在伤口反应期间斑马鱼中性粒细胞中趋化因子受体的实时成像
2020年12月4日
在这里，我们描述了对斑马鱼嗜中性粒细胞的化学引诱剂受体动力学进行实时成像和定量分析的方案。
中性粒细胞是重要的炎症细胞，响应局部产生的化学配体而浸润伤口。该协议允许在体内响应此类配体的受体动力学可视化。趋化因子受体报告基因的使用可以扩展到其他生理环境，例如感染和肿瘤模型以及其他免疫细胞。
该方法可以跟踪白细胞在组织中感知化学引诱分子的时间和位置。这可以更好地了解免疫反应是如何展开和解决的。对斑马鱼幼虫进行腹鳍损伤需要精细的幼虫作，因此需要对不用于实验目的的幼虫进行一些练习。
在受精后第 2.5 至 3.5 天，将麻醉的斑马鱼幼虫置于荧光解剖镜下，并选择具有转基因受体表达的幼虫。将选定的幼虫转移到含有补充 E3 培养基的 120 毫米培养皿中，并使用无菌手术刀切割每个幼虫的腹鳍，切口足够深，以引起大量的中性粒细胞募集，而无需切割尾部造血组织血管。将 500 μL 2X 三卡因加入玻璃底培养皿中，然后加入 500 μL 琼脂糖溶液，并用移液器吸头轻轻搅拌混合。
使用移液管将受伤的麻醉斑马鱼幼虫转移到培养皿中，并在轻轻向下推的同时横向定位胚胎，使鱼的尾部尽可能靠近玻璃底部。当胚胎就位时，让琼脂糖冷却。5 到 10 分钟后，用小画笔轻轻触摸凝胶以确认凝固，然后向板中加入 2 毫升 E3 培养基，每毫升补充 0.2 毫克三卡因。
使用转盘共聚焦显微镜对伤口部位进行成像。琼脂糖凝固后，尽快将胚胎转移到共聚焦成像转盘平台上，并使用载物台纵杆和显微镜物镜定位鱼。使用 30 至 40 倍物镜，聚焦于伤口区域，然后选择要在伤口周围成像的视野。
选择激光并调整曝光时间，然后设置每 30 秒一次延时摄影所需的持续时间，并获得明场图像以记录视野。要量化伤口部位的中性粒细胞受体内化，请在斐济中打开图像数据集，然后使用时间滑块为每个数据集选择感兴趣的代表性时间范围。在 MATLAB 中，创建一个新脚本，并包含用于图像读取、打开和手动选择感兴趣点的函数。
运行脚本以打开感兴趣的框架，然后单击中性粒细胞进行分析。记录它们在腹鳍伤口和尾部造血组织中的质心的估计。使用活动轮廓技术分割每个帧中的嗜中性粒细胞，并创建脚本以添加每个嗜中性粒细胞的灰度共生矩阵的计算，包括基于灰度共生矩阵的嗜中性粒细胞对比度的计算。
添加命令以单独保存腹鳍中单个中性粒细胞的值，包括计算所有尾部造血组织中性粒细胞的平均中性粒细胞对比度值。包括伤口部位单个嗜中性粒细胞的对比度值与计算的尾部造血组织嗜中性粒细胞的平均对比度的标准化，以获得标准化对比度，该对比度反映了单个反应细胞内受体的外观相对于对照无反应细胞的点状程度。然后单击 run 以运行脚本。
腹鳍损伤后，中性粒细胞从尾部造血组织快速动员到腹鳍，并在损伤诱导后 30 至 60 分钟内聚集在伤口边缘。在该分析中，使用转盘共聚焦显微镜对斑马鱼嗜中性粒细胞表达的趋化因子受体 CXCR1 和 CXCR2 进行成像。使用对比指标量化受体分布模式，该指标报告相邻像素之间的强度差异。
另一种方法是量化受体水平与受控膜标志物水平的比率。使用对比指标检测伤口中性粒细胞簇中的受体内化，可以量化伤口部位中性粒细胞中 CXCR1 和 CXCR2 运输之间的明显差异。例如，在该分析中，位于伤口部位的细胞中荧光标记的 CXCR1 内化随着时间的推移而增加，而荧光标记的 CXCR2 保留在伤口处的中性粒细胞膜上。
通过吗啉代处理抑制 CXCR1 和 CXCR2 配体导致伤口部位荧光标记的 CXCR1 内化差异。此外，在早期胚胎中，荧光标记的 CXCR1 在受体配体共表达的胚胎中显著内化。尝试此方案时，请记住，应在受伤后尽快进行成像，以捕获中性粒细胞募集到伤口期间的受体动力学。
在正常幼虫中趋化因子受体成像后，研究人员可以在炎症失调的突变幼虫中进行比较成像。
概述
本文描述了用于活体成像和定量分析斑马鱼中性粒细胞趋化因子受体动力学的协议。该方法可以在炎症过程中观察受体对化学配体的反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 活体成像技术
背景
- 中性粒细胞在炎症反应中起着至关重要的作用。
- 了解受体动力学可以为免疫反应提供见解。
- 该研究利用斑马鱼作为体内成像的模型生物。
- 该协议可以适用于其他免疫细胞和生理条件。
研究目的
- 观察和分析中性粒细胞中趋化因子受体的动力学。
- 增强对中性粒细胞如何响应损伤的理解。
- 为对免疫细胞行为感兴趣的研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 对麻醉的斑马鱼幼虫进行腹鳍伤口处理。
- 使用旋转圆盘共聚焦显微镜进行成像。
- 使用MATLAB进行受体内化的定量分析。
- 比较CXCR1和CXCR2之间的受体动力学。
主要结果
- 中性粒细胞在30-60分钟内迅速动员到伤口部位。
- 荧光标记的CXCR1显示随时间推移内化增加。
- 观察到CXCR1和CXCR2之间的受体运输差异。
- 对比值的归一化提供了受体活性的见解。
结论
- 该协议允许对中性粒细胞受体动力学进行详细研究。
- 研究结果有助于理解免疫反应机制。
- 未来应用可能扩展到其他炎症模型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding chemokine receptor trafficking dynamics in neutrophils provides mechanistic insights into inflammatory response resolution, a critical factor in de-risking immunomodulatory target validation. Live imaging of receptor internalization enables quantitative assessment of target engagement and pathway modulation in a physiologically relevant disease-relevant system. This approach supports predictive confidence in early discovery by linking subcellular receptor behavior to functional leukocyte migration outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chemokine receptor trafficking as a mechanism for modulating neutrophil recruitment in inflammatory disease models.
- Operational Value: Provides a zebrafish-based disease-relevant system for functional target validation of GPCR-mediated leukocyte guidance pathways.
- Predictive Value: Links receptor internalization dynamics to neutrophil clustering and dispersal, supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative contrast metrics that report differences in receptor intensity between neighboring pixels, enabling assay-ready readouts of receptor activation states.
- Operational Value: Establishes a reproducible imaging and analysis workflow using spinning disk confocal microscopy and MATLAB-based segmentation for high-content receptor dynamics screening.
- Assay Readiness: Supports preparation of validated neutrophil systems for downstream compound screening by establishing baseline receptor trafficking patterns in wound response models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables comparative imaging in mutant larvae with dysregulated inflammation to assess genetic or pharmacological modulation of receptor trafficking.
- Mechanistic De-risking: Differentiates CXCR1 and CXCR2 trafficking patterns to inform target selection based on distinct internalization versus membrane retention profiles.
- Predictive Biomarker Alignment: Normalized contrast values serve as a quantitative readout correlating receptor activity with functional neutrophil responses, supporting biomarker-guided decision making.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional readouts of chemokine receptor activity that bridge molecular target engagement with cellular phenotypic responses in neutrophil-mediated inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chemokine receptor function in leukocyte guidance by visualizing real-time receptor dynamics during wound-induced neutrophil recruitment.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs through contrast metric analysis and normalization to control tissue neutrophils, enabling reliable comparison of receptor states across experimental conditions.
- Analytics: Generates gray level co-occurrence matrix-derived contrast measurements that quantify receptor internalization, providing statistical inputs for comparing CXCR1 and CXCR2 trafficking behaviors.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing comparative imaging in genetically modified zebrafish to model inflammatory dysregulation and assess target modulation effects.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform applicable to other signaling receptors and immune cell types beyond neutrophils in zebrafish larvae.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of chemokine receptor targets through direct visualization of ligand-induced trafficking patterns in physiologically relevant neutrophil responses.
- Operational Value: Standardized workflow for live imaging and quantitative analysis of receptor dynamics, enhancing reproducibility across studies and laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in target validation by revealing differential receptor behaviors that predict functional outcomes in leukocyte recruitment and inflammation resolution.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets based on mechanistic insights into receptor regulation and cellular response fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish larval handling, microsurgery for ventral fin wounding, and fluorescent microscopy.
- Dependent on spinning disk confocal microscopy and image analysis tools such as Fiji and MATLAB for quantification.
- Necessitates standardization of wounding protocols and imaging timing to capture rapid neutrophil recruitment dynamics within 30-60 minutes post-injury.
- Adaptation to other model systems or immune cells requires transgenic receptor expression and optimization of wounding and imaging parameters.
- Practical limitations include the technical skill required for larvae manipulation and the narrow temporal window for capturing early receptor dynamics during inflammation.
