Name: 通过甲基异硫清除和三D成像探索脂肪组织结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 探索使用甲基水杨酸清除技术对小鼠和人类白色脂肪组织进行三维成像的方法。该技术可清晰显示血管、免疫细胞和脂滴结构，为研究脂肪组织病理学提供重要工具。

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本工作由法国国家健康与医学研究院（INSERM）、法国蔚蓝海岸大学（Université Côte d’Azur）以及法国国家科研署（ANR）的资助支持，包括“未来投资”计划中的SIGNALIFE卓越实验室项目（ANR-11-LABX-0028-01）、UCA JEDI项目（ANR-15-IDEX-01）下“复杂系统”学院2和“生命复杂性与多样性”学院4、法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale，FRM团队项目DEQ20180839587），以及J.G.获得的青年研究者项目（ANR18-CE14-0035-01-GILLERON）。我们还感谢由滨海阿尔卑斯省议会（Conseil Départemental des Alpes-Maritimes）和普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区（Région PACA）资助的C3M成像核心设施，该设施同时也得到法国IBISA显微成像与图像平台蔚蓝海岸（MICA）的支持。我们感谢Marion Dussot在组织样本制备方面的技术支持。我们感谢Abby Cuttriss（UCA国际科学可见度项目）对本文稿件的校对。

该实验方案已针对所有小鼠和人类的白色脂肪组织库进行过测试并验证有效。人类和小鼠脂肪组织的采集均符合欧洲法律法规，并经法国和瑞典伦理委员会批准。
1. 小鼠和人白色脂肪组织的固定
<ol>
	<li>将收获的小鼠或人白色脂肪组织浸入含有4%多聚甲醛（PFA）的至少10 mL PBS中，置于15 mL塑料管内。</li>
	<li>在室温下，将塑料管置于滚轴摇床上震荡1小时。</li>
	<li>将塑料管置于4 °C滚轴摇床上过夜，以完成固定。 
	注意：本方案适用于较大的脂肪组织样本，例如从正常饮食小鼠获取的完整附睾脂肪垫（≈250 mg - ≈0.6 cm3）。对于更大的样本，例如高脂饮食小鼠的附睾脂肪垫（≈1.5 g - ≈4 cm3）或人脂肪组织样本，尽管透明化方案在整体样本上（通过放大PFA和抗体混合物体积）仍可完全有效，但通常我们会将组织切成约1 g（≈2.5 cm3）的组织块，以保留剩余样本用于额外染色或其他应用。对于PFA固定（步骤1.1），建议使用约为组织体积10倍的液体量。对于抗体混合物（步骤3.1和3.4），应增加体积以完全浸没组织；若组织过大无法放入1.5 mL塑料微量离心管（见材料表），请使用15 mL塑料管（见材料表）。</li>
</ol>
2. 小鼠和人类白色脂肪组织的通透化与饱和处理
<ol>
	<li>用 10 mL PBS 在室温下冲洗固定后的白色脂肪组织 5 分钟，以去除所有残留的 PFA。</li>
	<li>将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.3% 甘氨酸，见材料表）的 15 mL 塑料管中，在室温下置于轨道摇床上以 100 转/分钟（rpm）振荡 1 小时，以淬灭残留的游离醛基。</li>
	<li>将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.2% Triton X-100，见材料表）的 15 mL 塑料管中，在 37 °C 下置于温控轨道摇床上以 100 rpm 振荡 2 小时。</li>
	<li>将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.2% Triton X-100 和 20% DMSO，见材料表）的 15 mL 塑料管中，在 37 °C 下置于温控轨道摇床上以 100 rpm 振荡过夜。</li>
	<li>将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.1% Tween-20（见材料表）、0.1% Triton X-100、0.1% 脱氧胆酸钠（见材料表）和 20% DMSO）的 15 mL 塑料管中，在 37 °C 下置于温控轨道摇床上以 100 rpm 振荡至少 24 小时。</li>
	<li>将组织在含有 10 mL PBS（含 0.2% Triton X-100）的 15 mL 塑料管中用 PBS 冲洗，在室温下置于轨道摇床上以 100 rpm 振荡 1 小时。</li>
	<li>将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，见材料表）的 15 mL 塑料管中，在 37 °C 下置于温控轨道摇床上以 100 rpm 振荡 12 小时，以封闭可能非特异性结合抗体的位点。 
	注意：在步骤 2.7 中，可用与二抗相同物种的血清替代 BSA。</li>
</ol>
3. 小鼠和人类白色脂肪组织的染色步骤
<ol>
	<li>将组织转移至含有 300 µL PBS 的 1.5 mL 塑料微量离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA 及一抗（浓度为冷冻切片染色所用浓度的 10 倍，但每种抗体的最佳浓度需单独评估）。用铝箔包裹管子以避光，并在 37 °C、100 rpm 条件下于温控振荡摇床中振荡至少两&#160;天（参见步骤 1.1 和步骤 3.7.1 的注释）。</li>
	<li>将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡 5 小时。重复此步骤两次。</li>
	<li>将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡一夜至两天。</li>
	<li>将组织转移至含有 300 µL PBS 的 1.5 mL 塑料微量离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA 及二抗（浓度为冷冻切片染色所用浓度的 10 倍）。用铝箔包裹管子以避光，并在 37 °C、100 rpm 条件下于温控振荡摇床中振荡至少两&#160;天（参见步骤 1.1 和步骤 3.7.1 的注释）。</li>
	<li>将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡 5 小时。重复此步骤两次。</li>
	<li>将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡一夜至两天。</li>
	<li>将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡 2 小时。 
	注：若需标记特定结构（如细胞核或肌动蛋白），当仅使用荧光标记的一抗时，应在步骤 3.1 中加入 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI 或等效物）和/或荧光标记的鬼笔环肽；若使用二抗，则应在步骤 3.4 中加入。 
	注：在染色流程中，可使用已与荧光染料偶联的一抗（如流式细胞术中所用抗体），我们推荐此方法以节省时间并提高特异性。尽管如本研究中所示，可使用小鼠来源的一抗，再结合抗小鼠二抗，但我们常观察到因循环免疫球蛋白导致的血管非特异性染色。因此，为避免此问题，强烈推荐使用预先标记的一抗；本文提供了证据表明，流式细胞术中使用的抗体与本实验流程兼容。然而，对于低水平表达的抗原，必须通过二抗进行信号放大；当唯一可用的一抗为小鼠来源时，建议在处死动物时用 PBS 对小鼠进行心脏灌流，持续至少 5 分钟，以清除大部分循环免疫球蛋白，从而减少非特异性染色。</li>
</ol>
小鼠和人类白色脂肪组织的透明化处理步骤
<ol>
	<li>将组织浸入含有10 mL 50%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡2小时。</li>
	<li>将组织浸入含有10 mL 70%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡2小时。</li>
	<li>将组织浸入含有10 mL 95%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡2小时。</li>
	<li>将组织浸入含有10 mL 100%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡2小时。</li>
	<li>将组织浸入含有10 mL 100%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡过夜。</li>
	<li>将组织浸入一个带塑料盖的20 mL玻璃瓶（见材料表）中，瓶内加入5 mL水杨酸甲酯（见材料表），在化学通风橱中避光、室温条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡至少2小时。 
	注意：如有需要，可省略步骤4.3和4.5以显著加快透明化过程，但最终透明效果会略有降低。</li>
</ol>
5. 透明化白色脂肪组织的三维共聚焦成像
<ol>
	<li>将组织转移至配有玻璃底的金属成像室中（参见 材料表在化学通风橱中进行操作，并用新鲜的水杨酸甲酯填充腔室。 
	注意：&#160;为固定组织位置，防止其在腔室中漂浮或侧向移动，可放置多个18 mm圆形玻璃盖玻片（参见 材料表) 将组织放入腔室时，置于组织上方。</li>
	<li>将成像腔室置于倒置共聚焦显微镜上。</li>
	<li>使用低倍物镜（例如 4x 物镜）对组织进行成像，以生成几厘米大小的图像3 整个脂肪组织或人体组织样本的三维图谱。</li>
	<li>在更高放大倍数下选择多个区域进行组织取样。通常使用20倍长工作距离物镜，以获得分辨率与成像深度之间的良好平衡。我们采集深度在600至2000 µm之间的z轴层扫大视野拼接图像。 
	注意：&#160;使用长工作距离物镜对组织进行更深层的成像。</li>
</ol>
6. 从三维脂肪组织图像中提取定量结果
注意：对第5步生成的3D图像堆栈中不同结构进行分割并从中提取定量信息的操作，可以使用现有的多种图像分析软件完成，无论是商业软件还是免费软件均可。在接下来的步骤中，我们描述一种本实验室常规采用的策略，用于利用商业软件从3D脂肪组织图像中提取定量信息（参见材料表）。
<ol>
	<li>将3D图像堆栈转换为软件格式，以释放内存空间。</li>
	<li>分割细胞。
	<ol>
		<li>打开软件中的Cell模块。</li>
		<li>将Cell Detection设置更改为细胞膜染色模式。</li>
		<li>选择用于界定细胞边界的荧光通道（如标记皮层肌动蛋白的鬼笔环肽phalloidin，或巨噬细胞的F4/80、T细胞的TCR-β，或特定免疫细胞亚群的分化簇CD蛋白等细胞膜标记物）。</li>
		<li>设置阈值，并提供预期细胞大小的范围（例如，细胞检测的大小范围为1至200 µm）。</li>
		<li>运行分割程序。将生成一个对应于z轴堆栈的体积图像，其中分割出的细胞以不同颜色编码，相邻细胞显示为不同颜色。</li>
		<li>在统计选项卡中应用统计滤波器（如大小、圆度、圆形度等），以排除分割伪影，或根据细胞大小进一步优化目标细胞的分割结果（例如，脂肪细胞为20–200 µm；巨噬细胞为5–25 µm；淋巴细胞为1–3 µm）。</li>
		<li>从统计选项卡中提取测量值和定量数据（体积、数量、大小、直径等）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞组分（细胞核、囊泡等）或血管作为结构进行分割。 
	注意：尽管丝状结构分割对于研究血管的连通性非常有用，但我们采用表面模块分割来获取血管的大小、体积和直径等数据。实际上，使用丝状结构模块时会丢失对血管尺寸的量化信息。
	<ol>
		<li>打开软件中的Surface模块。</li>
		<li>选择用于特异性标记亚细胞结构以进行三维重建的荧光通道。</li>
		<li>设置阈值，并提供该结构预期直径范围（例如，细胞核为0.5–5 µm；血管为0–100 µm等）。</li>
		<li>运行分割程序。将生成包含已分割细胞结构的体积图像。可从统计选项卡中提取测量值和定量数据（体积、数量、大小、直径等）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将血管作为管状连续体进行分割。 
	注意：尽管丝状结构分割对于研究血管的连通性非常有用，但我们采用表面模块分割来获取血管的大小、体积和直径等数据。实际上，使用丝状结构模块时会丢失对血管尺寸的量化信息。
	<ol>
		<li>打开软件中的Filaments模块。</li>
		<li>选择对应于血管染色的荧光通道。</li>
		<li>设置荧光强度的阈值，并选择合适的预期连接节点数量。</li>
		<li>运行分割程序。将在三维空间中生成代表血管网络的丝状结构。可从统计选项卡中提取测量数据，从而获得包括血管长度、分支数量等在内的定量信息。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation%3A+plasticity+of+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li>
<li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li>
<li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

肥胖等病理进程发展过程中脂肪组织内发生的改变，对于理解疾病背后的机制至关重要。早期揭示脂肪组织中这些机制的研究主要基于整体性方法，例如全脂肪组织蛋白质组学。21流式细胞术22,23和转录组学24,25此外，已有研究致力于通过组织学分析探索脂肪组织中发生 的结构变化。26,27,28,29然而，由于切片尺寸有限，对5-10 µm厚的脂肪组织切片进行分析会限制对重要结构特征的观察。首先，每张切片中仅能检测到少数几个脂肪细胞核，因为每个切片仅代表脂肪细胞的一小部分（1/10）th）。其次，...

肥胖的特征是脂肪组织质量增加，已成为全球主要的公共卫生问题，因为肥胖人群患心血管疾病、2型糖尿病、肝脏疾病和某些癌症的风险增加。
脂肪组织的一项基本生理功能是调节全身的葡萄糖和脂质稳态1,2在饲喂期间，脂肪细胞（即脂肪组织的主要细胞）储存&#160;将餐后提供的过量葡萄糖和脂质转化为甘油三酯。在禁食期间，脂肪细胞将甘油三酯分解为非酯化脂肪酸和甘油，以维持机体的能量需求。在肥胖发展过程中，脂肪组织通过增加脂肪细胞的体积（肥大）和/或数量（增生）而扩张。1，以增加其储存容量。当脂肪组织的扩张达到个体间差异较大的极限时，多余的脂质便会积聚到其他代谢器官中，包括肌肉和肝脏。3,4，导致其功能失常，并引发与肥胖相关的 cardiometabolic 并发症1,5因此，阐明调控脂肪组织扩张的机制是一项关键的临床挑战。
肥胖期间脂肪组织内记录到的形态学改变与其病理性功能障碍相关。已有多种染色方法用于描述脂肪组织的组织结构，包括肌动蛋白6、血管标志物7、脂滴标志物8以及特异性免疫细胞标志物9,10。然而，由于脂肪细胞直径巨大（50 至 200 µm）11，必须在三维空间中分析整个组织的较大区域，才能准确评估肥胖期间观察到的脂肪组织显著结构变化。但由于光线无法穿透不透明的组织，使用荧光显微镜对大块组织样本进行三维成像无法实现。文献中已报道了使组织透明化的清除技术（综述见12），可实现组织透明化并进行深层的全组织荧光显微成像。这些方法为评估健康与病变组织中的三维细胞组织结构提供了前所未有的机会。每种已描述的方法均有其优缺点，因此需根据所研究的组织谨慎选择（综述见13）。事实上，某些方法需要长时间孵育和/或使用昂贵、有毒或难以获得的材料或化合物14,15,16,17,18,19。我们利用一个世纪前Werner Spalteholz用于组织清除的最早化合物之一20，建立了一种操作简便且成本低廉的方案，该方案非常适合在配备常规设备（包括化学通风橱、温控摇床和共聚焦显微镜）的任何实验室中对小鼠和人类所有脂肪组织库进行透明化处理。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Eppendorff tubes - Dutscher</td><td>33528</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 塑料管</td><td>Falcon tubes - Dutscher</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 圆形玻璃盖玻片</td><td>Mariendfeld</td><td>0117580</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 玻璃瓶</td><td>Wheaton</td><td>986546</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Alexa647 标记抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-605-150</td><td>稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>抗兔 Alexa647 标记抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>CD301-PE 抗体</td><td>Biolegend</td><td>BLE145703</td><td>稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>CD31 抗体</td><td>AbCam</td><td>ab215912</td><td>稀释比例：1/50</td></tr><tr><td>商用三维分析软件 - IMARIS</td><td>Oxford instrument</td><td></td><td>含 Cell 模块</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 - Nikon A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>储存浓度：5 mg/mL；稀释比例 1/1000</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Glut4 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53566</td><td>稀释比例：1/50</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>凝集素-DyLight649</td><td>Vector Lab</td><td>DL-1178-1</td><td>储存浓度：2 &amp;micro;g/&amp;micro;L；静脉注射剂量：50 &amp;micro;L/小鼠</td></tr><tr><td>带玻璃底的金属成像腔室 - AttoFluor Chamber</td><td>Thermofisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>水杨酸甲酯</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6752</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin 抗体</td><td>Progen</td><td>651156</td><td>稀释比例：1/50</td></tr><tr><td>Phalloidin-alexa488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td>稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>TCR-&amp;beta;-PB 抗体</td><td>Biolegend</td><td>BLE109225</td><td>稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>TH 抗体</td><td>AbCam</td><td>ab112</td><td>稀释比例：1/50</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P416</td><td></td></tr></tbody></table>

通过水杨酸甲酯透明化与三维成像探究脂肪组织结构

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

肥胖是一个全球性的重大公共卫生问题，会增加患心血管疾病、2型糖尿病和肝脏疾病的风险。肥胖的特征是由于脂肪细胞增生和/或肥大导致脂肪组织（AT）质量增加，从而引起其三维结构的显著重塑。事实上，脂肪组织在肥胖期间的扩张能力对于肥胖相关疾病的发病至关重要。这种脂肪组织的扩张是一种重要的稳态机制，能够适应能量摄入过剩，并避免脂质溢出到其他代谢器官（如肌肉和肝脏）造成有害影响。因此，理解导致脂肪组织扩张功能障碍的结构重塑过程是一个具有重要临床应用价值的基础科学问题。本文中，我们描述了一种简单且快速的透明化方法，该方法在本实验室常规用于通过荧光成像技术研究小鼠和人类白色脂肪组织的形态学特征。这种优化的脂肪组织透明化方法可在任何配备化学通风橱、温控摇床和荧光显微镜的标准实验室中轻松实施。此外，所用化学试剂均易于获取。重要的是，该方法可通过标记多种分子靶点，特异性地可视化脂肪细胞、神经网络和血管网络，以及先天性和适应性免疫细胞的分布，从而解析脂肪组织的三维结构。

通过采用此处描述并在图1中总结的实验步骤，我们成功对人和小鼠的白色脂肪组织进行了染色和光学透明化处理，结果分别如图2A和图2B所示。透明化后的组织被转移至金属成像腔室中进行共聚焦成像（图3A）。组织透明化显著提高了我们所能获取的组织图像的成像深度（图3B和图3C）。利用4倍物镜可在低倍镜下对整个脂肪组织进行三维成像（见补充视频1），从而生成三维图谱，以便选择感兴趣区域，再使用20倍物镜进行高倍镜三维成像（图3D）。高倍镜图像的三维成像深度可达2 mm（图3E）。
该方法可用于标...

本文介绍一种简单、经济且快速的透明化方法，结合多种标记物，通过荧光成像技术解析小鼠和人类白色脂肪组织的三维结构，可同时可视化血管、细胞核、免疫细胞、神经元以及脂滴包被蛋白。

肥胖是全球主要的公共卫生问题，会增加患心血管疾病、2型糖尿病和肝脏疾病的风险。肥胖……

该方案可用于通过三维成像技术分析人源化小鼠脂肪组织的三维结构，有助于将病理功能障碍与脂肪组织的结构变化关联起来。此透明化处理流程极为简便，非常适用于人源化温血小鼠脂肪组织的透明化处理，且相较于其他透明化方案，所用溶剂毒性更低，例如乙醇或水杨酸甲酯。首先，在15毫升塑料管中加入至少10毫升含4%多聚甲醛的PBS溶液，并将收获的小鼠或人白色脂肪组织浸入其中，建议在化学通风橱内操作。将组织置于摇床上，室温下振荡孵育1小时，随后将试管转移至4°C环境中继续在摇床上过夜孵育。次日早晨，用10毫升PBS溶液在室温下清洗固定后的白色脂肪组织5分钟，以彻底去除残留的固定剂，然后将组织转移至另一含有10毫升PBS配制的0.3%甘氨酸溶液的15毫升离心管中，在室温下置于转速为100转/分钟的轨道摇床上孵育1小时。当剩余的游离醛基被淬灭后，将组织浸入含有10毫升含0.2%Triton X-100的PBS溶液的15毫升离心管中，在37°C下振荡孵育2小时。孵育结束后，用10毫升含0.2%Triton X-100和20%DMSO的溶液在37°C下振荡处理组织过夜。次日早晨，将组织转移至一个15毫升塑料离心管中，管内含有10毫升PBS溶液，其中包含0.1%Tween 20、0.1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸钠和20%DMSO，在37°C下振荡孵育至少24小时。孵育结束后，在圆周摇床上用10毫升含0.2% Triton X-100的PBS溶液以每分钟100转的速度冲洗组织1小时。随后将组织浸入含0.2% Triton X-100、10% DMSO和3% BSA的PBS溶液中，在37°C条件下振荡孵育12小时。用于白色脂肪组织的染色。将组织转移至含有感兴趣的一抗、体积为300微升的PBS溶液中，该溶液包含0.2% Triton X-100、10% DMSO和3% BSA，置于1.5毫升微量离心管中，用铝箔包裹避光，并将离心管放入50毫升Falcon管中。将管子置于摇床中，在37°C条件下振荡孵育两天。孵育结束后，在37°C、避光并振荡的条件下，用10毫升含0.2% Triton X-100、10% DMSO和3% BSA的PBS溶液冲洗组织两次，每次5小时。第二次漂洗后，将组织在含有10毫升新鲜的0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA的PBS溶液中，于37°C条件下振荡孵育16至48小时，随后将组织转移至含有300微升PBS配制的0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA溶液的1.5毫升离心管中，并加入适当的二抗，用铝箔包裹避光保护。在37°C摇床上孵育两天后，用10毫升含0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA的PBS溶液于37°C避光振荡洗涤组织两次，每次5小时。第二次洗涤后，将组织漂洗至含有10毫升新鲜0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA的PBS溶液的离心管中，在37°C条件下振荡孵育16至48小时，并避光保护。随后在37摄氏度下，用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）振荡避光洗涤两小时。对于白色脂肪组织透明化处理，在PBS洗涤结束后，将组织浸入含有递增浓度乙醇系列的10毫升溶液中，每个浓度于室温下振荡避光孵育两小时，具体操作如图所示。次日早晨，将组织置于一个带塑料盖的20毫升玻璃瓶中，瓶内含有5毫升水杨酸甲酯，并置于通风橱内。在此阶段，白色脂肪组织仍然清晰可见。将容器置于室温下避光保护，并至少摇晃两小时。白色脂肪组织将完全转化为可移植状态。在通风橱中，将染色并透明化处理后的白色脂肪组织置于配备玻璃底的金属成像腔室内，用于三维共聚焦成像。向腔室内加入新鲜的水杨酸甲酯。通过添加一小片盖玻片以固定组织，并加盖一大片盖玻片密封腔室，完成腔室的封片。将样品室置于倒置共聚焦显微镜载物台上，使用低倍镜对组织进行成像，以生成整个脂肪组织样本的数立方厘米三维图谱。完成三维图谱构建后，采用20倍长工作距离空气物镜（在分辨率与成像深度之间具有良好的平衡）选取多个区域，进行高倍镜下的组织采样。为实现细胞分割，需将三维图像序列转换为软件专用格式，以释放内存空间。在打开软件的细胞模块之前，将细胞检测设置更改为细胞膜染色，并选择用于界定细胞边界的标记物所对应的荧光通道。然后设定阈值，输入预期细胞大小的范围，并运行分割。 透明化处理对人和小鼠白色脂肪组织的影响可直接用肉眼观察。透明化还能显著提高组织成像的深度，便于基于4倍放大进行整个组织的三维成像和三维图谱生成。3D成像技术还可实现对不同感兴趣区域的选取，以20倍放大倍数获取深度达两毫米的图像。脂滴和脂肪细胞可分别通过perilipin和抗GLUT4抗体进行特异性染色。血管可通过CD31抗体或在处死前短时间内静脉注射DyLight 649标记的凝集素进行检测。可使用抗CD301藻红蛋白抗体和抗TCRβ太平洋蓝抗体对巨噬细胞和T细胞进行可视化。外周神经网络可通过抗酪氨酸羟化酶抗体进行检测。利用这些标记方法，可测定脂肪组织中脂肪细胞的平均大小、大小分布以及血管网络密度。遵循所示的占位时间至关重要，因为样品制备不良将无法获得良好的图像质量。该方案可与先进成像系统结合使用，也可与免费的图像分析后处理软件相配合。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过甲基异硫清除和三D成像探索脂肪组织结构

由于肥胖与其他共病之间存在显著且负面的关联，研究脂肪组织在疾病和整体健康中的作用具有重要意义。本文介绍了一种分离和切除脂肪组织库的实验方案，可用于通过原位（in situ）和体外（in...

小鼠脂肪组织的定位、鉴定与切除

目前，白色脂肪组织（WAT）的主要原代培养模型存在关键缺陷，阻碍了药物开发和代谢研究的进展。本文介绍了一种通过将WAT夹在间充质细胞层之间来构建脂肪组织微生理系统的方法。该结构为WAT的原代培养提供了一个稳定且可调节的平台。...

一种用于人体脂肪的微生理平台：夹心式白色脂肪组织

由于脂肪组织含有高含量的脂质，使用传统组织学方法对其进行可视化一直存在挑战。Adipo-Clear...

Adipo-Clear：一种用于脂肪组织三维成像的组织透明化方法

本研究的重点是展示全组织免疫染色与可视化技术作为一种理想的三维成像方法，用于观察脂肪组织的结构及其细胞组分。...

利用整体染色法观察三维白色脂肪组织结构

新生血管形成和交感神经支配在脂肪组织重塑中起着关键作用。然而，在可视化和定量测量脂肪组织方面仍存在技术难题。本文介绍了一种可成功标记并定量比较不同脂肪组织中血管和神经纤维密度的实验方案。...

脂肪组织中血管与神经纤维的共染色

我们描述了一种三维人细胞外基质-脂肪细胞体外培养系统，该系统可用于解析基质和脂肪细胞在脂肪组织代谢表型形成中的作用。...

一种用于研究基质-细胞代谢串扰的人源三维细胞外基质-脂肪细胞共培养模型

健康肌肉组织被肌内脂肪取代是多种人类疾病和病理状态的显著特征。本方案阐述了如何对肌内脂肪进行可视化、成像和定量分析，从而为深入研究肌内脂肪形成的潜在机制提供严谨的方法支持。...

骨骼肌内脂肪形成及其细胞来源的检测指南

前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。...

从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

本文提供了一种实用的小鼠锁骨上棕色脂肪组织解剖及其组织学与基因表达分析的操作流程。...

小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析

本文介绍了一种从人皮下脂肪组织中分离、培养和表型鉴定微血管内皮细胞（hSATMVECs）的实验方案。此外，还描述了一种hSATMVECs与脂肪细胞相互作用的实验模型。...

研究人类皮下脂肪组织中脂肪内皮细胞与脂肪细胞的相互作用

探索使用甲基水杨酸清除技术对小鼠和人类白色脂肪组织进行三维成像的方法。该技术可清晰显示血管、免疫细胞和脂滴结构，为研究脂肪组织病理学提供重要工具。

通过水杨酸甲酯透明化与三维成像探究脂肪组织结构

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