Name: 使用RNA-seq研究分子进化和基因表达的生物信息学管道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学习使用RNA-seq生物信息学流程分析Hydra vulgaris中候选基因的分子进化与表达模式。该流程结合BLAST、MEGA和edgeR工具，可识别差异表达转录本并构建系统发育树，为研究基因家族进化提供可重复的计算方法。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Adriana Briscoe、Gil Smith、Rabi Murad和Aline G. Rangel在将部分步骤纳入我们工作流程方面提供的建议和指导。我们还感谢Katherine Williams、Elisabeth Rebboah和Natasha Picciani对稿件提出的修改意见。本研究部分得到了George E. Hewitt医学研究基金会向A.M.M.提供的博士后研究基金资助。

本方案遵循加州大学欧文分校的动物护理指南。
1. RNA-seq 文库构建
<ol>
	<li>使用以下方法分离RNA。
	<ol>
		<li>收集样品。若需在后续提取RNA，应将样品迅速冷冻或置于RNA保存液中15（材料表）。</li>
		<li>处死并解剖生物体，分离目标组织。</li>
		<li>使用RNA提取试剂盒提取总RNA，并使用RNA纯化试剂盒进行纯化（材料表） 
		注意：针对不同物种和组织类型，可能存在更适用的实验方案和试剂盒16,17。我们已从蝴蝶的不同体组织18以及胶状水母Hydra19中成功提取RNA（见讨论部分）。</li>
		<li>测定各样品RNA的浓度和质量（材料表）。构建cDNA文库时应选用RNA完整性数值（RIN）高于8、理想情况下接近9的样品20。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤构建cDNA文库并进行测序。
	<ol>
		<li>根据文库构建说明书操作手册构建cDNA文库（见讨论部分）。</li>
		<li>测定cDNA的浓度和质量（材料表）。</li>
		<li>对文库进行多重化（multiplex）并进行测序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 访问计算机集群
注意：RNA-seq 分析需要处理大型文件，最好在计算机集群上进行（材料表）。
<ol>
	<li>在终端（Mac）或 PuTTY（Windows）应用程序窗口中，使用命令 ssh username@clusterlocation 登录计算机集群账户。</li>
</ol>
3. 获取RNA-seq读段
<ol>
	<li>从测序机构获取 RNA-seq 测序读段，或对于已发表研究中的数据，从其存放的数据存储库中获取（3.2 或 3.3）。</li>
	<li>从 ArrayExpress 等存储库下载数据时，请执行以下操作：
	<ol>
		<li>使用登录编号在网站上进行搜索。</li>
		<li>找到下载数据的链接，单击鼠标左键并选择 复制链接。</li>
		<li>在终端窗口中输入 wget，然后选择 粘贴链接，将数据复制到用于分析的目录中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下载 NCBI 短读段存档（SRA）数据时，请遵循以下替代步骤：
	<ol>
		<li>在终端中使用 wget 下载 SRA Toolkit v. 2.8.1。 
		注意：向计算机集群下载和安装程序可能需要 root 权限，若安装失败，请联系您的计算机集群管理员。</li>
		<li>通过输入 tar -xvf $TARGZFILE 完成程序的安装。</li>
		<li>在 NCBI 中搜索您要下载的样本对应的 SRA 登录编号，编号格式应为 SRRXXXXXX。</li>
		<li>在终端窗口中输入 [sratoolkit 位置]/bin/prefetch SRRXXXXXX 获取 RNA-seq 数据。</li>
		<li>对于双端测序文件，输入 [sratoolkit 位置]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX 以获得两个 fastq 文件（SRRXXXXXX_1.FASTQ 和 SRRXXXXXX_2.FASTQ）。 
		注意：若要进行 Trinity de novo 组装，请使用命令 [sratoolkit 位置]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXX</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 去除接头序列和低质量读段（可选）
<ol>
	<li>在计算集群上安装或加载 Trimmomatic21 v. 0.35。</li>
	<li>在存放 RNA-seq 数据文件的目录中，输入一条命令，其中包含 trimmomatic jar 文件的位置、输入 FASTQ 文件、输出 FASTQ 文件，以及读长和质量等可选参数。 
	注意：具体命令会因原始数据及期望的读长和质量要求而有所不同。对于带有 Nextera 接头的 Illumina 43 bp 读长数据，我们使用的命令为：java -jar /data/apps/trimmomatic/0.35/trimmomatic-0.35.jar PE $READ1.FASTQ $READ2.FASTQ paired_READ1.FASTQ unpaired_READ1.FASTQ paired_READ2.FASTQ unpaired_READ2.FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30。</li>
</ol>
5. 获取参考基因组序列
<ol>
	<li>在 Google、EnsemblGenomes 以及 NCBI Genomes 和 Nucleotide TSA（转录组鸟枪法组装）数据库中搜索目标物种的参考基因组或组装完成的转录组（图1）。 
	注意：如果参考基因组或转录组不可用或质量较低，请转至第6步，进行从头（de novo）组装。</li>
	<li>若存在参考基因组或组装完成的转录组，请将其以 fasta 文件格式下载至分析执行的位置，具体操作步骤如下：
	<ol>
		<li>找到下载基因组的链接，单击鼠标左键并复制链接。</li>
		<li>在终端窗口中输入wget命令，然后粘贴链接地址。如有提供，同时复制该参考基因组的 GTF 文件和蛋白质 FASTA 文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 进行从头组装（de novo assembly）（替代步骤5）
<ol>
	<li>在终端窗口中输入 cat *READ1.FASTQ &#62; $all_READ1.FASTQ 和 cat *READ2.FASTQ &#62; all_READ2.FASTQ，将所有样本的 RNA-seq READ1 和 READ2 fastq 文件合并。</li>
	<li>在计算集群上安装或加载 Trinity22 v.2.8.5。</li>
	<li>在终端中输入以下命令进行生成与组装：Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1.FASTQ --right $all_READ2.FASTQ。</li>
</ol>
7. 将序列比对到基因组 (7.1) 或de novo转录组 (7.2)
<ol>
	<li>使用 STAR23 v. 2.6.0c 和 RSEM24 v. 1.3.0 将测序读段比对到参考基因组。
	<ol>
		<li>在计算集群上安装或加载 STAR v. 2.6.0c 和 RSEM v. 1.3.0。</li>
		<li>通过输入命令 rsem-prepare-reference --gtf $GENOME.GTF --star -p 16 $GENOME.FASTA $OUTPUT 对基因组进行索引构建。</li>
		<li>通过输入命令 rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ1.FASTQ $READ2.FASTQ $INDEX $OUTPUT 对每个样本的读段进行比对并计算基因表达量。</li>
		<li>使用命令 mv RSEM.genes.results $sample.genes.results 将结果文件重命名为具有描述性的名称。</li>
		<li>通过输入命令 rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] &#62; $OUTPUT 生成所有计数的矩阵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 RSEM 和 bowtie 将 RNA-seq 数据比对到 Trinity de novo 组装结果。
	<ol>
		<li>安装或加载 Trinity22 v.2.8.5、Bowtie25 v. 1.0.0 以及 RSEM v. 1.3.0。</li>
		<li>通过输入命令 [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY.FASTA --seqType fq --left $READ1.FASTQ --right $READ2.FASTQ --est_method RSEM --aln_method bowtie --trinity_mode --output_dir $OUTPUT 对读段进行比对并计算每个样本的表达量。</li>
		<li>使用命令 mv RSEM.genes.results $sample.genes.results 将结果文件重命名为具有描述性的名称。</li>
		<li>通过输入命令 [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[genes/isoforms].results 生成所有计数的矩阵。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 鉴定目的基因
注意：以下步骤可使用核苷酸或蛋白质 FASTA 文件进行，但使用蛋白质序列时效果最佳且更为简便。在不同物种之间进行搜索时，采用蛋白质对蛋白质的 BLAST 比对更有可能获得结果。
<ol>
	<li>对于参考基因组，使用步骤 5.2.2 中的蛋白质 FASTA 文件或参见补充材料以生成自定义基因特征 GTF 文件。</li>
	<li>对于从头转录组（de novo transcriptome），使用 TransDecoder 生成蛋白质 FASTA 文件。
	<ol>
		<li>在计算机集群上安装或加载 TransDecoder v. 5.5.0。</li>
		<li>通过输入命令 [Transdecoder 位置]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY.FASTA 来查找最长开放阅读框及预测的肽序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 NCBI GenBank 中搜索近缘物种中的同源基因。
	<ol>
		<li>打开一个网页浏览器窗口，访问 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/。</li>
		<li>在搜索栏中输入目标基因名称以及已测序的近缘物种名称、属名或门名；在搜索栏左侧选择“protein”，然后点击“search”。</li>
		<li>点击 Send to，然后选择 File。在“Format”下选择 FASTA，然后点击 Create File 以导出序列。</li>
		<li>通过在本地终端窗口中输入 scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR 将同源基因的 FASTA 文件传输至计算机集群，或使用 FileZilla 在本地计算机与集群之间传输文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 BLAST+26 搜索候选基因。
	<ol>
		<li>在计算机集群上安装或加载 BLAST+ v. 2.8.1。</li>
		<li>在计算机集群上，通过输入命令 [BLAST+ 位置]/makeblastdb -in $PEP.FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT，基于基因组或转录组翻译得到的蛋白质 FASTA 文件创建 BLAST 数据库。</li>
		<li>通过输入命令 [BLAST+ 位置]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUT，将来自 NCBI 的同源基因序列与目标物种数据库进行比对。</li>
		<li>使用 more 命令查看输出文件。复制目标物种中唯一的基因 ID 至一个新的文本文件。</li>
		<li>通过输入命令 perl -ne 'if(/^&#62;(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP.FASTA &#62; $OUTPUT 提取候选基因的序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过反向 BLAST 验证基因注释。
	<ol>
		<li>在网页浏览器中访问 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。</li>
		<li>选择 tblastn，粘贴候选序列，选择“Non-redundant protein sequence”数据库，然后点击 BLAST。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过使用基因本体（GO）术语对基因组或转录组中的所有基因进行注释，识别更多候选基因（参见讨论部分）。
	<ol>
		<li>将蛋白质 FASTA 文件传输至本地计算机。</li>
		<li>下载并安装 Blast2GO27,28,29 v. 5.2 至本地计算机。</li>
		<li>打开 Blast2GO，点击 File，选择 Load，再选择 Load Sequences，点击 Load Fasta File (fasta)。选择 FASTA 文件后点击 Load。</li>
		<li>点击 Blast，选择 NCBI Blast，然后点击 Next。可编辑参数，或直接点击 Next，再次编辑参数后点击 Run，以查找最相似的基因描述。</li>
		<li>点击“mapping”，然后点击 Run，以搜索相似蛋白的基因本体（Gene Ontology）注释。</li>
		<li>接着点击 interpro，选择 EMBL-EBI InterPro，点击 Next。可编辑参数，或点击 Next 后点击 Run，以搜索已知基因家族和结构域的特征序列。</li>
		<li>点击 File，选择 Export，点击 Export Table。点击 Browse，命名文件，点击 Save，再点击 Export，以导出注释结果。</li>
		<li>在注释表格中搜索感兴趣的 GO 术语，以识别额外的候选基因。从 FASTA 文件中提取相应序列（见步骤 8.4.5）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 系统发育树
<ol>
	<li>下载并安装 MEGA30 v. 7.0.26 到您的本地计算机。</li>
	<li>打开 MEGA，点击 对齐，点击 编辑/构建比对，选择 创建新的比对 点击 好的，选择 蛋白质.</li>
	<li>当对齐窗口打开时，点击 编辑，点击 从文件插入序列 选择候选基因及可能同源基因的蛋白质序列FASTA文件。</li>
	<li>选择所有序列。找到臂状符号并将其悬停。此时应显示“使用 MUSCLE 进行序列比对”31 算法。单击臂状符号，然后单击 比对蛋白质 以比对序列。编辑参数或单击 好的 使用默认参数进行比对。</li>
	<li>目视检查并对齐窗口进行必要的手动修改，然后保存并关闭对齐窗口。</li>
	<li>在主 MEGA 窗口中，单击 模型，点击 寻找最佳DNA/蛋白质模型（机器学习），选择比对文件并设置相应参数，例如： 分析：模型选择（ML），所用树：自动（邻接法建树），统计方法：最大似然法，替换类型：氨基酸， gaps/缺失数据处理：使用所有位点，分支位点过滤：无。</li>
	<li>确定最佳数据模型后，转到 MEGA 主窗口。单击 系统发育 并点击 构建/检验最大似然树 然后根据需要选择对齐方式。为系统发育树选择适当的参数： 统计方法：最大似然法，系统发育检验：采用100次重复的自举法，替代类型：氨基酸，模型：LG加频率（+F），位点间速率：伽马分布（G），分为5个离散伽马类别，缺失数据/空缺处理：使用所有位点，最大似然启发式方法：最近邻交换法（NNI）。</li>
</ol>
10. 使用 TPM 可视化基因表达
<ol>
	<li>对于 Trinity，在计算机集群中进入运行 abundance_estimates_to_matrix.pl 的目录，其中一个输出文件应为 matrix.TPM.not_cross_norm。将此文件传输至本地计算机。 
	注意：交叉样本标准化的详细信息请参见补充材料。</li>
	<li>对于基因组分析得到的 TPM 值，请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>在计算机集群中，进入 RSEM 安装目录。通过输入命令 scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix 复制 rsem-generate-data-matrix 文件。使用 nano 编辑新文件，将“my $offsite = 4”中的数值从 4 修改为 5（适用于 TPM），修改后应为“my $offsite = 5”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进入包含 RSEM 输出文件 .genes.results 的目录，运行 rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] &#62; $OUTPUT 以生成 TPM 矩阵。将结果传输至本地计算机。</li>
	<li>使用 ggplot2 可视化结果。
	<ol>
		<li>在本地计算机上下载 R v. 4.0.0 和 RStudio v. 1.2.1335。</li>
		<li>打开 RStudio，在屏幕右侧进入 Packages 选项卡并点击 Install。输入 ggplot2 并点击 install。</li>
		<li>在 R 脚本窗口中，输入以下命令读取 TPM 表格：data&#60;-read.table(&#34;$tpm.txt&#34;,header = T)</li>
		<li>绘制类似于 图 4&#160;的柱状图，可输入类似以下命令：p&#60;- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat=&#34;identity&#34;) 
		fill&#60;-c(&#34;#d7191c&#34;,&#34;#fdae61&#34;, &#34;#ffffbf&#34;, &#34;#abd9e9&#34;, &#34;#2c7bb6&#34;) 
		p&#60;-p+scale_fill_manual(values=fill) 
		p + theme(axis.text.x = element_text(angle = 90))</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本实验方案的目的是概述利用RNA-seq数据对基因家族进行表征的各个步骤。这些方法已被证明适用于多种物种和数据集4,34,35。本文建立的分析流程已尽可能简化，即使是生物信息学初学者也能轻松遵循。本方案的重要意义在于，它详尽列出了完成一项可发表水平分析所需的全部步骤和必要软件工具。方案中的一个关键步骤是必须获得正确组装的全长转录本，这依赖于高质量的基因组或转录组数据。为获得合适的转录本，需要高质量的RNA和/或DNA，以及下文将讨论的良好注释信息。
在进行RNA-seq文库构建时，我们列出了适用于水螅（Hydra）19和蝴蝶18等小型生物组织的试剂盒（材料表）。需要注意的是，对于低起始量RNA样本，我们采用了改良的实验流程<sup class="xre...

测序技术的进步促进了非模式生物基因组和转录组的测序。除了从多种生物中测序DNA和RNA的可行性不断提高外，大量公开可用的数据也为研究目标基因提供了便利。本实验方案的目的是提供一系列生物信息学步骤，用于探究可能在目标生物中发挥重要作用的基因的分子进化与表达特征。
研究一个基因或基因家族的进化过程，可以为生物系统的演化提供重要见解。基因家族的成员通常通过识别保守基序或同源基因序列来确定。以往对基因家族进化的研究主要利用远缘关系的模式生物基因组进行1。这种方法的一个局限性在于，尚不清楚这些基因家族在近缘物种中的演化过程，以及不同环境选择压力所起的作用。在本实验方案中，我们纳入了在近缘物种中搜索同源基因的步骤。通过构建门水平的系统发育树，我们可以观察到基因家族进化中的趋势，例如保守基因的存在或谱系特异性的基因重复事件。在此层次上，我们还可以分析基因是直系同源（orthologs）还是旁系同源（paralogs）。尽管许多同源基因可能具有相似的功能，但这并非绝对2。在这些研究中引入系统发育树对于判断同源基因是否为直系同源至关重要。在真核生物中，许多直系同源基因在细胞内保持相似功能，这一点已得到证实，例如哺乳动物蛋白能够恢复酵母中直系同源蛋白的功能3。然而，也存在非直系同源基因执行特定功能的情况4。
系统发育树开始揭示基因与物种之间的关系，但仅基于遗传关系无法确定基因功能。基因表达研究结合功能注释和富集分析&#160;可为基因功能提供有力支持。在能够对个体之间或组织类型之间的基因表达进行定量和比较的情况下，更能揭示其潜在功能。以下实验方案参考了研究Hydra vulgaris7中视蛋白基因所采用的方法，但这些方法可应用于任何物种和任何基因家族。此类研究结果为在非模式生物中进一步探究基因功能和基因调控网络奠定了基础。例如，通过分析视蛋白（opsins）的系统发育关系——这类蛋白可启动光转导级联反应——有助于理解眼睛和感光功能的演化过程8,9,10,11。在此背景下，非模式生物尤其是刺胞动物或栉板动物等基础动物类群，有助于阐明光转导级联和视觉系统在不同分支中的保守性或演化变化12,13,14。类似地，确定其他基因家族的系统发育关系、表达模式及其调控网络，将有助于我们理解适应性状背后的分子机制。

<table><tbody><tr><td>生物分析仪-DNA试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>湿实验材料</td></tr><tr><td>生物分析仪-RNA试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>湿实验材料</td></tr><tr><td>BLAST+ v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>在计算集群上&lt;br/&gt; https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td></tr><tr><td>Blast2GO（在您的个人电脑上）</td><td></td><td></td><td>在本地计算机上&lt;br/&gt; https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td></tr><tr><td>boost v. 1.57.0</td><td></td><td></td><td>在计算集群上</td></tr><tr><td>Bowtie v. 1.0.0</td><td></td><td></td><td>在计算集群上&lt;br/&gt; https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td></tr><tr><td>计算集群（强烈推荐）</td><td></td><td></td><td>注意：基因组数据分析最好在高性能计算集群上进行，因为文件非常大。</td></tr><tr><td>Cufflinks v. 2.2.1</td><td></td><td></td><td>在计算集群上</td></tr><tr><td>edgeR v. 3.26.8（在R中）</td><td></td><td></td><td>在Rstudio中&lt;br/&gt; https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td></tr><tr><td>gcc v. 6.4.0</td><td></td><td></td><td>在计算集群上</td></tr><tr><td>Java v. 11.0.2</td><td></td><td></td><td>在计算集群上</td></tr><tr><td>MEGA7（在您的个人电脑上）</td><td></td><td></td><td>在本地计算机上&lt;br/&gt; https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MEGAX v. 0.1</td><td></td><td></td><td>在本地计算机上&lt;br/&gt; https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td>湿实验材料</td></tr><tr><td>perl 5.30.3</td><td></td><td></td><td>在计算集群上</td></tr><tr><td>python</td><td></td><td></td><td>在计算集群上</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光仪</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td>湿实验材料</td></tr><tr><td>R v.4.0.0</td><td></td><td></td><td>在计算集群上&lt;br/&gt; https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td></tr><tr><td>RNA保存液（RNAlater）</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7021</td><td>湿实验材料</td></tr><tr><td>RNeasy试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>湿实验材料</td></tr><tr><td>RSEM v. 1.3.0</td><td></td><td></td><td>计算机软件&lt;br/&gt; https://deweylab.github.io/RSEM/</td></tr><tr><td>RStudio v. 1.2.1335</td><td></td><td></td><td>在本地计算机上&lt;br/&gt; https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td></tr><tr><td>Samtools v. 1.3</td><td></td><td></td><td>计算机软件</td></tr><tr><td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>在计算集群上&lt;br/&gt; https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td></tr><tr><td>STAR v. 2.6.0c</td><td></td><td></td><td>在计算集群上&lt;br/&gt; https://github.com/alexdobin/STAR</td></tr><tr><td>StringTie v. 1.3.4d</td><td></td><td></td><td>在计算集群上&lt;br/&gt; https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td></tr><tr><td>Transdecoder v. 5.5.0</td><td></td><td></td><td>在计算集群上&lt;br/&gt; https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td></tr><tr><td>Trimmomatic v. 0.35</td><td></td><td></td><td>在计算集群上&lt;br/&gt; http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Trinity v.2.8.5</td><td></td><td></td><td>在计算集群上&lt;br/&gt; https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>湿实验材料</td></tr><tr><td>TruSeq RNA文库制备试剂盒v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>湿实验材料</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>湿实验材料</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*在计算集群上下载和安装可能需要root权限。请联系您的网络管理员。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用rna-seq研究分子进化与基因表达的生物信息学分析流程

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

整理和报告大规模数据集（如全基因组或转录组数据）通常是一项艰巨的任务。一种分解结果的方法是聚焦于一个或多个对研究生物体和研究主题具有重要意义的基因家族。在本实验方案中，我们概述了用于构建系统发育树并量化目标基因表达水平的生物信息学步骤。系统发育树有助于揭示基因在种内和种间的进化模式，并可推断直系同源关系。结合RNA-seq数据，可进一步比较这些基因在不同个体或组织中的表达情况，从而增强分析结果。分子进化与表达研究能够揭示基因在不同物种间的进化模式及其功能保守性。对一个基因家族的表征可为后续研究提供基础，并可在新发表的基因组或转录组研究论文中突出一个重要基因家族的存在与意义。

上述方法总结于图1，并应用于Hydra vulgaris组织的数据集。H. vulgaris是一种淡水无脊椎动物，属于刺胞动物门（Cnidaria），该门还包括珊瑚、水母和海葵。H. vulgaris可通过出芽进行无性繁殖，并在被切成两段后能够再生头部和足部。本研究旨在探讨Hydra中视蛋白基因的进化与表达7。尽管Hydra没有眼睛，但其表现出依赖光的行为32。视蛋白基因编码的蛋白质在视觉中起重要作用，可感知不同波长的光并启动光转导级联反应。在基础物种中研究该基因家族的分子进化与表达，有助于深入了解动物眼睛及光感知能力的演化过程。
我们使用 Hydra 2.0 生成了引导式组装33 参考基因组和公开可用的RNA-seq数据（GEO编号GSE127279） <strong cl...

本实验方案的目的是利用RNA测序数据研究候选基因的进化与表达。

利用RNA-seq研究分子进化与基因表达的生物信息学分析流程

处理和报告大型数据集（如全基因组或转录组数据）通常是一项艰巨的任务。一种分解结果的方法是聚焦于……

本方案概述了研究候选基因分子进化与表达的生物信息学步骤。本文提供了详细的指导，使任何具备最少生物信息学经验的研究人员均可顺利执行该方案。此分析流程可应用于任何生物体及任何基因家族。进行生物信息学分析时，一个常见问题是shell脚本运行失败。在执行本方案时，请确保使用最新版本的软件，仔细阅读错误文件，并认真查阅使用手册。首先，在终端或PuTTY应用程序窗口中登录计算机集群账户。在终端中，使用 Wget 下载 SRA Toolkit 2.8.1 版本，然后完成程序的安装。在 NCBI 中搜索所需样本的 SRA 登录号，随后在终端窗口中获取 RNA 测序数据。对于双端测序文件类型，获取两个 FASTQ 文件。如果存在参考基因组，可在线查找。要获取参考基因组序列，可在终端窗口中输入 wget 命令，然后粘贴链接地址。如果可获取，还应复制该参考基因组的 GTF 文件和蛋白质 FASTA 文件。对基因组进行索引，然后比对测序读段并计算每个样本的表达量。将结果文件重命名为具有描述性的名称，并生成一个包含所有计数的矩阵。打开一个互联网浏览器窗口，访问 NCBI GenBank。在搜索栏中输入目标基因的名称以及已测序的近缘物种的名称。在搜索栏左侧选择“Protein”，然后点击“Search”。通过点击“Send to”，然后选择“File”，来提取序列。在“格式”中选择 FASTA，然后单击“创建文件”。使用本地终端窗口或 FileZilla 将同源基因的 FASTA 文件传输到计算机集群。接下来，在计算机集群上使用 BLAST+ 搜索候选基因，从基因组或转录组翻译的蛋白质 FASTA 文件中创建 BLAST 数据库。将来自NCBI的同源基因序列与目标物种的数据库进行BLAST比对，然后使用more命令查看输出文件。从目标物种中复制唯一的基因ID至一个新的文本文件，并提取候选基因的序列。为了使用双向BLAST验证基因注释，请前往BLAST局部比对搜索工具，选择BLASTP，粘贴候选序列，选择非冗余蛋白序列数据库，然后点击BLAST。打开MEGA软件，点击“Align”，然后选择“Edit/Build Alignment”，选择“Create a new alignment”，并点击“OK”。选择“Protein”。当比对窗口打开后，点击“Edit”。单击“从文件插入序列”，选择包含候选基因和可能同源基因蛋白质序列的FASTA文件。选择所有序列。找到臂状符号并将其悬停。应选择使用 MUSCLE 算法进行序列比对。点击手臂图标，然后点击“比对蛋白质”以比对序列，可编辑参数，或直接点击“确定”使用默认参数。本实验方案应用于水螅（Hydra vulgaris）组织，水螅是一种属于刺胞动物门的淡水无脊椎动物。研究视蛋白基因有助于深入了解动物眼睛和感光机制的演化。从NCBI GenBank中提取了水螅（H.vulgaris）及其他物种的视蛋白相关基因序列，并生成FASTA文件。在MEGA中对视蛋白基因进行比对，从而鉴定出某些水螅视蛋白缺失了与感光分子结合所必需的保守赖氨酸氨基酸。使用海蜇（Hydra vulgaris）及其他物种的视蛋白序列构建了最大似然树。系统发育分析表明，视蛋白基因在刺胞动物中通过谱系特异性复制进化，且在 H. vulgaris 中可能通过串联重复方式进行复制。接下来，使用 edgeR 进行差异表达分析，以研究视蛋白基因的绝对表达水平。为了确定一个或多个视蛋白在基盘（即头部）中是否上调，进行了基盘与体柱、出芽区、足部和触手之间的成对比较。研究发现，基盘与体柱之间有1,774个转录本差异表达。通过多个比较分析确定了在多个组织间均上调的基因，并在Blast2GO中进行了功能富集分析。最后，研究了在芽殖的不同阶段以及再生的不同时间点，不同组织中视蛋白基因的绝对表达水平。通过肉眼观察序列比对结果和系统发育树，可以确认候选基因是否属于目标基因家族。若某些基因的序列差异过大，或形成一个与其他所有基因均不相关的独立分支，则这些基因很可能属于另一个不同的基因家族。本方案的结果可视为假设生成性的。该流程能够突出候选基因，供后续研究进行功能层面的深入分析。在探究了水螅视蛋白表达后，我们目前正采用类似技术，在不同物种中研究相关基因，以期识别其功能上的相似性与差异性。

a-bioinformatics-pipeline-for-investigating-molecular-evolution-gene

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用RNA-seq研究分子进化和基因表达的生物信息学管道

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。...

通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

我们介绍一种基于靶向RNA测序的方法，包括制备带索引的cDNA文库、使用定制探针进行杂交与捕获，以及数据分析，以检测特定转录本的基因表达、突变和基因融合。靶向RNA测序可在台式测序仪上对选定转录本进行经济高效且快速的评估。...

靶向RNA测序实验用于分析基因表达与基因组变异

本文介绍了一种生物信息学方法及相关分析，用于在特定位点水平上鉴定 LINE-1...

RNA下一代测序及生物信息学分析流程在位点特异性水平鉴定表达的LINE-1元件

本文介绍了一种通过接触抑制实现人原代角质形成细胞体外分化的逐步实验流程，并通过RNA-seq分析在分子水平对其进行表征。...

通过RNA-Seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化

本方法介绍了如何提高从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中获得的测序数据的质量和数量。我们描述了更准确评估FFPE-RNA样本质量的方法、测序文库的制备步骤，以及对FFPE-RNA样本数据进行分析的流程。...

降解FFPE-RNA样本测序及分析的优化

提供了用于RNA测序的差异表达分析方法的详细方案：limma、EdgeR、DESeq2。...

三种用于RNA测序的差异表达分析方法：limma、EdgeR、DESeq2

本方案可为生物湿实验研究人员（生物信息学经验有限）提供RNA测序实验的初步质量控制。...

Rup（RNA-seq 可用性评估流程）— 真核生物批量 RNA-seq 实验的质量控制

本文报道了通过定向分子进化技术生成Tre重组酶的方法。Tre重组酶可识别HIV-1前病毒LTR序列中预先设定的目标序列，从而实现前病毒从感染的人类细胞中的切除与根除。尽管定向分子进化技术仍处于初期阶段，但它将有助于创建定制化的酶类，作为分子手术和分子医学的研究工具。...

Tre重组酶的分子进化

本实验方案描述了如何从小鼠骨髓中建立原代造血细胞培养，并随后使用 Gene Pulser MXCell...

小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

用于电生理研究的新生小鼠脊髓分离示例。...

脊髓电生理学

学习使用RNA-seq生物信息学流程分析Hydra vulgaris中候选基因的分子进化与表达模式。该流程结合BLAST、MEGA和edgeR工具，可识别差异表达转录本并构建系统发育树，为研究基因家族进化提供可重复的计算方法。

利用RNA-seq研究分子进化与基因表达的生物信息学分析流程

探索更多视频