通过微透析芯片法进行蛋白质结晶 原位 X射线衍射研究

本文描述了一种用于在芯片上通过透析法进行蛋白质结晶，并在室温下开展原位X射线衍射实验的微流控芯片的制备方案。这类微芯片的主要优势之一在于其制备材料的选择，使得芯片适用于在室温下进行原位X射线衍射数据采集。芯片上的结晶实验仅需少量蛋白质样品，从而降低了操作这些高价值大分子时的整体成本。

芯片上的结晶过程还消除了传统晶体学实验中通常需要的手动收集脆弱蛋白质晶体的步骤，这些实验常结合低温冷却进行。此外，我们的微芯片采用微透析法实现蛋白质结晶，这是一种基于扩散的方法，旨在通过半透膜平衡沉淀剂浓度，以接近蛋白质结晶所需的过饱和浓度，并能够对结晶条件进行精确且可逆的调控。结合温度控制，微透析可用于在使用同一样品的情况下，通过调节沉淀剂浓度，将成核过程与晶体生长过程分离，从而研究相图。

首先，按10:1的质量比准备50克PDMS硅胶基质及其固化剂。在烧杯中用刮刀将两种组分混合均匀。混合后，将混合物置于真空腔中，以去除所有气泡。

将25克预混好的PDMS加入第一个含有微流控通道和柱状结构图案的SU8模具中，高度约为五毫米。然后将剩余的25克PDMS倒入第二个仅含有柱状结构图案的SU8模具中。将两层PDMS置于338 kelvin的烘箱中固化一小时。

用手术刀沿SU8模具上的图案切割固化的PDMS层，并轻轻将PDMS模具从硅胶母模上剥离。将带有微通道和微柱结构的PDMS模具置于刚性显微镜玻璃载片上，图案面朝上。裁剪一小块再生纤维素透析膜，用于覆盖PDMS模具的中央微柱区域，该区域设计为蛋白质腔室。

透析膜的截留分子量应根据蛋白质样品和结晶溶液中沉淀剂的分子量来选择。然后小心地分离一段干燥的再生纤维素透析膜，剪下一小段已分离的透析膜。

该膜片的尺寸取决于芯片的设计，具体取决于中心柱的尺寸。将透析膜片置于支撑在载玻片上的PDMS模具中心柱上，使其中心柱和通道朝上。

然后将仅带有微柱且微柱朝下的第二块PDMS模具置于已固定在玻片上的PDMS模具上方。对齐两块PDMS模具的所有微柱。再生纤维素透析膜片置于两块PDMS模具的中央微柱之间。

此步制造过程可在光学显微镜下进行，或仅通过仔细目视检查所有微柱的对齐情况。将组装件放入真空室中，干燥30分钟，以去除PDMS模具内截留的气泡，并促进下一步将要描述的光固化NOA树脂的填充。从真空室中取出组装件，通过毛细作用将光固化硫醇烯基树脂NOA 81填充至两片PDMS模具之间的空隙中。

在组件的四个侧面中的三个侧面上涂抹树脂。将组件放入交联仪中，使用辐照度为35毫瓦/平方厘米的准直紫外灯照射8秒，使NOA树脂固化。将一块175微米厚的PMMA材料切割成标准显微镜玻璃载片的尺寸，并从PMMA片材的每一侧剥离塑料保护膜。

完成第一次紫外光照射后，将上层聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具连同其上附着的部分交联的NOA树脂一起，从下层PDMS模具和玻璃载片上取下。轻轻将上层PDMS模具与部分固化的NOA树脂组成的组件压在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）片上。将新的组件放入交联仪中，并再次通过紫外光照射60秒，使NOA树脂完全固化。

小心移除上层的PDMS模具。由完全交联的NOA树脂包埋再生纤维素透析膜并由PMMA片支撑构成的透析芯片已制备完成。使用快速环氧胶将市售接头键合至微流控通道的入口和出口处。

进行液体操作时，根据接头尺寸选择合适直径的聚四氟乙烯（PTFE）管。这些管路用于将结晶溶液引入透析芯片的流体通道中。使用移液器手动将蛋白样品液滴加入位于透析膜正上方的蛋白储存区中。

蛋白液滴的体积取决于所用微芯片的设计，特别是中心柱的体积，可以是0.1或0.3微升。在蛋白储液池周围仔细涂抹一层薄薄的高真空硅脂。

剪下一小块PMMA，轻轻放置在硅脂薄层上方。再剪一段足够大的Kapton胶带，使其能够覆盖住位于蛋白质储液池上方的PMMA片，并粘附在NOA芯片的四周边缘。蛋白质样品即被封装在储液池内，该芯片可用于结晶实验。

首先，通过混合适当体积的缓冲液和沉淀剂溶液，配制约 500 微升的结晶溶液。使用注射器手动或通过自动压力驱动系统，经由流体连接件将结晶溶液注入透析芯片的端点。当流体通道完全充满结晶溶液且无气泡残留时，用 Parafilm 封口膜密封芯片的进样口和出样口。

用移液器吸取适量体积的蛋白质溶液加入蛋白质储液池中，并按照前述方法包埋蛋白质样品。可使用数码相机对蛋白质晶体的生长过程进行观察和记录。在透析微芯片的制备过程中，我们选用了光学透明且生物惰性的材料，这些材料在原位X射线衍射实验中表现出良好的兼容性。

已评估构成芯片蛋白质腔室的材料所产生的背景噪声，这些材料位于X射线束的直接路径上。蛋白质腔室由再生纤维素透析膜、Kapton胶带和两层PMMA组成，其中一层用作微芯片的基底，另一层用于蛋白质样品的封装。本图展示了Kapton胶带、再生纤维素透析膜、PMMA层以及它们组装后的整体所产生的背景噪声。

尽管光固化树脂NOA构成了微芯片的主体部分，但由于其不属于蛋白质样品腔的一部分，因此未被纳入本测量范围。在分辨率低于四埃时，可观察到由X射线与材料相互作用引起的Kapton胶带的弥散环；在四到八埃范围内，可见聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的弥散环；在四到五埃范围内，可见透析膜的弥散环。芯片产生的总背景噪声主要出现在分辨率低于六埃的区域，表明该噪声不会影响溶菌酶高分辨率衍射数据的处理。

将微芯片安装在X射线束前方，使用我们专为原位X射线衍射实验设计的3D打印支架，该支架可同时容纳最多三片芯片。实验旨在评估微芯片结合微透析法在模型可溶性蛋白质片上结晶中的效率。溶菌酶晶体在293开尔文下两种不同条件下生长。

第一种结晶条件包含1.5摩尔的氯化钠和0.1摩尔的乙酸钠。第二种结晶条件包含1摩尔的氯化钠、0.1摩尔的乙酸钠以及30%聚乙二醇400，选择该条件是为了展示微芯片与微透析方法在高分子量沉淀剂及黏稠溶液中的兼容性。结晶实验在静态条件下进行。

在微芯片上生长溶菌酶晶体后，将其用于室温下的原位X射线衍射实验。借助3D打印支撑架将微芯片安装至衍射线束处，从两颗溶菌酶晶体中收集了完整的X射线衍射数据集。经过X射线衍射数据处理后，获得了单颗溶菌酶晶体的电子密度图，分辨率达到1.95 angstrom，如图A所示。图B显示了分辨率为1.85 angstrom时获得的电子密度图。

在合并了从两个不同溶菌酶晶体获得的数据集后，两个电子密度图均显示出详细的结构信息，这些信息可通过在室温下直接对透析微芯片上的单个或多个蛋白质晶体进行原位X射线衍射实验获得。我们展示了用于芯片上蛋白质结晶的微流控装置的制备流程，该装置采用微透析方法，并适用于室温下的原位X射线衍射实验。我们选用了具有高X射线通透性的材料进行制备，适用于原位蛋白质晶体学研究。

利用3D打印的芯片支架，可将芯片直接安装在大分子晶体学光束线上，从而实现衍射数据收集的自动化。该微芯片的多功能性源于采用微透析技术，可逆地调控结晶条件，并利用少量蛋白质样品绘制相图。该装置的原型制作简便，在洁净室环境中使用相对廉价的材料，单日即可制备多达30个微芯片。

我们预计，这些芯片的特性可被用于更具挑战性的蛋白质靶标的串行X射线晶体学研究。