面未发挥任何其他作用。

本研究结果表明，所提出的体外血液动力学回路模型为依据ISO 10993-4标准测试医疗器械的体外血液相容性提供了一种可靠的方法。
实验方案中的关键步骤包括采血及用血液填充试管，应避免过强的负压或剧烈震荡，以防操作过程中激活血液成分。此外，血浆样本在采集后应立即冷冻，并在解冻后始终保持在冰上，因为长时间置于室温下可能干扰补体系统和凝血系统的活性。
由于该模型与其他体外模型相比各有优缺点，因此在设计实验时必须考虑多个因素。
首先，环路的长度和直径可根据不同的实验装置进行调整。如果实验装置中包含内径不同的对比管，则应注意，管径的差异将导致不同的剪切力，从而影响凝血和补体级联反应7。其次，本实验中设定的转速为30 rpm，这将产生约25 cm/s的血流速度，与人体冠状动脉旁路移植术中的血流速度相当25。由环路旋转产生的应变率是引发血液成分（包括细胞和无细胞蛋白）生化级联反应的主要参数。但由于血液是一种非牛顿流体，应变率还会受到管路曲率，即闭合为环状的管段长度的影响10。每当改变转速或环路尺寸时，都必须注意应变率与转速之间的关系并非线性。截至目前，转速与应变率之间的关系尚未得到充分研究，仍需进一步研究来阐明这些特定参数之间的关系10,26,27。然而，基于层流边界层模型，在给定管径为5 mm、流速为25 cm/s的条件下，当血液密度估计为1060 kg·m-3、运动黏度设为0.0025 pascal·s时，对壁面剪切应力（WSS）的粗略估算表明，在距管壁1.00–0.01 mm范围内，其值约为2.20–22.00 pascal28,29。有趣的是，对人类冠状动脉弯曲处血流动力学的更详细计算分析也显示，在血流速度、密度和黏度等参数大致相当的情况下，WSS值介于11.33至16.77 pascal之间30。
除了这一局限性之外，所介绍的环路模型是一个无压力系统，无法模拟人体血管系统中的血管内血压比例。
下一个重要的局限性是血液在回路内与空气接触，这会带来额外的干扰。这种血液-空气接触受两个参数影响：管路材料的透气性，以及在用血液填充回路时空气在回路内的滞留情况。每种管路材料都具有一定的气体渗透性，可能导致管内气体浓度发生显著变化。尽管一些作者指出，气体渗透性对血液成分激活的影响尚不明确31，但已知血液凝固系统的功能对pH值变化高度敏感，而CO2的扩散可能引起pH偏移32,33,34。本研究在室内空气条件下测试了血液灌注管路的生物相容性，该条件可模拟体外血液灌注的临床场景。为进一步优化本模型，可将整个系统置于CO2培养箱中孵育，并在孵育前后进行血液pH值验证，这可能有助于进一步标准化该模型。
此外，循环回路内部的血液-空气界面可能导致血浆蛋白和血液细胞组分的激活35,36。采用滚柱泵驱动且管路内无空气的装置可避免血液-空气界面问题，但与本研究中所介绍的循环模型相比，这类装置必然会对血细胞造成损伤，并显著升高血红蛋白水平；而血浆中的血红蛋白可能干扰ELISA检测中分析物的灵敏度16。在本研究中，我们已证实，当使用肝素涂层PVC管等生物相容性材料时，该循环模型本身的溶血效应极低。因此，该模型一方面相较于泵驱动模型不会造成过度的细胞损伤，但另一方面由于血液与空气接触仍会引发血浆蛋白的激活。值得注意的是，van Oeveren 等人开发了一种基于球阀的循环模型，可避免回路内部存在空气16。这种模型作为本研究中所展示循环模型的一种有前景的替代方案，可能克服血液-空气界面的问题；然而，与本研究中的模型相比，基于球阀的循环模型仍表现出更高的血小板黏附水平。
关于静态对照，需要注意的是，已有研究表明玻璃本身是凝血系统的一种强效激活剂37。然而，在本实验设置中，与采血后即刻的基线水平相比，玻璃烧杯中的孵育（静态对照）并未导致宿主细胞的过度激活或凝血系统的显著激活。因此，如果静态对照显示出较高的激活水平，建议可考虑使用例如聚丙烯管。
无论是基于回路的模型还是泵驱动的模型，这些体外模型完全缺乏由完整内皮层所提供的真实生物学相互作用，而内皮层是理想的血液接触表面。当测试支架等医疗器械时，这一问题背后的原理尤为明显：在与血液成分相互作用时，内皮层的存在可能导致不同的结果，例如在激活状态和血浆蛋白反应方面。这表明，所有讨论过的模拟循环系统的体外系统均存在一个主要缺陷。因此，为克服这一问题，目前人们正对完全覆盖有内皮层的新型微流控系统产生极大兴趣；然而，与本文介绍的回路模型相比，这些系统在容纳较大量的血液以及实现较高流速方面仍然受限38,39
因此，我们得出结论：钱德勒循环模型仍然是心血管研究领域内用于开展血管医疗器械血液生物相容性标准化测试的一种可靠模型。

医疗器械的血液相容性测试是开发新型器械（如血管支架或体外膜肺氧合用灌注管）过程中的关键步骤。迄今为止，动物模型仍被视为在将医疗器械应用于人体之前完成测试流程的标准工具。因此，有必要寻找替代性的体外模型，以进一步减少对动物的实验。在本研究中，我们探索了一种微型体外血液动力学回路模型。本方法的目的是依据 ISO 10993-4 标准，测试医疗器械的体外血液相容性。
ISO 10993-4 标准规定了在血液样本上需检测的一系列标准化临床参数1。简而言之，这些参数包括血栓形成（血小板聚集和计数）、凝血功能（纤维蛋白肽 A，FPA）、血液学分析（全血细胞计数）、溶血指数（游离血浆血红蛋白）以及补体系统（终末补体复合物，sC5b9）。此外，还可检测其他一些指标，例如中性粒细胞多形核弹性蛋白酶（PMN）、白细胞介素 6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF），以反映白细胞的活化状态。为了测定并定量血液血浆中循环的游离蛋白，双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种传统且最可靠的方法2,3。同样，通过流式细胞术（FACS）检测细胞表面分子的表达情况，可对宿主细胞（如白细胞）的表型和活化状态进行定量分析；该方法基于单细胞悬液进行检测，荧光标记的特异性抗体与靶细胞表面分子结合4。ISO 10993-4 标准还推荐使用扫描电子显微镜（SEM）来评估受试材料表面的血栓形成情况1。该方法可结合X射线显微断层扫描（μCT），对血栓的结构（如厚度、大小及在三维重建图像中的位置）进行分析5。
采用该体外血流动力学模型的原理在于，通过了解参与初级止血的血小板等血液成分的基本生理动力学，以及白细胞与不同类型血管器械之间的相互作用，从而筛选出性能最佳且生物相容性良好的医疗器械。这类体外系统需求很高，因为它们能够减少对动物实验的依赖。
本文所介绍的循环模型满足上述要求。该模型最早由 A.B. Chandler 于 1958 年提出，用于制备血栓，因此也被称为 Chandler 循环模型6。迄今为止，该模型已在一系列实验和改进中被用于研究医疗器械的血液相容性7,8,9,10,11,12,13,14。该模型由聚合物管组成，管内部分填充血液并形成可重新封闭的环路。这些环路在温度可控的水浴中旋转，以模拟血管内的血流条件及其血液流变学效应。已有研究描述了其他替代方法，例如泵驱动模型，或在环路内使用机械球阀以在聚合物管中诱导血流的模型15,16。然而，本文所介绍方法的主要优势在于，其施加于血细胞和蛋白质的机械力较低，可避免溶血，且血液与连接件之间无接触，从而防止流动紊乱及血液成分的激活。环路内主要的激活因素仅为测试材料本身以及管内截留的空气。这有助于最大限度地减少测量误差来源，提高实验的可重复性，尽管血液-空气界面可能导致蛋白质变性17。此外，该模型允许在无长度或尺寸限制的情况下研究多种导管材料和支架直径，因而可使用不同长度和内径的导管。同时，也可用于研究环路封闭不严密或血液暴露于未涂层导管表面时对宿主血液相容性的影响。该体外血流动力学循环模型的其他类似医学应用还包括：可用于研究免疫治疗药物在临床前开发阶段或首次人体 I 期临床试验前个体化药物安全性筛查过程中与血液成分的相互作用，或用于制备可用于后续实验的血栓材料18,19,20。
本研究描述了一种用于检测灌注管和/或支架血液相容性的详细方案。此处比较了未涂层与涂层PVC管（hepPVC：肝素涂层；polyPVC：生物活性聚合物涂层）。与未涂层管相比，两种涂层管均表现出血小板活化程度降低，但凝血系统活化（FPA）更高。本研究所用的hepPVC管通过共价结合肝素进行修饰，以提高其抗血栓性能21，并已在循环模型中用于优化和表征不同参数22。本研究所用的polyPVC管为临床上用于体外血液灌注的市售产品，其表面涂有肝素聚合物以降低血栓形成倾向23。在某些临床应用中，甚至仍会使用未涂层PVC管。因此，本研究将乳胶管作为阳性对照组纳入，结果显示其引起血小板、凝血系统以及IL-6、TNF和中性粒细胞弹性蛋白酶等可溶性因子的显著活化。当模拟循环闭合不当时，观察到血栓形成。与基线条件相比，这导致凝血系统、补体系统、白细胞和血小板的活化。此外，血液接触本研究所用支架材料（裸金属镍钛合金支架，表面覆盖碳掺杂膨体聚四氟乙烯）后，中性粒细胞弹性蛋白酶水平升高，提示血小板和白细胞活化增强。总体而言，除乳胶管外，所有测试的血管装置在本模型中均未引起溶血，其溶血水平与基线或静态条件相当；而乳胶管则表现出明显的红细胞（RBC）溶血。此外，这些灌注管可通过成像或组织学方法进行检测。尽管组织学评估具有可行性，但本研究主要采用ELISA和流式细胞术完成实验，从而使多个实验室均可基于本研究所提出模型开展相关实验。因此，该方法是一种可行的技术，可用于依据ISO 10993-4标准评估血管医疗器械的血液生物相容性。此外，该方法还可广泛应用于在流动条件下模拟体内环境，以检测血液与材料之间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>5 ml 管，K3 EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>32332</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ig，&amp;kappa;/阴性对照补偿微粒套装</td><td>Becton Dickinson BioSciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗人 CD45 抗体</td><td>BioLegend</td><td>368512</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa II 细胞分析仪</td><td>Becton Dickinson</td><td>647465</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 枸橼酸钠管</td><td>Becton Dickinson</td><td>369714</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 一次性持针器</td><td>Becton Dickinson</td><td>364815</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok 蝶形套管 21 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>367282</td><td></td></tr><tr><td>ROTILABO 短型玻璃烧杯 10 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>X686.1</td><td></td></tr><tr><td>ROTILABO 短型玻璃烧杯 50 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>X688.1</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 抗人 CD162 抗体</td><td>BioLegend</td><td>328808</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 抗人 CD41 抗体</td><td>BioLegend</td><td>303730</td><td></td></tr><tr><td>离心机 ROTINA 420 | 420 R</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>4701 | 4706</td><td></td></tr><tr><td>离心管，50 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>CHC 超级改性，5 mm PVC 管</td><td>Corline Sweden</td><td>1807-148</td><td>简称 hepPVC 管</td></tr><tr><td>圆形精密切割器</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td><td>CLS 007-20</td><td></td></tr><tr><td>闭合装置（含张力带）</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td><td>CLS 008-20</td><td></td></tr><tr><td>电工胶带 Scotch Super 33+</td><td>VWR</td><td>MMMA331933</td><td></td></tr><tr><td>ELISA MAX Deluxe 人 IL-6 检测试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>430504</td><td></td></tr><tr><td>ELISA MAX Deluxe 人 TNF-α 检测试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>430204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus 单通道移液器，含 epT.I.P.S. 盒，0.1 &amp;ndash; 2.5 &amp;micro;L，灰色</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus 单通道移液器，含 epT.I.P.S. 盒，0.5 &amp;ndash; 10 &amp;micro;L，灰色</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus 单通道移液器，含 epT.I.P.S. 盒，10 &amp;ndash; 100 &amp;micro;L，黄色</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus 单通道移液器，含 epT.I.P.S. 盒，100 &amp;ndash; 1,000 &amp;micro;L，蓝色</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus 单通道移液器，含 epT.I.P.S. 盒，20 &amp;ndash; 200 &amp;micro;L，黄色</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus 单通道移液器，含 epT.I.P.S. 样品袋，0.5 &amp;ndash; 5 mL，紫色</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000071</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管，聚苯乙烯，5.0 ml 圆底</td><td>Corning BV</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 Gold Plus</td><td>Bio-Sell</td><td>FBS.GP.0500</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗人 CD14 抗体</td><td>BioLegend</td><td>367116</td><td></td></tr><tr><td>Fluency plus 支架 13.5 x 60 mm</td><td>Angiomed GmbH &amp; Co</td><td>FVM14060</td><td></td></tr><tr><td>游离血红蛋白 fHb 试剂</td><td>Bioanalytics GmbH</td><td>004001-0250</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS 片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Vasco 乳胶手套，白色，L 码</td><td>B. Braun Deutschland GmbH &amp; Co.KG</td><td>9208437</td><td></td></tr><tr><td>Vasco 乳胶手套，白色，M 码</td><td>B. Braun Deutschland GmbH &amp; Co.KG</td><td>9208429</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛 25% 水溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>肝素，25,000 IU/5 ml</td><td>Rotexmedica, Trittau, Germany</td><td>PZN 3862340</td><td></td></tr><tr><td>人纤维蛋白肽 A (FPA) ELISA 试剂盒</td><td>H&amp;ouml;lzel Diagnostika</td><td>abx253234</td><td></td></tr><tr><td>Kodan 消毒液 forte 无色</td><td>Sch&amp;uuml;lke &amp; Mayr GmbH</td><td>104012</td><td></td></tr><tr><td>乳胶管，内径 5 mm</td><td>Laborhandel24 GmbH</td><td>305 0507</td><td></td></tr><tr><td>环形支架</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td><td>CLS 009-20</td><td></td></tr><tr><td>Medimex 静脉压脉带 classic</td><td>ROESER Medical GmbH</td><td>310005</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 读板仪 Infinite 200 Pro M Plex</td><td>Tecan</td><td>TEC006418I</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 振荡器 PMS-1000i</td><td>VWR</td><td>444-0041</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Metric 无邻苯二甲酸盐 PVC 管，内径 5 mm</td><td>VWR</td><td>NALG8703-0508</td><td>简称 PVC 管</td></tr><tr><td>NexTemp (标准) 一次性临床体温计</td><td>Medical Indicators</td><td>2112-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp ELISA 板，未包被</td><td>BioLegend</td><td>423501</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>10256970</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛溶液，4% PBS 配制</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗人 CD16 抗体</td><td>BioLegend</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗人 CD62P (P-选择素) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>304906</td><td></td></tr><tr><td>移液器控制器，pipetus</td><td>VWR</td><td>612-1874</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml</td><td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &amp; Co. KG</td><td>5186480</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 epT.I.P.S. 标准型 0.1 - 10&amp;micro;l</td><td>Th. Geyer GmbH &amp; Co. KG</td><td>9409410</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 epT.I.P.S. 标准型 2 - 200&amp;micro;l</td><td>Th. Geyer GmbH &amp; Co. KG</td><td>0030 000.870</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 epT.I.P.S. 标准型 50 - 1000&amp;micro;l 蓝色</td><td>Th. Geyer GmbH &amp; Co. KG</td><td>0030 000.919</td><td></td></tr><tr><td>PMN（中性粒细胞）弹性蛋白酶人 ELISA 试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>BMS269</td><td></td></tr><tr><td>ROTILABO combi 探针架</td><td>CARL ROTH</td><td>K082.1</td><td></td></tr><tr><td>旋转装置支架（12 个插槽，3/8''，插槽宽度可调）</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td><td>CLS 011-20</td><td></td></tr><tr><td>RBC 裂解缓冲液 (10X)</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>VWR</td><td>613-1184</td><td></td></tr><tr><td>旋转装置</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td><td>CLS 010-20</td><td></td></tr><tr><td>安全锁微型离心管 0.5 ml</td><td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &amp; Co. KG</td><td>5409320</td><td></td></tr><tr><td>安全锁微型离心管 1.5 ml</td><td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &amp; Co. KG</td><td>5409331</td><td></td></tr><tr><td>sc5b9 人 ELISA 试剂盒</td><td>TECOmedicalGroup</td><td>A029</td><td></td></tr><tr><td>10 号手术刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜 XL30 ESEM-FEG</td><td>Philips</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>ROTILABO 透明玻璃螺口瓶，1000 ml，GL 45</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>X715.1</td><td></td></tr><tr><td>ROTILABO 透明玻璃螺口瓶，500 ml，GL 45</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>X714.1</td><td></td></tr><tr><td>半微量比色皿 1.6 ml</td><td>Sarstedt</td><td>67.746</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管 10.0 ml</td><td>Corning BV</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，25.0 ml</td><td>Corning BV</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，5.0 ml</td><td>Corning BV</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管，内径 8 mm，外径 12 mm</td><td>VWR</td><td>BURK8803-0812</td><td></td></tr><tr><td>Sprout 微型离心机</td><td>Biozym</td><td>552034</td><td></td></tr><tr><td>TMB 底物终止液</td><td>BioLegend</td><td>77316</td><td></td></tr><tr><td>棉签，无菌</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32055</td><td></td></tr><tr><td>注射器，10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300296</td><td></td></tr><tr><td>温控水浴槽</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td><td>CLS 020-20</td><td></td></tr><tr><td>叔丁醇，99.5%，特纯，ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000730</td><td></td></tr><tr><td>TMB 底物试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>421101</td><td></td></tr><tr><td>Trillium PVC 管，内径 5 mm</td><td>Medtronic</td><td>161100107100103</td><td>简称 polyPVC 管</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0250</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 分光光度计 Lambda 2</td><td>Perkin Elmer</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Vornado Mini Vortexer 涡旋振荡器</td><td>Biozym</td><td>55BV101-B-E</td><td></td></tr><tr><td>XN-3000 工作站血液分析仪</td><td>Sysmex Europe</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-CT Phoenix Nanotom S</td><td>GE Sensing &amp; Inspection, Wunstorf, Germany</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究血管医疗器械血液相容性及宿主细胞激活的体外血流动力学回路模型

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

本研究比较了内径为5 mm、由聚氯乙烯（PVC）制成并涂覆不同生物活性偶联物的导管与未涂层PVC导管、乳胶导管以及置于PVC导管内部用于血管内应用的支架之间的血液相容性。血液相容性评估采用ISO 10993-4标准推荐的体外血流动力学回路模型。将导管切割成相同长度的节段，并闭合形成回路，确保接头处无任何间隙，随后注入人血，并在37 °C水浴中旋转3小时。之后收集导管内的血液，用于分析全血细胞计数、溶血（游离血浆血红蛋白）、补体系统（sC5b-9）、凝血系统（纤维蛋白肽A）以及白细胞活化（多形核弹性蛋白酶、肿瘤坏死因子和白细胞介素-6）。通过流式细胞术检测宿主细胞活化情况，包括血小板活化、白细胞整合素状态以及单核细胞-血小板聚集体。采用X射线显微断层扫描和扫描电子显微镜观察回路闭合不严密的影响，结果显示接头处存在血栓形成。乳胶导管对血液的血浆和细胞成分均表现出最强的活化作用，提示其血液相容性最差，其次为支架组和未涂层PVC导管。涂覆型PVC导管未显示出血小板活化水平的显著降低，但与未涂层PVC导管相比，补体系统和凝血级联反应的活化程度更高。该回路模型本身未引起细胞或可溶性因子的活化，且溶血水平较低。因此，所介绍的体外血流动力学回路模型可避免机械力对血成分的过度激活，是一种用于研究供体血液与血管医疗器械之间体外相互作用的有效方法。

除流式细胞图（FACS图）外，所有展示的数据均使用统计学软件进行分析，流式细胞图则使用流式细胞术软件进行分析。
全血细胞计数分析显示，在所有测试条件下，红细胞参数之间无显著差异（图2）。然而，乳胶组的血小板和白细胞数量显著减少，表明乳胶的生物相容性极差。这一点在乳胶组游离血红蛋白水平升高上进一步得到印证，说明除乳胶组外，其他血管装置或实验条件均未引起明显的溶血现象（图2）。此外，涂层聚氯乙烯管（polyPVC 和 hepPVC）以及所测试的支架均未导致因血小板和白细胞减少而引发的血栓形成；而乳胶材料引起的血小板和白细胞损失最为严重，其次是未涂层的聚氯乙烯管，其呈下降趋势。
尽管所有测试的血管装置均导致凝血系统（FPA）和补体成分（sC5b-9）的活化程度升高，但与聚氯乙烯涂层（polyPVC）环相比，肝素化聚氯乙烯（hepPVC）环的FPA和sC5b-9水平呈现降低趋势（图3）。有趣的是，未涂层PVC环和Gap环的FPA水平低于polyPVC环，但差异未达到统计学显著性。然而，与基线和静态条件相比，乳胶环的FPA水平显著升高。
根据全血细胞计数结果，乳胶环显示出最高水平的TNF, IL-6 和中性粒细胞弹性蛋白酶（PMN elastase）图4），在TNF和IL-6水平上与其余各组相比达到统计学显著性图4A，B），而中性粒细胞弹性蛋白酶在静态和基线条件下图4C）。这些结果表明乳胶对白细胞具有强烈的激活作用。激活标志物的基线水平始终与静态条件下的水平相当，表明血液肝素化充分。
有趣的是，研究显示，对于存在间隙的环状结构，血小板和白细胞计数仅略有下降，凝血系统（FPA）和白细胞（PMN 弹性蛋白酶）呈中度激活状态；然而，若环状结构闭合不当，导致血流产生湍流，并使血液接触到未涂层的粗糙切割表面，则在接合处可观察到肉眼可见的血栓（图 1F）。微计算机断层扫描（µCT）和扫描电镜（SEM）图像清晰显示了血栓及其在整个接合面的分布情况；而当使用外部闭合装置将环状结构完全闭合、使环的末端之间无间隙时，未发现任何血栓形成（图 5）。
使用血小板特异性标记物 CD41 和血小板活化标记物 CD62P 对宿主血细胞进行染色后，通过流式细胞术分析的结果如图6A,B所示。其中，乳胶管组血小板表面CD62P的中位荧光强度（MFI）显著升高，其次为支架组；而肝素涂层的聚氯乙烯（polyPVC）管组血小板活化程度最低，表明polyPVC管具有抗血栓形成特性。此外，白细胞根据CD45和侧向散射光（SSC）的颗粒度特征被分为（i）粒细胞；（ii）单核细胞；以及（iii）淋巴细胞（图7），并检测了各白细胞亚群表面CD162+整合素的表达水平，该整合素已知可与血小板上的CD62P相互作用24。结果显示，乳胶环组中粒细胞和淋巴细胞上的整合素表达显著降低。该结果与乳胶环组白细胞总频率下降的现象一致（图2）。总体而言，单核细胞的整合素表达水平高于粒细胞和淋巴细胞，提示单核细胞更易与活化的血小板发生相互作用。为此，进一步通过CD14（单核细胞标记物）和CD41（血小板标记物）对血细胞进行染色，评估单核-血小板聚集体（MPA），以鉴定双阳性细胞，即CD14+CD41+ MPA（图8）。结果发现，支架组MPA上CD41的表达水平最高，其次为乳胶组，表明其形成MPA的倾向性更高，尽管乳胶环组中单核细胞频率较低（<1%）。
<img alt="用于流体流动分析的盘管流体动力学实验装置示意图序列" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：体外血流动力学回路模型及其改进的概述。（A）用于间隙实验的回路，配备外部回路闭合系统，使接头处无间隙。（B）由聚PVC涂层PVC管及内置支架构成的回路（箭头所示）。（C）由乳胶管制成的回路。（D）用于间隙实验但无外部回路闭合系统的回路，管端之间留有间隙（箭头所示）。（E）将回路置于水浴中的回路支架内，并灌注血液。（F）旋转后在接头处形成血栓并产生间隙（箭头所示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血细胞分析条形图；红细胞、血小板、白细胞、血红蛋白；比较图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：血细胞计数和血浆血红蛋白结果。（A）红细胞计数。（B）血小板计数。（F）白细胞计数。（D）游离血浆血红蛋白。结果表明乳胶的生物相容性较差，导致过度溶血。数据以平均值表示；误差线表示标准误（SEM）。n=1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较不同材料上纤维蛋白肽A和sC5b-9水平的柱状图；血液与聚合物相互作用分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：凝血系统与补体系统激活结果。（A）通过纤维蛋白肽A（FPA）水平测定的凝血系统激活；（B）通过sC5b-9水平测定的补体系统激活。尽管乳胶管显著升高了FPA水平，但所有测试材料均引起较强的补体激活。数据以均值表示，误差线表示标准误（SEM）。*p&lt;0.05，n=1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同材料和方法结果中细胞因子水平（TNF、IL-6、PMN 弹性蛋白酶）的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：白细胞活化标志物。 (A肿瘤坏死因子α（TNF）。B白细胞介素6（IL-6）C中性粒细胞弹性蛋白酶. 结果表明，由于所分析标志物水平升高，白细胞活化增强，随后是支架环，后者仅导致中性粒细胞弹性蛋白酶（PMN Elastase）水平升高，而TNF或IL-6水平未见升高。数据以均值表示，误差线表示标准误（SEM）。*p&lt;0.5；**p&lt;0.01，n=1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="三维断层扫描与扫描电镜分析环状结构。示意图与显微镜图像展示结构细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：环状结构拼接的成像 (A) µ计算机断层扫描（µCT）存在闭合不当（间隙）的环。红色区域指示血栓物质。B) 管腔面的示意图。矩形选区表示扫描电子显微镜（SEM）的观察区域C). (D) µCT 使用外部环闭合装置形成无间隙连接的环，以及（E）管腔表面的成像与观察。未发现血栓物质。F) ( 中矩形选区的 SEM 图像E未在切割表面发现血栓物质。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="血小板活化分析；流式细胞术散点图；CD62P MFI柱状图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：血小板活化（CD62P）的FACS图。（A）代表性FACS图（基础条件），显示血液中CD41+血小板。（B）图示不同类型的血管装置在静态室温（RT）和基线条件下，通过平均荧光强度（MFI）反映的血小板活化状态。数据条表示单次测量的数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图谱与柱状图；CD45细胞分析、粒细胞、单核细胞和淋巴细胞中的整合素状态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：白细胞整合素（CD162）的FACS图谱。（A）代表性FACS图谱（基础条件），显示血液中CD45+白细胞及其亚群；（B）柱状图显示不同类型血管装置条件下，白细胞CD162+整合素的平均荧光强度（MFI），并与静态和基线条件进行比较。数据条表示单次测量的结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用CD14/CD41标记物的流式细胞术分析图及样本数据的条形图显示MFI结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig08.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：血小板-单核细胞聚集体（CD41/CD14）的FACS图。（A）代表性FACS图（基础条件），显示血液单核细胞（CD45+/CD14+）、血小板（CD41+）以及单核细胞-血小板聚集体（CD41+/CD14+）的设门策略。（B）柱状图显示在不同血管装置条件下，与静态和基线条件相比，单核细胞-血小板聚集体上CD41+的平均荧光强度（MFI）。数据条表示单次测量的结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种标准化的体外血液动力学回路模型的实验方案。该模型可用于检测灌注管路或血管支架的血液相容性，以符合ISO（国际标准化组织）10993-4标准的要求。

在本研究中，对内径为5 mm、由聚氯乙烯（PVC）制成并涂覆不同生物活性物质的导管的血液相容性进行了评估。

该血流动力学循环模型可使研究人员在标准化条件下测试血管类器械（如灌注管路或支架）的体外血液相容性。该技术不会通过机械力对血液产生影响，从而避免因血液成分的内在激活而导致的误导性结果。在尝试进行实验之前，必须练习正确的机械部件组装、完美的回路闭合系统构建，以及缓慢地将血液加载到回路中。准备回路组装时，使用管子切割器在平坦表面上切割长度为250厘米、内径为5毫米的管路。然后将管子的开口端插入一段短的硅胶管中，该硅胶管的内径需与被测管路的外径相匹配，以形成回路形状。小心拧紧张力带连接器的锁紧螺钉，并调节闭合力，使两个弯曲部分之间无任何间隙。若锁紧螺钉已完全拧紧，但聚碳酸酯带的张力仍显得不足，无法闭合两个弯曲部分之间的间隙，则应打开锁紧系统，剪除张力带的几毫米长度。为制备支架环组件，打开其中两个环，将管材从张力带系统中取出。然后按照制造商的说明将支架插入管子的中部。当实验所需的环数制备完成后，将环固定在旋转装置的环架上，置于37摄氏度水浴外，并将环架连接到水浴内的旋转装置上。接下来，每采集两个环的血液，需准备一支10毫升注射器，每支注射器中加入150微升新鲜配制的肝素储备液，并使用21号蝶形针头轻柔地将血液收集到注射器中，注意避免因真空过大导致溶血或细胞活化。当所有血液收集完毕后，将血液转移至玻璃烧杯中，并使用5 mL血清移液管轻轻混匀血液与肝素。当获得均匀溶液后，将移液管尖端不完全插入管内的状态下，小心地向每个环状容器中加入5 mL血液。每个环状容器加满后立即封闭，并确认环状容器、张力带和支架均已妥善固定。然后以每分钟30转的速度旋转环状管3小时。旋转结束后，将环状管置于支架上静置2分钟，使血液积聚在环的底部，再小心打开连接器，将成对样本中的血液分别吸入各自的10毫升玻璃烧杯中。待所有血液收集完毕后，用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗每根管子，并用手术刀从每根管子的末端小心切割下一厘米长的样品。将样品在4°C条件下于2%戊二醛中过夜孵育，随后在室温下用1%四氧化锇孵育15分钟。四氧化锇孵育结束后，将样品依次用浓度递增的乙醇系列进行脱水处理，每个浓度脱水20分钟，最后在100%乙醇中脱水30分钟。100%乙醇孵育结束后，将样品在室温下干燥过夜，然后使用X射线显微CT扫描仪在5千伏加速电压下通过扫描电子显微镜对样品进行成像。用于血液样本的流式细胞术分析。将每个样本中的 100 微升血液转移至九个 5 毫升 FACS 管中的每一个管中，并通过每管加入 100 微升 4% 多聚甲醛，在室温下避光固定 15 分钟。洗涤后，每管中加入 1 毫升红细胞裂解缓冲液重悬各沉淀，在室温下避光孵育 5 分钟。孵育结束后，每管加入一毫升 PBS，通过离心洗涤样本，并将去上清后的样本置于冰上。为制备单染补偿微珠，分别向一毫升 FACS 缓冲液中加入四滴阳性微珠和四滴阴性微珠，涡旋振荡使微珠悬浮液均匀。将每种悬浮液各取 100 微升加入预先标记好的四或五个毫升 FACS 管中，并每管加入一毫升 FACS 缓冲液洗涤微珠。随后，向每管实验组和荧光减一对照管中加入100微升相应的涡旋抗体混合液，并轻轻混匀。室温避光孵育30分钟。孵育结束后，每份样品加入1毫升新鲜FACS缓冲液洗涤，并将沉淀重悬于每管250微升FACS缓冲液中。在按照标准方案通过流式细胞术分析细胞样品中的微珠之前，可通过微计算机断层扫描和扫描电子显微镜成像观察拼接的两个环路整个表面的血细胞分布情况，而在无间隙的闭合环路中未观察到血凝块。全血细胞计数分析显示，在任何测试条件下红细胞数量均无显著差异，然而，乳胶环组中的血小板和白细胞数量显著减少，游离血红蛋白数量显著增加，表明乳胶的生物相容性极差。尽管所有被测试的血管装置均会引起凝血系统和补体成分的活化程度升高，但与聚合物涂层的PVC环相比，肝素涂层的PVC环在两种活化指标上均呈现出降低的趋势。乳胶环的TNF、IL-6和中性粒细胞弹性蛋白酶水平最高，表明乳胶可强烈激活白细胞。从乳胶管中回收的CD41阳性血小板表现出极高的CD62P中位荧光强度，而粒细胞和淋巴细胞上的整合表达则显著降低。值得注意的是，乳胶管中单核细胞的整合表达水平较高，提示单核细胞与活化血小板之间存在相互作用。事实上，对单核细胞-血小板聚集体的染色显示，乳胶管及支架环中聚集体形成的倾向增加。尽管单核细胞在乳胶环中的出现频率有所降低。为避免血液成分的内在激活，确保乳胶环正确闭合并小心处理血液至关重要。因此，通过遵循此操作步骤，可分析同种异体蛋白或TRUCKs与炎症或药物研究中所用血液成分之间的相互作用。

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