Name: 在伊蚊中传播微孢子寄生虫Edhazardia aedis (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 了解在埃及伊蚊中培养微孢子寄生虫Edhazardia aedis的完整实验方案，包括孢子收获、定量及垂直传播技术。该方法为寄生虫生命周期研究提供标准化操作流程，垂直传播率达96%。

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我们感谢Spencer Blankenship在蚊虫饲养方面提供的帮助。同时感谢James N. Radl和M. Dominique Magistrado对本文手稿提出的宝贵意见。

1. 第0天
<ol>
	<li>将感染了 E. aedis 的 Ae. aegypti 蚊卵置于含有 1 L 去离子水（DI 水）的幼虫饲养盘中以孵化幼虫，并加入 50 mg 鱼食。 
	注意：在本文发表时，E. aedis 的实验室菌株仅可从正在积极研究该寄生虫的实验室获得，因为 E. aedis 不适合长期保存，且目前感染的蚊卵并未储存在任何资源库中。有意开展 E. aedis 相关研究的科研人员可联系通讯作者以申请获取感染蚊卵。 
	注意：&#160;通常无需大量孵化感染蚊卵；10 只感染 E. aedis 的 Ae. aegypti 幼虫已足够用于感染 ≥ 1000 只健康幼虫。 
	注意：&#160;本实验方案所有步骤中，蚊虫均饲养于以下环境条件：14 小时光照 / 10 小时黑暗的光周期，温度 27 °C，相对湿度 80%。</li>
</ol>
2. 第1天
<ol>
	<li>孵化后，将幼虫密度降低至每盘约100条幼虫，根据需要制备新培养盘（同样加入1 L去离子水）。</li>
	<li>向每盘中加入一块干燥的猫粮。在食物耗尽时补充，但不要过量投喂。每三天投喂一块猫粮（约200 mg）即可。 
	注意：根据具体的饲养条件调整投喂量（例如，若水体变浑浊或幼虫出现死亡，则减少投喂量；若幼虫发育严重延迟，则增加投喂量）。可采用不同于本方案推荐的其他喂养方案和/或饲养条件，但可能需要对本标准操作流程的时间安排进行相应调整。</li>
</ol>
3. 第4‒5天
<ol>
	<li>当被感染的幼虫处于3rd – 4th龄期时，在新的托盘中孵化健康/未感染的Ae. aegypti卵。</li>
	<li>以适当密度饲养，使健康的Ae. aegypti在48–72小时内发育至2nd – 3rd龄期。在我们的操作中，每升水中饲养200–300条幼虫，并提供充足食物（ad libitum），即可达到该效果。在多日内分批孵化健康卵，可确保在需要时幼虫处于正确的发育阶段。</li>
</ol>
4. 第7‒8天：水平传播
注意：对健康幼虫进行给药时 E. aedis 在感染的幼虫中单核孢子数量达到较高水平（1 x 10）之前，无法进行该操作4 – 1 × 106 每条幼虫。这一现象发生在第4阶段后期th 龄期阶段（图2).
<ol>
	<li>收获并定量单核孢子。
	<ol>
		<li>使用移液管（可能需要将管尖剪至更宽的直径）将10只感染的幼虫转移至1.5 mL 微离心管中。</li>
		<li>用移液管移除繁殖用水&#160;用移液器加入约1 mL洁净的去离子水洗涤一次，然后用移液器吸去洗涤水，再向10只幼虫中加入500 µL洁净的去离子水，使用研杵和机械匀浆器进行匀浆。</li>
		<li>使用血细胞计数板在400倍显微镜下对孢子进行计数。 
		注意：单核孢子可通过其明显的梨形（即梨状）来识别； 图2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剂量健康 埃及伊蚊 幼虫与 E. aedis
	<ol>
		<li>将1.2 g肝脏粉、0.8 g啤酒酵母与100 mL水混合，制备新鲜的幼虫食物悬液。 
		注意：食物若经过高压灭菌并在使用前于4 °C保存，则无需新鲜。</li>
		<li>转移 100 2nd – 3rd 幼虫龄期健康 埃及伊蚊 将幼虫放入150 mL烧杯或样品杯中。</li>
		<li>向每杯100条幼虫中加入5 × 104 – 1 × 105 孢子</li>
		<li>加入2 mL幼虫食物浆液，并用去离子水定容至100 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暴露12–24小时后，将暴露的幼虫转移至饲养盘中，并按照标准饲养方案饲养至成虫。16.</li>
</ol>
5. 监测与垂直传播
<ol>
	<li>监测给药后的幼虫化蛹情况，并在蛹形成后将其转移至饲养笼中的羽化杯内。成虫以蔗糖饲喂 随意摄取 （根据16,17）。羽化的成虫将被感染 E. aedis.</li>
	<li>血液饲喂成虫（按照16,17）并收集卵。垂直传播的 E. aedis 在此步骤中发生。 
	注意：如果在产卵完成后立即提供额外的血液餐，雌虫可在成虫出现（常为突然性的）高死亡率之前，至少再产一次卵。&#160;</li>
	<li>使用这些 埃及伊蚊 感染的卵 E. aedis 继续传代，从本方案的第1步开始。 
	注意：在适当条件下，卵子可保存 2 – 3 个月16.</li>
	<li>清洁所有接触过的材料 E. aedis 用10%漂白剂处理并高压灭菌（如可能），以防止污染。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们在此介绍 Hembree 和 Ryan 于 1982 年首次描述的方法8 用于饲养 E. aedis 微孢子虫在 埃及伊蚊 蚊子。该品系的 E. aedis 本研究中使用的样本源自 Stephen Hembree 于 1979 年在泰国进行的原始野外采集19该方法利用了在传播循环中自然发生的水平传播， E. aedis7, 以可控方式扩增寄生虫。对于不熟悉孢子形态、幼虫感染症状或缺乏多阶段饲养/接种操作协调经验的新手而言，该方法可能具有挑战性。我们希望，随本方案提供的视觉辅助材料能够降低研究人员开展寄生虫培养的入门门槛 E. aedis
我们扩增了 E. aedis 在 埃及伊蚊 如上所述，并对子代寄生成功率进行了量化。简言之，我们孵化了 E. aedis 感染的 埃及伊蚊 卵，饲养至4th 龄期，收集单核细胞 E. aedis 从感染的幼虫中收集孢子。随后，我们通过口服摄入的方式将这些孢子水平感染健康的幼虫，并将水平感染的幼虫饲养至成虫。我们对感染的成虫（亲代）进行血液饲喂，并收集其产下的卵（子代），我们假设这些卵会通过垂直传播感染病原体 E. aedis 寄生虫。我们孵化了子代的卵，并在幼虫发育至4时收集并匀浆其中一部分幼虫th 龄期。我们量化了感染的幼虫所占的百分比 E. aedis 所有感染个体中的总孢子数量。我们发现绝大多数（96%）个体均被感染，感染幼虫的平均孢子负荷约为105我们得出结论，本繁育方案实现了极高成功率的扩繁 E. aedis 在 埃及伊蚊 蚊子。
该方案中有多个方面可能对初次使用者具有较大挑战性。以下提供一些额外信息以供参考。有关蚊虫常规饲养的问题，可参考一份完整的指南 埃及伊蚊 菌落维持不在本实验方案的范围之内。然而，许多常见问题可通过生物防御与新发感染研究资源库的资源得到解答。16,17 包括卵的孵化、基本饮食需求、饲养环境条件以及吸血。关于感染时间进程，从感染卵孵化出的幼虫在第四龄晚期之前不会表现出感染迹象th 幼虫阶段。单核孢子在1–2天内迅速出现。孵化后第6天时，幼虫可能几乎看不出感染迹象，但在孵化后第7或第8天则可能表现出严重感染。此外，在匀浆样品中观察孢子可能存在困难，因为整个蚊虫匀浆中含有大量其他微生物，包括其他大小与之相似的真核单细胞生物（例如酵母）。 E. aedis 单核孢子。其独特的形态 E. aedis 孢子（图2A是一种高度可靠的鉴定方法，有助于区分 E. aedis 从匀浆中的其他微生物分离。尽管孢子纯化对于鉴定或定量并非必需，但如果需要纯化孢子，可通过胶体二氧化硅密度梯度离心实现，该方法可实现分离 E. aedis 孢子与其他污染成分在匀浆液中的分离。该过程在 Solter 等人的研究中有详细描述。20.
不同实验室在饲养过程中采用的温度和饮食条件通常存在差异，但这些差异仍可能成功维持寄生虫的繁殖。幼虫食物类型的微小差异不会影响感染的成功率，尽管本实验方案未明确测试不同类型的食物。温度对感染效果的影响已有研究，E. aedis 在较宽的温度范围内均表现出稳定的感染能力21。孢子产量在 30.8 °C 时达到最高，但在低至 20 °C 的饲养温度下仍保持较高水平。在较高的饲养温度（36 °C）下，孢子数量显著减少，因此本实验方案应避免使用此类温度。
在处理寄生虫时，污染始终是一个需要关注的问题。E. aedis 是 Ae. aegypti 的有效寄生虫，因此必须将其与未感染的实验室种群分开饲养，以防止交叉污染。建议尽可能将感染的蚊子存放在独立的培养箱中。同时建议，用于微孢子虫研究的器材（例如幼虫饲养盘、移液管、笼子、卵收集杯）应专用于微孢子虫相关工作，不得在昆虫饲养室其他工作中广泛使用。所有饲养用具使用后应使用10%次氯酸钠溶液进行消毒，必要时可辅以高压灭菌法加强灭菌效果。

Aedes aegypti 是多种虫媒病毒（例如登革热病毒、寨卡病毒、黄热病病毒）的蚊媒载体，这些病毒每年估计导致数亿例疾病病例和超过 30,000 例死亡1,2。由这些病原体引起的疾病目前仅能采取支持性治疗，且未来很可能会出现新的虫媒病毒3。因此，控制蚊媒载体至关重要，因为它能有效阻断现有及新发病原体的传播4。传统的媒介控制策略主要依赖化学杀虫剂，但对多种常用杀虫剂已产生抗性，这推动了对新型媒介控制方法的需求。其中一种已被研究用于控制Ae. aegypti的生物防治剂是寄生虫Edhazardia aedis5,6。
E. aedis，最初被鉴定为 Nosema aedis 由Kudo于1930年发现，是一种微孢子虫寄生虫 埃及伊蚊 蚊子7. 发育与繁殖 E. aedis 相对复杂，其生命周期可通过多种方式进行7,8,9. 一种常见的发育周期在Becnel等（1989年）的研究中已有详细描述7 并用于实验室扩增（图1)8简而言之，该循环始于 埃及伊蚊 经垂直感染的卵 E. aedis 孵化为感染的幼虫，其脂肪体中发育出单核孢子，通常在幼虫或蛹期死亡。死亡幼虫释放的单核孢子污染栖息环境，并被健康个体摄入 埃及伊蚊 幼虫。这些孢子主要在消化道内萌发，感染暴露幼虫的消化组织，从而实现水平传播。经水平感染的幼虫发育为成虫（亲代），在体内形成双核孢子。在雌性个体中，这些双核孢子侵入生殖道，其相关的孢原质感染正在发育的卵细胞。这些卵随后孵化为被感染的幼虫（子代），导致寄生虫的垂直传播，并如上所述继续循环。
多项研究已探讨了 E. aedis 在生物防治中的潜力。研究表明，E. aedis 感染会导致 Ae. aegypti 雌蚊的生殖能力下降10。此外，在一项半野外实验中，大量释放 E. aedis 导致封闭网室内的测试 Ae. aegypti 种群被完全根除6。尽管 E. aedis 能够在多种蚊虫物种中完成部分发育阶段，但其仅在 Ae. aegypti 中实现垂直传播，表明其具有高度的宿主特异性11,12。同样，在实验室对 E. aedis 潜在环境风险的评估中，该微孢子虫寄生虫未能感染非靶标水生动物，包括摄食了感染 E. aedis 的 Ae. aegypti 幼虫的捕食性生物13。这些结果凸显了 E. aedis 在针对自然界 Ae. aegypti 种群的生物防治策略中的应用潜力。
尽管 E. aedis 在病媒控制方面展现出应用前景，但其大规模培养和应用仍面临诸多挑战。E. aedis 孢子在低温（即 5 °C）下不到一天即失去感染能力。即使在较高温度（即 25 °C）下，孢子的感染能力也会在三周内迅速下降14。此外，E. aedis 必须在活体 Ae. aegypti 蚊虫中进行培养，且需对健康幼蚊进行精确的剂量控制，以确保其完成生命周期，并防止用于培养的种群崩溃8。这种依赖体内培养的要求带来了技术难题；然而，近年来在蚊虫大规模饲养和机器人技术方面的进展（例如 Massaro 等人15）可能有助于实现 E. aedis 孢子的大规模生产。我们预计，该方法的可视化展示将提高 E. aedis 培养方案的可及性，使更多研究人员能够探究该系统的基础生物学特性及其应用潜力。我们还预计，这将促进与工程师、机器人专家以及更广泛技术领域的合作，从而进一步优化 E. aedis 的大规模培养。
<img alt="蚊子生命周期示意图；埃及伊蚊中病原体的水平与垂直传播" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： E. aedis 传播在 埃及伊蚊. 传播 E. aedis 始于孵化 E. aedis 感染的卵。将感染的幼虫饲养至4th 龄期， E. aedis 从这些幼虫中分离出孢子，并利用这些孢子经口感染健康的2nd/3rd 从未经感染的卵块中孵化的龄期幼虫（水平传播）。这些经口感染的幼虫被饲养至成虫（亲代），并产下携带感染的卵 E. aedis （垂直传播）。感染的卵（子代）孵化后可延续感染周期并维持寄生虫培养。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>120 mL 样本杯</td><td>McKesson</td><td>911759</td><td>作为烧杯的经济型替代品</td></tr><tr><td>150 mL 烧杯</td><td>VWR</td><td>10754-950</td><td>用于幼虫给药</td></tr><tr><td>2 盎司圆形玻璃瓶</td><td>VWR</td><td>10862-502</td><td>成蚊笼中盛装 10% 蔗糖溶液</td></tr><tr><td>3 盎司羽化杯</td><td>Henry-Schein</td><td>1201502</td><td>用于将蛹转移至笼中</td></tr><tr><td>成蚊饲养笼</td><td>Bioquip</td><td>1462 或 1450ASV</td><td>用于成蚊饲养</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td></td><td></td><td>用于灭菌</td></tr><tr><td>漂白剂</td><td></td><td></td><td>用于灭菌</td></tr><tr><td>Brewer&amp;rsquo;s yeast</td><td>Solgar</td><td></td><td>幼虫给药期间用于喂食</td></tr><tr><td>可控饲养箱</td><td>Tritech</td><td>DT2-MP-47L</td><td>经济型小型饲养箱</td></tr><tr><td>棉卷</td><td>VWR</td><td>470161-446</td><td>糖瓶的灯芯</td></tr><tr><td>脱纤维兔血</td><td>Fisher</td><td>50863762</td><td>用于成蚊血液喂养</td></tr><tr><td>结晶型二钠 ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209-5G</td><td>用于成蚊血液喂养</td></tr><tr><td>干猫粮</td><td>9Lives</td><td>Indoor Complete</td><td>用于常规幼虫饲养</td></tr><tr><td>鱼食薄片</td><td>TetraMin</td><td></td><td>用于常规幼虫饲养</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>用于孢子计数</td></tr><tr><td>匀浆机/混合器电机</td><td>VWR</td><td>47747-370</td><td>用于匀浆感染的幼虫</td></tr><tr><td>幼虫饲养盘</td><td>Sterillite</td><td>1961</td><td>整体尺寸为 11&quot; × 6 5/8&quot; × 2 3/4&quot;</td></tr><tr><td>肝粉</td><td>NOW foods</td><td>2450</td><td>幼虫给药期间用于喂食</td></tr><tr><td>移液器 1 - 10&amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>89079-962</td><td>用于幼虫给药</td></tr><tr><td>移液器 100 - 1000&amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>89079-974</td><td>幼虫给药期间用于添加食物</td></tr><tr><td>移液器吸头 1 - 10&amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td>用于幼虫给药</td></tr><tr><td>移液器吸头 100 - 1000&amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>10017-048</td><td>幼虫给药期间用于添加食物</td></tr><tr><td>塑料研磨棒</td><td>VWR</td><td>89093-446</td><td>用于匀浆感染的幼虫</td></tr><tr><td>结晶型蔗糖</td><td>Life Technologies</td><td>15503022</td><td>用于成蚊喂养</td></tr><tr><td>转移移液管</td><td>VWR</td><td>414004-033</td><td>用于幼虫转移，需修剪末端</td></tr></tbody></table>

edhazardia aedis 微孢子虫寄生虫在中国台湾伊蚊（aedes aegypti）中的传播

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis 是一种感染埃及伊蚊（Aedes aegypti）的微孢子虫寄生虫，而埃及伊蚊是传播多种虫媒病毒的病媒，每年导致数百万例疾病发生。E. aedis 可导致蚊媒死亡率上升以及生殖适应性下降，因此已被研究用于作为生物防治剂的潜力。我们所提供的 E. aedis 培养方案基于其自然感染周期，该周期涉及蚊宿主不同生命阶段中的水平传播和垂直传播。在幼虫阶段使埃及伊蚊（Ae. aegypti）接触孢子，这些被感染的幼虫发育为成虫后，会将寄生虫垂直传播给其后代。随后，利用被感染的后代作为孢子来源，用于后续的水平传播。由于该寄生虫生活史复杂，未有经验者在培养 E. aedis 时可能面临困难，本方案提供了详细的指导说明和可视化辅助图示以帮助理解。

E. aedis 感染的 埃及伊蚊 利物浦（LVP1b12）卵按上述方案所述进行孵化。在第4th 龄期阶段，可观察到感染的视觉特征，包括在感染幼虫的脂肪体中出现白色孢子囊（该表型的一个示例如下所示） 图2B）。从4中收获单核孢子th instar幼虫，通过将10只幼虫匀浆处理 500 µL 去离子水。这些孢子呈梨形，在400倍镜下清晰可见（图2A）。使用血细胞计数板进行孢子计数，结果为 4.05 × 103 孢子/µL 计算得出。一百名健康 埃及伊蚊 幼虫随后在100 mL水中水平感染约50,000个孢子，最终剂量约为每只幼虫500个孢子。幼虫被饲养至成虫（亲代），并使用去纤维蛋白兔血加1%（v/v）100 mM三磷酸腺苷进行血液饲喂。收集垂直感染的卵（子代），孵化后继续培养 E. aedis 传播并量化感染成功率。
孵化后第7天，将25只子代幼虫分别转移至1.5 mL离心管中，并用去离子水清洗一次。每只幼虫在250 µL去离子水中匀浆，使用血细胞计数板检测感染状态及E. aedis的载量。子代中E. aedis的垂直传播感染率为96%，孵化后第7天感染个体的平均孢子载量为3.31 x 105（范围：3.25 x 104 – 1.47 x 106；图3）。
<img alt="显微镜分析，健康样本与感染样本，网格计数细胞，感染识别。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：E. aedis 在 Ae. aegypti 蚊虫中的感染可视化。（A）E. aedis 单核梨形孢子。将约孵化后七天的10只E. aedis 感染的4龄幼虫在500 µL去离子水中匀浆，取10 µL匀浆液加入血细胞计数板，在400倍显微镜下观察。红色箭头指示典型的单核E. aedis 孢子。（B）E. aedis 感染的4龄幼虫在整个脂肪体中形成明显的白色孢子囊18，且常伴有形态异常和腹部体节膨大。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="感染率图表和孢子计数图；对感染幼虫的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：培养方案可有效诱导子代蚊虫感染 E. aedis。子代埃及伊蚊（Ae. aegypti）幼虫（n = 25）分别在250 µL去离子水中匀浆，取10 µL匀浆液加入血细胞计数板。观察到单核孢子即判定为感染阳性，并对所有阳性样本进行孢子定量。（A）子代幼虫中的感染率。灰色代表未感染幼虫，黑色代表感染幼虫。各段显示的数字为每组个体的绝对数量。（B）每个感染个体的孢子载量。黑点表示每头幼虫单核孢子数量经log10转换后的数值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

一种培养微孢子虫寄生虫Edhazardia aedis的实验方案。该寄生虫通过幼虫阶段的水平传播和成虫阶段的垂直传播，从一代埃及伊蚊（Aedes aegypti）传递至下一代。活的孢子质体可在感染的卵中长期存活。

Edhazardia aedis 微孢子虫寄生虫在中国台湾伊蚊（Aedes aegypti）中的传播

伊氏埃德哈迪虫（Edhazardia aedis）是一种感染埃及伊蚊（Aedes aegypti）的微孢子虫寄生虫，而埃及伊蚊是一种传播多种虫媒病毒的病媒蚊，这些病毒每年导致全球数以百万计的……

Edhazardia aedis 是一种专门感染埃及伊蚊（Aedes aegypti）的微孢子虫寄生虫。由于该寄生虫生活史复杂，新研究人员在培养过程中可能面临挑战。本实验方案提供了培养 E. aedis 的逐步操作指南，包括如何准确把握各步骤的时间节点、识别感染性孢子，以及扩增下一代寄生虫。准确把握本方案的时间节点可能具有挑战性，可能需要经过多次尝试和调整。孢子的鉴定也可能较为困难。本方案中的图示辅助材料可提供帮助。首先，将感染了 E.aedis 的埃及伊蚊（A. aegypti）卵置于含有 1 升去离子水的幼虫饲养盘中，并加入 50 毫克鱼食，以启动孵化。将蚊子饲养在 27 °C、80% 相对湿度、14 小时光照和 10 小时黑暗的光周期条件下。孵化后，将幼虫密度调整至每盘约 100 条幼虫，必要时制备新的饲养盘。每个托盘中加入一块干燥的猫粮。当食物耗尽时进行补充，但不要提供过量食物。每三天提供一块200毫克的猫粮即可。当感染的幼虫处于三龄至四龄阶段时，将未感染的埃及伊蚊（A.aegypti）卵孵化至新的托盘中。以适当的密度饲养蚊子，使健康的埃及伊蚊在48至72小时内发育至二龄至三龄幼虫阶段。在多日内分批孵化健康卵，可确保在需要时幼虫处于正确的发育阶段。为收获并定量单核孢子，使用移液管将10只被感染的四龄幼虫转移至1.5毫升微量离心管中。用移液管吸除培养用水，加入约1毫升洁净的去离子水清洗幼虫一次。吸除清洗用水后，向10只幼虫中加入500微升洁净的去离子水，使用研杵和机械匀浆器进行匀浆处理。取10微升匀浆液加入血细胞计数板，在400倍显微镜下定量孢子数量。通过混合1.2克肝粉、0.8克啤酒酵母和100毫升水，制备新鲜的幼虫食物悬液。将100只二龄至三龄健康的埃及伊蚊（A.aegypti）幼虫转移至150毫升烧杯或样品杯中，用移液器向每个杯中加入5×10⁴至1×10⁵个孢子。加入2毫升幼虫食物浆液和去离子水，定容至100毫升。暴露12至24小时后，将幼虫转移至饲养盘中。添加食物并饲养至成虫阶段。观察给药后的幼虫化蛹情况，并将蛹转移至饲养笼中的羽化杯内。成虫自由取食糖液。根据BEI资源提供的标准方案对成虫进行血液饲喂。从吸血后的成虫中收集卵。此步骤可发生埃立克体属（E.aedis）的垂直传播。操作结束后，使用10%次氯酸钠溶液清洁所有接触过埃立克体属（E.aedis）的材料，并进行高压灭菌，以防止污染。本方案展示了在埃及伊蚊中传播伊蚊胞虫（E.aedis）所需的完整操作流程。携带伊蚊胞虫（E.aedis）的埃及伊蚊（A.aegypti）卵被孵化，幼虫被饲养至四龄幼虫阶段。在四龄幼虫阶段，可观察到感染的明显特征，例如在感染幼虫的脂肪体中广泛分布的白色孢子囊。通过将10只四龄幼虫在500微升去离子水中匀浆，收集单核孢子。这些孢子呈梨形，在400倍放大倍数下清晰可见。经计算，孢子浓度为每微升4,050个，这些孢子被用于通过水平传播感染健康幼虫。在孵化后第7天评估了25代子代幼虫的感染状态及伊氏按蚊微孢子虫（E.aedis）载量。子代中E.aedis的垂直传播感染率为96%，孵化后第7天感染个体的平均孢子载量为3.31 × 10⁵。为准确协调幼虫发育阶段，建议考虑饲养时间可能存在一定变异。此外，孢子数量会迅速增加，因此如果未检测到孢子，只需在第二天再次尝试即可。祝您好运。

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免疫学与感染

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了解在埃及伊蚊中培养微孢子寄生虫Edhazardia aedis的完整实验方案，包括孢子收获、定量及垂直传播技术。该方法为寄生虫生命周期研究提供标准化操作流程，垂直传播率达96%。

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