活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

生物组织在三维软环境中生长，细胞在此环境中受到多种力学信号的影响。我们的方法能够以三维方式拉伸凝胶，用于研究生物力学响应。该技术可在进行活体成像的同时，沿凝胶厚度方向实现均匀拉伸。

此外，水凝胶的几何形状可被调控为任意尺寸或形态。了解细胞和细胞外基质如何响应力学刺激，对于揭示组织发育机制和疾病进展过程具有重要意义。这可能推动癌症治疗策略和组织工程模型的潜在发展。

首先使用激光或手动切割器制作一条中间带孔的橡胶条。将疏水膜裁剪成矩形，使其宽度大于硅胶条，并用70%乙醇清洗塑料培养皿。用无尘布擦干后，将密封膜放入培养皿中，并将一条已从一侧去除塑料膜的硅胶条置于每片密封膜的中央。

为了形成纤维蛋白凝胶，将2.5 µL冷的标记纤维蛋白原均匀地加入每条硅胶切口内，确保每个切口的整个周边均与纤维蛋白原接触，注意避免在溶液中产生任何气泡或气穴。立即向每份纤维蛋白原溶液中直接加入2.5 µL冷却的凝血酶，并用移液器小心快速混合溶液，移动移液枪头使整个混合物充分混匀，尽可能形成均一的溶液。混合后，将加盖的培养皿放入培养箱中孵育30分钟，以完成凝胶的聚合。

孵育结束后，向培养皿中加入足量的 PBS 以浸没凝胶硅胶构建体，小心地将每个样品从培养皿中取出，确保密封膜层仍附着在条状物上。从硅胶的一端缓慢地向另一端小心剥离，将密封膜从每片硅胶上仔细分离，然后将条状物放回培养皿中，并将培养皿置于光学显微镜载物台上，以评估样品的状态。将样品装载到拉伸装置上时，先用 PBS 填充浴槽，然后将带有样品凝胶的硅胶条横跨放置在浴槽上方，使条的两端分别置于浴槽的两侧。

放置夹子和织物条，然后拧紧，使所有部件连接成一条直线，中间留有孔洞。将材料置于孔中，在孔的底部固定盖玻片，然后将铝制液体孔放入拉伸装置中。向孔中加入一到两毫升 PBS 细胞培养基，再将织物凝胶构建体放入装置中。

将织物条固定在支架中，使凝胶的切口位于中心位置，然后小心地将销钉插入装置并锁定到位。将另一侧织物固定到主轴上，并将拉伸装置及附着的样品放置在共聚焦显微镜的载物台上。使用USB线将微控制器连接至计算机，并将伺服电机连接至微控制器。

然后在计算机上打开拉伸装置控制模块以对样品进行成像。为确定样品是否适合实验，使用低分辨率实时成像扫描整个凝胶，确定凝胶与切口内壁完全贴附且无撕裂或气泡时的最低Z位置。记录显微镜的Z位置后，扫描凝胶荧光标记与硅胶条界面，以确认凝胶在整个周长范围内与硅胶完全贴附。

扫描完成后，沿 Z 方向移动载物台，直至凝胶中不再有连续性，记录 Z 位置的上限值。然后用 Z 方向的上限值减去下限值，计算样品的厚度。为确定样品的预拉伸位置，点击模块软件中的 Go to Zero Servo POS，确保伺服电机处于零位，并将伺服电机连接到拉伸装置上，操作时需小心，避免对样品施加任何应变。

成像过程中，点击加一按钮，使电机每次顺时针方向转动一度。当切口右侧发生移动时，点击减一按钮，将样品反向转回倒数第二个位置，以保持样品处于最小张力状态。点击“设置最小伺服位置”以设定参考位置，并采集整个凝胶区域的40倍放大、高分辨率、单Z平面拼接图像，作为后续处理分析的基线参考。

当所有图像采集完成后，以每秒一度的速度推进伺服电机，直至达到所需的拉伸幅度。在每个需要进行分析的拉伸幅度下，通过扫描凝胶与硅胶之间的界面，确认凝胶在其整个圆周上均未从硅胶上脱落，然后采集整个凝胶区域的高分辨率平铺Z轴层析图像集，用于后续处理分析。在拉伸凝胶过程中放大图像并手动追踪微珠聚集体，可计算轴向和垂直方向的局部凝胶应变。

通常情况下，轴向应变从硅胶切口边缘到凝胶中心呈相对线性传播，且大于垂直方向的压缩应变。此处展示了典型的未拉伸且相对各向同性的水凝胶，以及在80%切口应变下呈现沿拉伸方向高度取向纤维的水凝胶的高倍显微图像。纤维取向重排的分析显示，纤维取向程度与切口所受外部应变之间在应变达40%时呈近似线性关系，当应变超过40%时则出现中等程度的饱和现象。如本纤维取向分析所示，随着切口所受外部应变的增加，纤维取向程度也随之增加，整体呈现非线性曲线关系。

请注意，凝胶在Z轴厚度方向上的拉伸响应相对均匀。如本初步二维连续材料有限元模拟所示，颜色图谱范围为38%至42%，表明在整个圆形凝胶区域内，凝胶的应变相对均一。确保水凝胶完全贴附于几何切口的内壁至关重要，因为良好的黏附性和连续性是样品可靠拉伸的关键。

通过改变硅胶切口的几何形状，我们可以对细胞施加应变梯度和纤维取向梯度，从而在包埋细胞时分析其对这些梯度的响应。