通过水杨酸甲酯透明化与三维成像探究脂肪组织结构

该方案可用于通过三维成像技术分析人源化小鼠脂肪组织的三维结构，有助于将病理功能障碍与脂肪组织的结构变化关联起来。此透明化处理流程极为简便，非常适用于人源化温血小鼠脂肪组织的透明化处理，且相较于其他透明化方案，所用溶剂毒性更低，例如乙醇或水杨酸甲酯。

首先，在15毫升塑料管中加入至少10毫升含4%多聚甲醛的PBS溶液，并将收获的小鼠或人白色脂肪组织浸入其中，建议在化学通风橱内操作。将组织置于摇床上，室温下振荡孵育1小时，随后将试管转移至4°C环境中继续在摇床上过夜孵育。次日早晨，用10毫升PBS溶液在室温下清洗固定后的白色脂肪组织5分钟，以彻底去除残留的固定剂，然后将组织转移至另一含有10毫升PBS配制的0.3%甘氨酸溶液的15毫升离心管中，在室温下置于转速为100转/分钟的轨道摇床上孵育1小时。

当剩余的游离醛基被淬灭后，将组织浸入含有10毫升含0.2%Triton X-100的PBS溶液的15毫升离心管中，在37°C下振荡孵育2小时。孵育结束后，用10毫升含0.2%Triton X-100和20%DMSO的溶液在37°C下振荡处理组织过夜。次日早晨，将组织转移至一个15毫升塑料离心管中，管内含有10毫升PBS溶液，其中包含0.1%Tween 20、0.1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸钠和20%DMSO，在37°C下振荡孵育至少24小时。

孵育结束后，在圆周摇床上用10毫升含0.2% Triton X-100的PBS溶液以每分钟100转的速度冲洗组织1小时。随后将组织浸入含0.2% Triton X-100、10% DMSO和3% BSA的PBS溶液中，在37°C条件下振荡孵育12小时。用于白色脂肪组织的染色。

将组织转移至含有感兴趣的一抗、体积为300微升的PBS溶液中，该溶液包含0.2% Triton X-100、10% DMSO和3% BSA，置于1.5毫升微量离心管中，用铝箔包裹避光，并将离心管放入50毫升Falcon管中。将管子置于摇床中，在37°C条件下振荡孵育两天。孵育结束后，在37°C、避光并振荡的条件下，用10毫升含0.2% Triton X-100、10% DMSO和3% BSA的PBS溶液冲洗组织两次，每次5小时。

第二次漂洗后，将组织在含有10毫升新鲜的0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA的PBS溶液中，于37°C条件下振荡孵育16至48小时，随后将组织转移至含有300微升PBS配制的0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA溶液的1.5毫升离心管中，并加入适当的二抗，用铝箔包裹避光保护。在37°C摇床上孵育两天后，用10毫升含0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA的PBS溶液于37°C避光振荡洗涤组织两次，每次5小时。第二次洗涤后，将组织漂洗至含有10毫升新鲜0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA的PBS溶液的离心管中，在37°C条件下振荡孵育16至48小时，并避光保护。

随后在37摄氏度下，用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）振荡避光洗涤两小时。对于白色脂肪组织透明化处理，在PBS洗涤结束后，将组织浸入含有递增浓度乙醇系列的10毫升溶液中，每个浓度于室温下振荡避光孵育两小时，具体操作如图所示。次日早晨，将组织置于一个带塑料盖的20毫升玻璃瓶中，瓶内含有5毫升水杨酸甲酯，并置于通风橱内。

在此阶段，白色脂肪组织仍然清晰可见。将容器置于室温下避光保护，并至少摇晃两小时。白色脂肪组织将完全转化为可移植状态。

在通风橱中，将染色并透明化处理后的白色脂肪组织置于配备玻璃底的金属成像腔室内，用于三维共聚焦成像。向腔室内加入新鲜的水杨酸甲酯。通过添加一小片盖玻片以固定组织，并加盖一大片盖玻片密封腔室，完成腔室的封片。

将样品室置于倒置共聚焦显微镜载物台上，使用低倍镜对组织进行成像，以生成整个脂肪组织样本的数立方厘米三维图谱。完成三维图谱构建后，采用20倍长工作距离空气物镜（在分辨率与成像深度之间具有良好的平衡）选取多个区域，进行高倍镜下的组织采样。为实现细胞分割，需将三维图像序列转换为软件专用格式，以释放内存空间。

在打开软件的细胞模块之前，将细胞检测设置更改为细胞膜染色，并选择用于界定细胞边界的标记物所对应的荧光通道。然后设定阈值，输入预期细胞大小的范围，并运行分割。

透明化处理对人和小鼠白色脂肪组织的影响可直接用肉眼观察。透明化还能显著提高组织成像的深度，便于基于4倍放大进行整个组织的三维成像和三维图谱生成。

3D成像技术还可实现对不同感兴趣区域的选取，以20倍放大倍数获取深度达两毫米的图像。脂滴和脂肪细胞可分别通过perilipin和抗GLUT4抗体进行特异性染色。血管可通过CD31抗体或在处死前短时间内静脉注射DyLight 649标记的凝集素进行检测。

可使用抗CD301藻红蛋白抗体和抗TCRβ太平洋蓝抗体对巨噬细胞和T细胞进行可视化。外周神经网络可通过抗酪氨酸羟化酶抗体进行检测。利用这些标记方法，可测定脂肪组织中脂肪细胞的平均大小、大小分布以及血管网络密度。

遵循所示的占位时间至关重要，因为样品制备不良将无法获得良好的图像质量。该方案可与先进成像系统结合使用，也可与免费的图像分析后处理软件相配合。