Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

该协议很重要，因为它提供了有关如何准备和注射蚊子胚胎以进行 CRISPR-Cas9 基因组编辑的详细说明。这种显微注射技术的主要优点是它具有很高的蚊子存活率，并允许研究人员确定基因的功能。该协议专为注射属于 Culex 属的蚊子量身定制。

这些蚊子传播多种病原体，包括引起西尼罗河热和圣路易斯脑炎的病毒，以及引起犬心丝虫病和象皮病的丝虫线虫。因此，拥有 CRISPR-Cas9 基因组编辑等工具将使我们能够更好地了解和控制这些重要的疾病因素。注射新鲜产下的昆虫胚胎并获得更高的存活率需要大量的时间、练习和耐心。

因此，我们建议在注射昂贵的材料以产生突变之前，先用彩色盐水溶液注射几个胚胎。首先用注射混合物回填注射针。选择可轻松插入所选注射针后端的针头填充物或凝胶加载尖端。

确保针头填充物的末端和注射针头之间有一点空间。小心吸出一小滴注射液混合物，滴入注射针开始逐渐变细的位置附近。然后将注射针连接到微型注射器上。

将包含胚胎的载玻片放在显微镜载物台上。要打开针头，请使用大约 30 Psi 的起始注射压力，并根据需要进行调整，以提供适当体积的注射混合物。在解剖显微镜下，将针头放在蚊子胚胎上方，然后小心地使用显微作器将针头降低到胚胎上。

一旦针头几乎没有接触胚胎，迅速垂直于针头的长轴移动胚胎。要确定针头是否成功打开，请按下注射扳机，查看是否有任何气泡或注射混合物从针头中逸出。如果没有，请重复将蚊子胚胎靠在针头上，直到针头打开并且在按下扳机时注射混合物逸出。

将第一个蚊子胚胎放在视图中央，确保它处于焦点上，然后将针头放在第一个鸡蛋上。逐渐增加显微镜上的放大倍数，小心地降低针头以使其保持在第一个胚胎的上方。继续进行，直到显微镜达到最高放大倍率，并且胚胎和针头都聚焦。

将胚胎稍微向左移动并降低针头，使其与胚胎处于同一视平面上。使用显微镜载物台轻轻接触胚胎到针尖。蚊子胚胎的狭窄后端应略微偏转。

使用显微镜载物台，将胚胎的后端移动到针头上，观察针头穿透蚊子卵的绒毛膜。针头应刚好穿透膜和胚胎内极细胞的大致位置。将注射混合物放置在该区域，会增加发生突变并在种系中遗传的可能性。

拉动注射扳机一到三次，将注射混合物射入胚胎中。输送少量注射混合物，刚好足以检测到胚胎质中的小空隙。使用载物台将胚胎向右移动，远离针尖。

如果注射顺利，胚胎中应该几乎没有液体泄漏。向下移动载物台，使下一个胚胎位于针头前面。并重复注射。

如果注射混合物似乎没有流出，或者如果拔出针头后有大量液体从胚胎中逸出，请更换注射针头并重新开始。销毁任何未注射或损坏的鸡蛋。注射载玻片上的所有胚胎后，用喷瓶涂抹反渗透水洗去卤烃油。

将水流引导到注射胚胎上方的玻璃盖玻片顶部，让水顺着盖玻片流下，确保水流不要流到胚胎上。用 150 微升水盖住载玻片，并将其放在方形培养皿内的湿滤纸上。在环境室中孵育培养皿，设置为 25 至 27 摄氏度和 70% 至 80% 相对湿度，具有长日光周期。

该方案用于成功注射北方家蚊 Culex pipiens 的胚胎，确保蚊子胚胎的前端延伸到医用敷料条之外，大大提高了幼虫的存活率，并产生能够发育到成年和繁殖的高质量后代。测序显示，大约 10% 的筛选蚊子在第一个向导 RNA 的 Cas9 切割位点附近显示一个小的插入或缺失，这表明极细胞在显微注射过程中被成功靶向。F1 个体成功交配并产生了可行的后代，其中一些还包含突变。

在显微注射昆虫胚胎时，大多数人最初难以打开针头并将胚胎移动到针头上。请记住，培养这些技能需要时间和练习。该协议可以修改或适应以注射其他蚊子甚至其他昆虫物种的胚胎。

除了使用该方案通过靶向 CRISPR-Cas9 基因组编辑敲除基因外，还可以使用相同的技术注射质粒或转座子以敲入基因或产生随机突变。我的实验室目前正在使用这项技术来更好地了解蚊子如何进行日常测量并调节它们的季节性反应。然而，我们研究人员如何使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑来更好地了解几种生物体的生物学特性。