Name: 实时显微镜成像下的 3D 水凝胶控制应变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 了解三维水凝胶单轴拉伸技术，结合硅橡胶嵌入与活细胞共聚焦显微镜成像，用于研究细胞对机械刺激的生物力学响应。该方法可应用于癌症治疗与组织工程研究。

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本文中部分图示经版权清算中心许可转载：施普林格·自然， 生物医学工程年鉴在实现活细胞显微成像的同时对三维水凝胶施加均匀的z轴应变，A. Roitblat Riba，S. Natan，A. Kolel，H. Rushkin，O. Tchaicheeyan，A. Lesman，版权所有© (2019)
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法与方案主要基于 Roitblat Riba 等人先前的研究41。我们在此提供了 SCyUS 装置的完整计算机辅助设计（CAD）、Python 程序及微控制器代码。
与现有方法相比，本方法的主要优势在于能够从三维水凝胶的周边对其施加应变，且适用于弹性模量低至约100 Pa的极软水凝胶，并可在拉伸过程中进行活细胞共聚焦成像。其他方法通常难以在Z轴方向施加应变场，且在拉伸过程中无法提供原位高倍显微图像，这主要是由于样品与物镜之间的工作距离受限所致。目前大多数可用系统基于二维基底拉伸，难以真实模拟生理组织环境。
该系统的局限性包括聚合后凝胶纤维密度可能存在不一致的均匀性（图7A），尤其是在使用较大凝胶体积或复杂几何形状时。此类非均匀性可能导致凝胶中应变分布和纤维排列不均。此外，在较深的 Z 轴截面（&#62;30 μm）存在光学限制，可能引起纤维...

组织对机械力的响应是多种生物功能的重要组成部分，包括基因表达1、细胞分化2以及组织重塑3。此外，细胞外基质（ECM）在受力作用下发生的改变（如纤维排列和致密化）也会影响细胞行为和组织形成4,5,6。ECM的纤维网状结构具有独特的力学特性，例如非线性弹性、非仿射变形以及塑性变形7,8,9,10,11,12。这些特性影响着细胞及其周围微环境对外部机械力的响应方式13,14。深入理解ECM和组织对机械力的响应机制，将有助于推动组织工程领域的发展，并促进构建更精确的计算模型和理论模型。
目前最常见的机械拉伸样品方法主要集中在含细胞的二维基底上，以研究其对细胞行为的影响。例如，对聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底施加应变，并分析细胞相对于拉伸方向的重新取向角度15,16,17,18,19。然而，针对更接近组织微环境的三维细胞包埋水凝胶在外部拉伸下的响应研究方法则较为有限。开发三维拉伸技术具有重要意义，因为细胞在二维基底上的行为与在三维基质中存在差异20，这些差异包括细胞的重新排列、蛋白表达水平以及迁移模式21,22,23。
可用于实现三维样品拉伸的方法和装置既包括商业化的设备24,25,26,27,28，也包括为实验室研究开发的装置29。这些方法使用可延展的硅胶管30、多孔培养室31、夹具26,32、生物反应器11,33、悬臂梁34,35,36以及磁体37,38。某些技术可产生局部变形三维水凝胶的拉伸，例如通过从凝胶内部两个单点处牵拉针头实现5，而其他技术则允许对整个凝胶本体进行变形16。此外，大多数此类系统专注于分析X-Y平面内的应变场，而对于Z方向的应变场信息则较为有限。另外，仅有少数装置能够实现显微原位成像。原位高倍成像（例如共聚焦显微镜）的主要挑战在于物镜与样品之间的工作距离有限，通常仅为几百微米。那些允许在拉伸过程中进行活体成像的装置，往往牺牲了Z轴方向上应变的均匀性，或者结构相对复杂，难以在其他实验室中复制39,40。
这种拉伸3D水凝胶的方法可在活细胞共聚焦显微镜观察期间施加静态或周期性的单轴应变。该拉伸装置（称为“智能周期性单轴拉伸器——SCyUS”）由3D打印部件和低成本硬件构成，便于其他实验室轻松复制。装置上附有一块市售的硅橡胶，其中心具有特定几何形状的切口。水凝胶组分在该切口内聚合填充。在聚合过程中，生物水凝胶（如纤维蛋白或胶原蛋白）会自然黏附于切口的内壁。通过使用SCyUS，可对硅胶条进行单轴拉伸，从而将可控的应变传递至嵌入的3D水凝胶41。
与现有其他方法相比，该系统具有一系列独特的功能和优势。首先，该系统能够从周边对较厚的三维软水凝胶（&#62;100 µm 厚，&#60;1 kPa 刚度）进行单轴拉伸，且在整个水凝胶中实现 Z 方向均匀的形变。这类水凝胶过于柔软，无法通过传统拉伸技术夹持并拉伸。其次，由于3D打印技术在科研人员中已广泛可及，且设计中所用电子元件成本低廉，拉伸装置可被其他实验室轻松复制。第三，或许也是最具吸引力的特点是，硅胶条上切口的几何形状和尺寸可方便地调节，从而实现可调的应变梯度和边界条件，并可使用多种样品体积，最低可达几微升。
本方案包括在0.5 mm厚的硅橡胶条上制备直径约2 mm的纤维蛋白凝胶圆片，并在活细胞共聚焦显微镜下进行单轴拉伸。下文详细讨论了测量和分析作用于几何切口处的应变、水凝胶内部产生的应变，以及在不同拉伸操作后纤维排列情况的实验步骤。最后，探讨了在水凝胶中包埋细胞并对其施加可控外部拉伸的可能性。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 羧酸琥珀酰亚胺酯</td><td>Invitrogen</td><td>A20002</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养基（DMEM高糖）</td><td>生物工业公司</td><td>01-052-1A</td><td>加入10% FBS、1% PNS、1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠</td></tr><tr><td>盖玻片 #1.5</td><td>Bar-Naor Ltd.</td><td>BN72204-30</td><td>22&amp;times;40 &lt;em&gt;毫米&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 99.5% 气相色谱级 DMSO</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>D-5879-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>生物工业公司</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>EVICEL 人纤维蛋白胶</td><td>Omrix Biopharmaceuticals</td><td>3902</td><td>纤维蛋白原：70 mg/mL，凝血酶：800–1200 IU/&lt;em&gt;mL&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>纤维蛋白原缓冲液</td><td>N/A</td><td></td><td>1升配方：7克 NaCl，2.94克二水合柠檬酸三钠，9克甘氨酸，20克盐酸精氨酸 &amp;amp; 0.15 g 二水合氯化钙。用纯水定容至 1 L（pH 7.0–7.2）</td></tr><tr><td>荧光微珠 FluoSpheres (1 &lt;em&gt;&amp;micro;m&lt;/em&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>F8820</td><td>橙色（540/560）&lt;br/&gt; 以水溶液形式提供（含2%固体成分及2 mM叠氮化钠）</td></tr><tr><td>高温硅橡胶</td><td>McMaster-Carr</td><td>3788T41</td><td>580 &lt;em&gt;&amp;micro;m&lt;/em&gt;厚的&lt;br/&gt; E = 1.5 Mpa&lt;br/&gt; 泊松比 = 0.48&lt;br/&gt; 抗拉强度 = 4.8 MPa&lt;br/&gt; 拉伸上限 = +300% 工程应变</td></tr><tr><td>HiTrap 脱盐柱 5 &lt;em&gt;mL&lt;/em&gt; （Sephadex G-25 填充）</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1408-01</td><td></td></tr><tr><td>HIVAC-G 高真空密封胶</td><td>信越化学工业株式会社</td><td>HIVAC-G 100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ FIJI 软件&lt;sup&gt;39&lt;/sup&gt;</td><td>美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州</td><td>版本 1.8.0_112</td><td></td></tr><tr><td>微控制器（Arduino Uno + Adafruit 电机扩展板 v2.3）</td><td>Arduino/Adafruit</td><td>Arduino-DK001/Adafruit-1438</td><td></td></tr><tr><td>MicroVL 21R 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Primovert 倒置显微镜</td><td>卡尔蔡司苏州有限公司</td><td>491206-0011-000</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS CAD（Solidworks）</td><td>达索系统&amp;egrave;mes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS 代码&lt;sup&gt;37&lt;/sup&gt;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>伺服电机 - TowerPro SG-5010</td><td>Adafruit</td><td>155</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004030</td><td>50 &lt;em&gt;mL&lt;/em&gt; 管</td></tr><tr><td>无菌 10 &lt;em&gt;厘米&lt;/em&gt; 非培养板</td><td>康宁</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶缓冲液</td><td>N/A</td><td></td><td>1升配方：20克甘露醇，8.77克氯化钠，2.72克三水合乙酸钠，24毫升25%人血清白蛋白，5.88克氯化钙。用纯水定容至1升（pH 7.0）</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液 B，0.05% EDTA</td><td>生物工业公司</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>USB线缆（B型公头至A型公头）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 LSM 880 共聚焦显微镜</td><td>卡尔蔡司股份公司</td><td>2811000417</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.3 SP1 FP3（黑色）</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>发布版本 14.0.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

外部力是组织形成、发育和维持的重要因素。这些力的作用通常通过特制的体外拉伸方法进行研究。现有的各种系统采用基于二维基底的拉伸装置，而可用于对软性水凝胶施加应变的三维技术则相对受限。本文介绍一种方法，可通过弹性硅胶条作为样品载体，从软性水凝胶的周边对其进行外部拉伸。本方案所使用的拉伸系统由3D打印部件和低成本电子元件构成，结构简单，易于在其他实验室中复制。实验过程首先是在硅胶条中央的切口处聚合较厚（&#62;100 μm）且柔软的纤维蛋白水凝胶（弹性模量约为100 Pa）。随后将硅胶-凝胶复合物固定于打印的拉伸装置上，并置于共聚焦显微镜载物台上。在活体显微成像过程中启动拉伸装置，对不同拉伸程度下的凝胶进行成像。通过图像处理量化凝胶的形变结果，显示在整个凝胶的三维厚度（Z-轴）方向上应变分布相对均匀，并伴有纤维的取向排列。该方法的优点包括能够在三维条件下对极软的水凝胶施加应变，同时实现原位显微观察，并可根据用户需求自由调节样品的几何形状和尺寸。此外，经过适当调整后，该方法还可用于拉伸其他类型的水凝胶（如胶原蛋白、聚丙烯酰胺或聚乙二醇），并可在更接近生物模拟的三维环境中分析细胞和组织对外部力的响应。

对携带嵌有1 μm荧光微球的三维纤维蛋白水凝胶的硅胶条施加逐渐增加的静态拉伸，所得代表性数据如图9所示。分析结果展示了硅胶拉伸对切口几何形变以及凝胶内部应变发展的影响。Z-堆栈图像用于评估原始圆形切口向椭圆几何形状的变形情况（图9A）。利用这些图像可计算εxx(孔洞)（公式2）。在拉伸水凝胶过程中，放大图像并手动追踪多个微球聚集体（图9B），可计算凝胶中心区域在轴向εxx(gel)和垂直方向εyy(gel)的局部凝胶应变（图9C,D）。轴向应变从硅胶切口边缘向凝胶中心相对线性地传播，且其值大于压缩性的垂直应变（图9D）。<...

本方法涉及在允许活细胞共聚焦显微镜观察的同时，对嵌入硅橡胶中的三维软水凝胶进行单轴拉伸。文中展示了对外部和内部水凝胶应变以及纤维取向的表征。所开发的装置与实验方案可用于评估细胞对不同应变条件的响应。

外部力是组织形成、发育和维持的重要因素。这些力的作用通常通过专门的……进行研究。

生物组织在三维软环境中生长，细胞在此环境中受到多种力学信号的影响。我们的方法能够以三维方式拉伸凝胶，用于研究生物力学响应。该技术可在进行活体成像的同时，沿凝胶厚度方向实现均匀拉伸。此外，水凝胶的几何形状可被调控为任意尺寸或形态。了解细胞和细胞外基质如何响应力学刺激，对于揭示组织发育机制和疾病进展过程具有重要意义。这可能推动癌症治疗策略和组织工程模型的潜在发展。首先使用激光或手动切割器制作一条中间带孔的橡胶条。将疏水膜裁剪成矩形，使其宽度大于硅胶条，并用70%乙醇清洗塑料培养皿。用无尘布擦干后，将密封膜放入培养皿中，并将一条已从一侧去除塑料膜的硅胶条置于每片密封膜的中央。为了形成纤维蛋白凝胶，将2.5 µL冷的标记纤维蛋白原均匀地加入每条硅胶切口内，确保每个切口的整个周边均与纤维蛋白原接触，注意避免在溶液中产生任何气泡或气穴。立即向每份纤维蛋白原溶液中直接加入2.5 µL冷却的凝血酶，并用移液器小心快速混合溶液，移动移液枪头使整个混合物充分混匀，尽可能形成均一的溶液。混合后，将加盖的培养皿放入培养箱中孵育30分钟，以完成凝胶的聚合。孵育结束后，向培养皿中加入足量的 PBS 以浸没凝胶硅胶构建体，小心地将每个样品从培养皿中取出，确保密封膜层仍附着在条状物上。从硅胶的一端缓慢地向另一端小心剥离，将密封膜从每片硅胶上仔细分离，然后将条状物放回培养皿中，并将培养皿置于光学显微镜载物台上，以评估样品的状态。将样品装载到拉伸装置上时，先用 PBS 填充浴槽，然后将带有样品凝胶的硅胶条横跨放置在浴槽上方，使条的两端分别置于浴槽的两侧。放置夹子和织物条，然后拧紧，使所有部件连接成一条直线，中间留有孔洞。将材料置于孔中，在孔的底部固定盖玻片，然后将铝制液体孔放入拉伸装置中。向孔中加入一到两毫升 PBS 细胞培养基，再将织物凝胶构建体放入装置中。将织物条固定在支架中，使凝胶的切口位于中心位置，然后小心地将销钉插入装置并锁定到位。将另一侧织物固定到主轴上，并将拉伸装置及附着的样品放置在共聚焦显微镜的载物台上。使用USB线将微控制器连接至计算机，并将伺服电机连接至微控制器。然后在计算机上打开拉伸装置控制模块以对样品进行成像。为确定样品是否适合实验，使用低分辨率实时成像扫描整个凝胶，确定凝胶与切口内壁完全贴附且无撕裂或气泡时的最低Z位置。记录显微镜的Z位置后，扫描凝胶荧光标记与硅胶条界面，以确认凝胶在整个周长范围内与硅胶完全贴附。扫描完成后，沿 Z 方向移动载物台，直至凝胶中不再有连续性，记录 Z 位置的上限值。然后用 Z 方向的上限值减去下限值，计算样品的厚度。为确定样品的预拉伸位置，点击模块软件中的 Go to Zero Servo POS，确保伺服电机处于零位，并将伺服电机连接到拉伸装置上，操作时需小心，避免对样品施加任何应变。成像过程中，点击加一按钮，使电机每次顺时针方向转动一度。当切口右侧发生移动时，点击减一按钮，将样品反向转回倒数第二个位置，以保持样品处于最小张力状态。点击“设置最小伺服位置”以设定参考位置，并采集整个凝胶区域的40倍放大、高分辨率、单Z平面拼接图像，作为后续处理分析的基线参考。当所有图像采集完成后，以每秒一度的速度推进伺服电机，直至达到所需的拉伸幅度。在每个需要进行分析的拉伸幅度下，通过扫描凝胶与硅胶之间的界面，确认凝胶在其整个圆周上均未从硅胶上脱落，然后采集整个凝胶区域的高分辨率平铺Z轴层析图像集，用于后续处理分析。在拉伸凝胶过程中放大图像并手动追踪微珠聚集体，可计算轴向和垂直方向的局部凝胶应变。通常情况下，轴向应变从硅胶切口边缘到凝胶中心呈相对线性传播，且大于垂直方向的压缩应变。此处展示了典型的未拉伸且相对各向同性的水凝胶，以及在80%切口应变下呈现沿拉伸方向高度取向纤维的水凝胶的高倍显微图像。纤维取向重排的分析显示，纤维取向程度与切口所受外部应变之间在应变达40%时呈近似线性关系，当应变超过40%时则出现中等程度的饱和现象。如本纤维取向分析所示，随着切口所受外部应变的增加，纤维取向程度也随之增加，整体呈现非线性曲线关系。请注意，凝胶在Z轴厚度方向上的拉伸响应相对均匀。如本初步二维连续材料有限元模拟所示，颜色图谱范围为38%至42%，表明在整个圆形凝胶区域内，凝胶的应变相对均一。确保水凝胶完全贴附于几何切口的内壁至关重要，因为良好的黏附性和连续性是样品可靠拉伸的关键。通过改变硅胶切口的几何形状，我们可以对细胞施加应变梯度和纤维取向梯度，从而在包埋细胞时分析其对这些梯度的响应。

controlled-strain-of-3d-hydrogels-under-live-microscopy-imaging

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

实时显微镜成像下的 3D 水凝胶控制应变

我们介绍了将细胞包封于合成水凝胶中的三维（3D）技术方案。文中概述了两种常用的交联方法（迈克尔加成反应和光引发自由基反应）的包封步骤，以及多种用于评估包封后细胞行为的技术。...

用于组织工程的三维水凝胶细胞包封

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活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

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一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

我们介绍一种在三维细胞外基质中控制初始细胞簇形状的方法，以获得可重复的模式形成。采用包含两种不同水凝胶的立方体装置，实现组织模式形成的多方向成像。...

用于可重复图案形成的混合凝胶立方体装置中初始三维细胞簇的控制

利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。...

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

近紫外光刻技术与牵引力显微镜相结合，用于测量细胞在微图案化水凝胶上的作用力。通过靶向光诱导单个细胞释放，可在同一样本上进行大量测量。...

利用水凝胶图案化技术调控细胞黏附在牵引力显微镜中的应用

本方案演示了使用沿流体流动方向具有变化几何结构的微流控通道，以产生拉伸应变（拉伸），从而在三维胶原水凝胶（&lt;250 µm...

微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

本文介绍了一种新型装置，该装置能够在支持细胞于刚度可调且蛋白基质可定制的基底上培养的同时，向细胞施加各向同性和单轴应变波形。这一结构简单且经济的实验平台使研究人员能够在基础研究和与疾病相关的环境中探究机械信号如何调控细胞功能。...

一种新型平台 体外 细胞拉伸与成像

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活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

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