Name: 在伤口反应期间斑马鱼中性粒细胞中趋化因子受体的实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学习利用转盘共聚焦显微镜对斑马鱼幼虫腹鳍伤口进行实时成像，定量分析中性粒细胞趋化因子受体CXCR1和CXCR2的动态内化过程。该方法为研究炎症反应中的免疫细胞行为提供了详细的实验方案。

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感谢Christine Holt和Bill Harris在共聚焦显微镜方面的帮助。感谢Darren Gilmour提供荧光计时器骨架构建体，以及Anna Huttenlocher提供Tol2-Lyz骨架载体。感谢Steve Renshaw提供Tg(mpx:GFP)i114品系。本研究得到英国医学研究理事会（MRC，项目号MR/L019523/1）、惠康信托基金（Wellcome Trust，项目号[204845/Z/16/Z]）、艾萨克·牛顿信托基金（Isaac Newton Trust，项目号[12.21(a)i]）以及艾萨克·牛顿信托基金资助项目19.23(n)的支持。C.C. 受MRC博士培训项目资助，并部分获得惠康信托基金[204845/Z/16/Z]和艾萨克·牛顿信托基金[12.21(a)i]资助。H.W. 受MRC博士培训项目资助。H.P. 受惠康信托基金博士资助（105391/Z/14/Z）支持，并部分获得惠康信托基金[204845/Z/16/Z]、艾萨克·牛顿信托基金[12.21(a)i]资助以及MRC（MR/L019523/1）的支持。

注意：所有斑马鱼的饲养均遵循 ARRIVE 指南以及英国政府内政部《1986 年动物（科学程序）法案》的相关规定。
1. 生成转基因报告斑马鱼幼鱼以成像白细胞中受体的转运
<ol>
	<li>构建基于 Tol2 的载体，用于在特定组织中表达荧光标记的目的受体。针对中性粒细胞，可使用溶菌酶 C15 和髓过氧化物酶基因16 的启动子序列。该载体可设计为与单一荧光蛋白（例如 GFP）融合，或与串联荧光计时器（例如快速折叠的 GFP 与较慢成熟的 tagRFP8,14,17）融合，或采用报告基因 GFP 与对照膜标记物的双顺反子表达9（选择策略时的考虑因素见讨论部分）。 
	注意：该载体不能完全模拟内源性受体的表达水平，但可用于在目标细胞类型中实现较高水平的受体表达。请参考类似受体的相关文献3,5,6,8,9,10,14，以确定荧光标签的插入位置。</li>
	<li>按照标准饲养规范18，在鱼缸中饲养野生型成年雄鱼和雌鱼，并在产卵前一天用隔板将其分隔开。</li>
	<li>在产卵当天，准备用于显微注射的转基因混合液，其中包含 12.5 ng/μL 的 Tol2 DNA 构建体和 17.5 ng/μL 的转座酶 mRNA7。清晨开灯后不久（不同鱼类设施可能存在差异）移除隔板，并在 15 分钟内收集卵用于 mRNA 注射。 
	注意：确保 DNA 溶液无 RNase 污染，以避免混合液中的转座酶 mRNA 被降解。另一种替代方案是分别注射 Tol2 构建体和转座酶溶液。</li>
	<li>按照斑马鱼卵转基因与显微注射的标准操作流程进行操作19。</li>
	<li>将 1 nL 溶液注射至单细胞期胚胎的细胞内。 
	注意：将溶液注射至细胞内部可获得更一致的表达结果，应弃除未能明确注入细胞内的注射样本。选择单细胞期胚胎进行注射，是因为在 2–16 细胞期胚胎中，每个细胞的实际注射体积存在较大变异性。可考虑将单细胞期注射样本与后期阶段的注射样本分开处理，以防其效率不同。</li>
	<li>在当天晚些时候检查已注射的胚胎，并移除未受精或死亡&#160;的卵，以保持胚胎群体的健康状态。</li>
	<li>在受精后 3 天（dpf），在荧光显微镜下筛选幼鱼。标记物将在中性粒细胞中可见，尤其是在富含此类细胞的尾部造血组织（CHT）中。 
	注意：不同构建体所标记的细胞比例有所不同，通常预期有 20–60% 的中性粒细胞表达该构建体。较低的标记比例通常意味着在成鱼阶段需要进行更多的筛选。建议在饲养鱼类前，通过更高分辨率的成像方法，在部分胚胎中验证受体是否正确地定位于细胞膜。</li>
	<li>按照标准饲养规范20培育阳性幼鱼。这些个体代表 F0 代。</li>
	<li>在 3 月龄时，对 F0 代鱼进行筛选以鉴定创始鱼（founder）。将每条鱼与非转基因野生型个体交配，并在 3 dpf 时在解剖显微镜下观察其后代中受体的表达情况。根据转基因效率（因构建体而异），可在部分交配组合中观察到一定比例的阳性后代。 
	注意：在成功的转基因实验中，大约三分之一至一半的成年鱼会产生阳性后代。一个产卵批次中阳性后代的比例取决于插入的转基因拷贝数，通常在 10–60% 之间。记录各批次内的孟德尔分离比有助于识别单拷贝插入的转基因个体（在 F2 代批次中通过观察约 50% 的阳性幼鱼比例可更易识别）20。</li>
	<li>培育阳性后代，这些个体代表 F1 代。</li>
	<li>在 3 月龄时，以相同方式筛选 F1 代成鱼，以建立稳定的 F2 转基因品系。</li>
	<li>在确认转基因在中性粒细胞中特异性表达后，对 F2 代幼鱼开展实验。 
	注意：在转基因过程中，可能会观察到受体表达水平的差异，建议保留多个不同的转基因家系，以便为特定生物学问题选择最合适的表达水平。初步结果可在 F0 或 F1 代幼鱼中获得。</li>
</ol>
2. 收集斑马鱼胚胎以评估白细胞对伤口的反应
<ol>
	<li>建立稳定的转基因报告基因品系后，将成年转基因鱼与雌鱼进行杂交，并于次日早晨收集受精卵。</li>
	<li>在28.5 °C条件下，将胚胎培养于E3培养基（或卵水18）中。</li>
	<li>可选步骤：在受精后24小时（24 hpf），将胚胎置于含有50 mL E3培养基并添加0.003%次氯酸钠的离心管中，孵育5分钟。随后静置数分钟使胚胎沉降至管底，弃去上清液并更换E3培养基，重复此清洗步骤三次。 
	注意：此步骤可控制幼鱼的感染暴露水平，从而可能影响创伤过程中白细胞的行为。</li>
	<li>漂白处理后，将胚胎继续培养于添加0.003% 1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea）的E3培养基中，以抑制黑色素的合成。此处不添加常用于预防真菌感染的亚甲蓝，以尽量减少组织自发荧光。</li>
	<li>让幼鱼自然孵化，并在中性粒细胞数量丰富的3天龄（3 dpf）时使用21。</li>
</ol>
3. 幼虫腹鳍损伤
<ol>
	<li>准备用于造伤的幼鱼。使用2.5–3.5天龄（dpf）的幼鱼，此时中性粒细胞数量丰富。将幼鱼转移至含有160–200 mg/L三卡因MS222的E3培养基中。 
	注意：三卡因浓缩液应预先配制并分装冷冻，使用当天取出解冻。</li>
	<li>将幼鱼置于E3+三卡因培养基中15分钟，以确保其充分麻醉。可用小毛刷或类似工具轻轻触碰幼鱼，检查其反应。</li>
	<li>在荧光解剖显微镜下挑选具有转基因受体表达的幼鱼。</li>
	<li>将幼鱼转移至盛有E3+三卡因培养基的120 mm培养皿中进行造伤。在解剖显微镜下，使用无菌手术刀片对幼鱼腹鳍进行切割（图1）。 
	注意：切割深度应足以引发显著的中性粒细胞募集，但避免损伤尾部造血组织（CHT）中的血管。切口方向应垂直于CHT轴线，切口深度接近但不伤及CHT血管。该操作需要一定练习，初学者应在指导下先使用非本实验目的的幼鱼（例如其他实验多余的幼鱼）进行练习。</li>
</ol>
4. 活体成像用幼虫的制备
<ol>
	<li>通过加热将低熔点琼脂糖（LMP）溶解于E3培养基中，得到2%的液态琼脂糖溶液。</li>
	<li>使该溶液冷却至60 °C。 
	注意：将装有琼脂糖的烧瓶或离心管置于60 °C的培养箱中保温，以防止在不同幼鱼固定过程中琼脂糖凝固。</li>
	<li>用移液器将0.5 mL液态LMP + E3溶液加入玻璃底培养皿中，用于显微成像。</li>
	<li>用移液器将一条已受伤并麻醉的斑马鱼幼鱼连同0.5 mL E3 + 2倍浓度Tricaine溶液一同加入玻璃底培养皿中。</li>
	<li>轻轻混合两种溶液，获得1% LMP/1倍Tricaine琼脂糖/E3溶液，注意避免产生气泡。将胚胎侧向摆放，并轻轻下压，使鱼体尾部尽可能贴近玻璃表面。 
	注意：使用倒置显微镜成像时，待观察组织必须尽可能靠近玻璃底部。幼鱼的定位操作必须迅速，以确保在琼脂糖凝固前完成位置调整。</li>
	<li>让琼脂糖溶液冷却并凝固5–10分钟。可用小号画笔或移液器吸头轻轻触碰琼脂糖凝胶，检测是否已完全凝固。</li>
	<li>琼脂糖完全凝固后，向成像培养皿中加入2 mL E3培养基，并补充0.2 mg/mL Tricaine。</li>
</ol>
5. 活细胞共聚焦成像
注意：在转盘共聚焦显微镜或同等设备上对胚胎进行成像（图2）。也可使用激光扫描显微镜，但其时间分辨率对动态过程的观测限制更大。在将受伤幼体置于显微镜前，应预先设置好成像参数，以便在损伤后尽快开始记录损伤反应。中性粒细胞在损伤后5分钟内即可到达伤口部位，首批到达细胞中的受体可能在此期间发生内化。经过练习，可在损伤后15分钟内即开始成像。
<ol>
	<li>根据制造商说明，打开显微镜：激光器、相机和计算机。</li>
	<li>使用采集软件设置成像参数。根据先前实验选择适用于相应荧光染料的激光器及大致曝光时间（使用488 nm激光采集GFP，使用561 nm激光采集tagRFP）。</li>
	<li>琼脂糖凝固后，尽快将带有固定胚胎的培养板转移至共聚焦成像转盘平台。</li>
	<li>使用显微镜目镜并通过载物台操纵杆在培养皿中寻找斑马鱼。</li>
	<li>使用调焦旋钮对准伤口区域进行聚焦。 
	注意：为便于定位目标区域，可先使用低倍率空气物镜（10×）进行初步观察。</li>
	<li>选择伤口周围待成像的视野区域。使用数值孔径较高的30×或40×物镜以获得足够的分辨率。</li>
	<li>使用软件按钮调节曝光时间，使荧光标记物呈现良好对比度，同时避免信号饱和。 
	注意：为减少荧光暴露并提高延时成像的时间分辨率，曝光时间应尽可能短。激光功率取决于激光器状态，但需调整至能够实现足够低曝光时间以满足动态成像需求的水平。</li>
	<li>使用软件按钮选择成像体积，设置为z轴层扫（z-stack）模式。</li>
	<li>设置每隔30秒进行一次延时成像，持续时间为所需时长。 
	注意：对于无菌性腹鳍伤口，白细胞募集高峰通常在2–3小时内出现。</li>
	<li>启动延时成像前，先拍摄一幅明场快照以记录视野位置。如有可能，将明场图像纳入延时视频序列中一并采集。</li>
</ol>
6. 斑马鱼中性粒细胞受体内化作用的定量分析
<ol>
	<li>记录图像采集的时间间隔和图像的像素大小。记录成像开始时距损伤后的分钟数。</li>
	<li>使用 Fiji 软件通过将图像拖拽至软件界面打开图像数据集，利用时间滑块为每个数据集选择一个具有代表性的感兴趣时间帧（例如，伤口处理后 1–1.5 小时），并保存该图像。</li>
	<li>使用 MATLAB 处理图像数据集。</li>
	<li>创建一个新脚本，并包含用于图像读取的函数（在名为“select_neutrophils.m”的脚本第6行中用于定义质心） 补充文件 1），打开（第11行 补充文件 1）以及在图像上手动选择点（第12行 补充文件 1).</li>
	<li>运行此脚本以打开感兴趣的帧（补充文件 1），通过目视观察确定待分析的中性粒细胞，点击细胞并记录其在腹鳍伤口和尾部造血组织（CHT）中的中心位置估算值。 
	注意：CHT 中未迁移的中性粒细胞可作为受体内受体分布保持恒定的内部参照，从而可将伤口处细胞的对比度值相对于该内部参照进行归一化处理。</li>
	<li>使用主动轮廓技术对每帧中的中性粒细胞进行分割22 如下述步骤所述。</li>
	<li>创建一个函数，用于包含主动轮廓分割所需的元数据（即迭代次数、轮廓偏置、估计质心等）。22 （参见“wound data.m”文件） 补充文件 2).</li>
	<li>创建一个脚本，调用函数 'wound_data.m' 以输入每个中性粒细胞分割所需的必要信息（位于名为 'calc_contrast.m' 的脚本的第 28 行） 补充文件 3).</li>
	<li>在脚本中包含图像读取命令（第32行） 补充文件 3).</li>
	<li>添加生成一幅与输入图像大小相同的黑色图像（即像素值为零的图像）（第44行） 补充文件 3）以及在每个中性粒细胞质心周围定义一个 10 × 10 像素的方形区域（第 45 行 补充文件 3).</li>
	<li>使用主动轮廓模型进行中性粒细胞分割（补充文件3第48-49行）以及去除微小的误检对象（补充文件3第52行） 补充文件 3). 
	注意：初始分割轮廓为围绕质心的方形，该轮廓通过基于像素强度、迭代次数和轮廓偏置的主动轮廓技术进行演化。分割结果为二值掩膜，其中所有像素值为0，中性粒细胞区域的像素值为1。</li>
	<li>将分割后的二值图像与原始图像相乘，以仅获得中性粒细胞的像素强度，图像其余部分为非数值（not-a-number），因此不会参与计算（第56–57行） 补充文件 3).</li>
	<li>添加对每个中性粒细胞的灰度共生矩阵（GLCM）的计算14,23 （第61行） 补充文件 3灰度共生矩阵（GLCM）是另一种图像表示方法，用于描述像素在灰度强度方面的相对位置关系。</li>
	<li>基于GLCM的中性粒细胞对比度计算（第62、65行） 补充文件 3对比度度量用于测量相邻像素间强度的差异。将像素与相隔一定距离的像素进行比较，该距离可根据强度局部峰值的大小凭经验调整。例如，对于像素大小为0.389 µm的图像，当受体呈小泡状分布时，每个亮斑的直径约为5个像素，因此在相距5个像素的像素之间比较强度。</li>
	<li>添加命令，以分别保存腹鳍中单个中性粒细胞的数值（第68行） 补充文件 3).</li>
	<li>以与伤口处中性粒细胞相同的方法（补充文件3第72-119行），计算所有CHT中性粒细胞的平均对比度值。对于CHT中性粒细胞，调用函数‘cht_data.m’（第77行）。 补充文件 4).</li>
	<li>将单个中性粒细胞在伤口处的对比度值除以上述步骤6.16中计算的CHT中性粒细胞平均对比度值，进行归一化处理（即除法运算）（第122行） 补充文件 3）。这提供了一种标准化的对比度，反映了受体在单个应答细胞中的点状外观相对于对照非应答细胞的程度。图3 和 图4).</li>
	<li>运行脚本（补充文件 3) 单击软件中的运行符号以执行。</li>
	<li>针对不同条件重复所有步骤。</li>
	<li>使用统计软件（参见 材料表) 通过创建柱状图表格导入不同条件下的结果，绘制结果图表，并进行统计学检验以评估各组均值间差异的显著性。 
	注意：分析所用代码也可在 GitHub 获取，网址为 https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic</li>
</ol>
7. 早期胚胎中趋化因子反应检测
注意：这是一个可选的辅助实验，可用于检测候选趋化因子对受体分布变化的影响，且独立于上述关于中性粒细胞表达受体构建体的实验。由于该技术中配体浓度处于饱和状态，因此难以通过此方法明确不同受体之间在配体诱导的转运方面的差异14。然而，若在此系统中观察到受体发生配体内化现象，则可能提示该受体能够识别该配体，尤其在配体身份尚不明确的情况下具有参考价值。这一方法具有实用性，因为在HEK293T细胞等已建立的细胞系中表达趋化因子受体往往较为繁琐14。
<ol>
	<li>设置野生型鱼（如AB品系）的杂交，于次日清晨移除隔离板后尽快收集卵（方法如上所述）。</li>
	<li>注射100 pg荧光标记的受体mRNA（例如Cxcr1-FT），同时注射100 pg膜标记mRNA（例如membrane CFP）。在混合物中加入不同剂量的趋化因子配体mRNA。 
	注意：作为参考，150&#8201;pg Cxcl8a mRNA 导致荧光标记的 Cxcr1-FT 显著内化（参见 图5).</li>
	<li>用E3培养基冲洗胚胎，并在28°C下孵育。</li>
	<li>在约7 hpf时，使用荧光体视显微镜检测mRNA的表达情况，并挑选用于成像的胚胎。</li>
	<li>提前配制 0.8% LMP 琼脂糖，置于玻璃管中，并在 60 ˚C 加热块中保温。使用玻璃移液管操作胚胎。用双手各持一把镊子轻轻去除胚胎的卵膜。</li>
	<li>用玻璃移液管吸取单个去壳胚胎，确保管尖无气泡。轻柔地将胚胎释放至琼脂糖管中，使其自然沉入管底。</li>
	<li>从琼脂糖管中吸出胚胎，同时收集部分液态琼脂糖。轻柔地将胚胎释放至玻璃底成像培养皿的中央。迅速旋转胚胎，使其动物极朝向培养皿底部（使用倒置显微镜时，此侧必须最接近物镜）。 
	注意：在琼脂糖尚未完全凝固时，可能需要调整胚胎的方向。</li>
	<li>琼脂糖凝固后，加入 2 mL E3 培养基。 
	注意：此阶段的胚胎相比幼虫极为脆弱，去壳和装片操作需要一定熟练度。吸取和释放过程应尽可能轻柔，以避免胚胎破裂。</li>
	<li>重复该过程，目标是每皿加载3-5个胚胎。</li>
	<li>在倒置共聚焦显微镜下对胚胎进行成像（参见 材料表）。使用40倍/1.3 NA油镜以获得足够高的分辨率。使用405、488和552 nm激光分别观察mCFP、sfGFP和tagRFP。&#8201;nm。调整滤光片和设置，以获得高对比度，同时避免信号饱和，并尽量减少通道间的串扰。</li>
	<li>对不同条件重复进行封片和成像。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突

本方法可在组织损伤引发的炎症反应过程中，对内源性配体刺激下的受体动态进行原位活体成像。Cxcr1/Cxcr2中性粒细胞报告系统可进一步拓展至其他生理环境，例如感染、肿瘤模型或其他类型的组织损伤14,25,26,27。此外，转基因挽救品系（即内源性受体被抑制并由外源性突变受体挽救）可为解析特定中性粒细胞迁移模式在免疫应答中的重要性提供有力工具。例如，脱敏功能受损的Cxcr1受体突变体会导致中性粒细胞在炎症部位更显著地聚集14。这种功能获得型表型可用于研究中性粒细胞聚集在不同生理过程中的作用，如伤口修复、感染性疾病或肿瘤演化，并可与补体受体敲低/敲除实验相互补充。该方法还为拓展现有报告系统的种类提供了基础。荧光报告分子的选择至关重要，需根据具体生物学问题而定。我们发现，与上皮细胞相比，这些趋化因子受体在中性粒细胞中的组成性周转速率较高，因此需要成熟速度快的报告蛋白（如sfGFP），以准确反映稳态下的膜表面受体水平，并在中性粒细胞受到刺激后分辨其变化8,14。因此，sfGFP/tagRFP的膜信号比值不适用于测量此类细胞中配体诱导的受体内化，但tagRFP的信号分布模式可用于追踪受体的胞内命运，在某些研究中具有应用价值。我们还发现，tagRFP较强的胞内信号浓度有助于对单个幼鱼进行筛选。另一种测量细胞膜表面受体水平的方法是在中性粒细胞中共同表达荧光膜标记物，该标记物可位于同一转基因元件内9，也可位于独立的转基因元件中14。前者可提供额外的鱼类筛选手段，且标记物与受体的表达水平具有可比性；后者则更具模块化优势，使得携带受体报告系统的斑马鱼品系可与不同的报告品系组合使用。无论采用哪种方式，均需注意，在聚集的中性粒细胞中对受体水平进行膜定位定量存在挑战（见下文）。最后需要指出的是，本方案的一个可能延伸应用是：在活体成像之后，进行免疫组织化学染色，以实现更精细的定位分析。
Tol2 转基因系统已得到充分建立7，且溶菌酶 C 启动子已被广泛用于中性粒细胞的表达11,15。因此，该转基因方法相对简单，并且使用此启动子所达到的表达水平足以提供足够的对比度，以分析受体动态。一个可能的局限性在于，该表达水平无法完全模拟内源性受体的表达水平。可利用新兴的 CRISPR 技术构建特定受体的基因敲入品系28。然而，这些技术目前仍较为繁琐，且未必能保证亚细胞成像所需的表达水平；但若成功开发，将对理解内源性信号动态具有重要意义。对于转基因受体构建体的数据解读而言，功能验证至关重要。例如，可通过配体识别实验来确认荧光融合蛋白具有正常功能，或通过挽救基因敲除表型来验证转基因中性粒细胞的表达水平是否与功能相容14。最后，更直接的受体融合验证方法是采用体外功能实验，将标记的受体与未标记的受体版本进行平行比较14。
该定量方法解决了在体内中性粒细胞中准确进行膜分割所面临的特定困难。对于上皮性质的细胞，可通过将膜受体水平归一化至一个对照标记物来自动执行受体水平的定量，该标记物可与目标蛋白串联表达或单独表达9。事实上，我们在使用原肠胚形成胚胎中的配体识别实验时已应用过此类方法14。然而，中性粒细胞在体内会发生复杂且快速的形态变化，使得在二维和三维条件下均难以实现膜的准确分割14。当多个中性粒细胞聚集时，这一挑战更为突出，而细胞聚集在多种生理环境中普遍存在29。对比度指标克服了这一局限性，因其无需进行膜分割，而是反映细胞内受体分布的整体状态（膜状/平滑型 vs. 囊泡状/点状）。需要注意的是，图像的整体对比度可能会影响对比度指标的数值，因此必须将单个细胞的数值归一化至一个内部参照，以校正不同胚胎或样本间信号强度的差异。例如，我们曾采用尾部造血组织（CHT）中无反应性中性粒细胞的平均对比度值作为参照（即保持静止、未迁移至腹鳍的中性粒细胞）14。另一种可行方案是使用同一细胞内对照标记物的对比度值进行归一化。当缺乏无反应性细胞作为内部参照时，该方法可提供解决方案，并可能更精确地揭示不同条件下受体动态的细微定量差异。
成像位置是另一个需要考虑的因素。此处选择腹鳍伤口而非更常用的尾鳍伤口模型16,30的原因在于，伤口位置靠近中性粒细胞的驻留位置或迁移起始位置。这可以加快实验的时间进程，因为中性粒细胞到达伤口所需时间相对较短。此外，该模型还提供了同时捕捉细胞在迁移起始位置（CHT）和目标位置（伤口）行为的机会。这一点在此尤为重要，因为亚细胞成像所需的高空间和时间分辨率难以与大视野或多位置扫描相结合。因此，腹鳍伤口实验能够追踪迁移反应从起始位置的动态演变过程，同时记录未响应细胞中非特异性受体的波动情况。如上所述，后者在定量分析中具有重要意义，可作为非特异性动态的内部参照。在其他系统中，可能无法获得此类内部参照，此时共表达的膜标记物的对比度值可作为替代对照。
总之，我们预计该方法可适用于其他系统，并可用于多种目的。例如，相同的报告系统可用于其他炎症环境，如感染环境或其他疾病模型。斑马鱼受体报告系统品系的种类可扩展至其他信号受体，以研究信号传导机制或在活体中报告配体动态变化。该方法可与基因敲低/敲除技术结合，以探究所观察到的动态现象的分子机制。例如，干扰配体表达可揭示所观察到的受体动态对配体的依赖性。未来，我们设想该系统可进一步优化，将报告系统通过基因敲入方式插入基因组。最终，利用该方法所得的研究成果将不仅对斑马鱼研究领域具有重要价值，鉴于这些信号受体在哺乳动物中的保守性以及在较大生物体中开展类似研究的相对困难，其发现也将为更广泛的生物学研究提供新的见解。

白细胞迁移对免疫应答至关重要。免疫细胞是典型的迁移性细胞，具有极强的能力穿越组织和血管，并感知多种化学导向信号，从而定向迁移到微生物或其他重要的宿主细胞所在位置。正确的导向依赖于对趋化因子的识别，其中趋化因子受体是最主要的类别1。趋化因子由高度特异性的七次跨膜G蛋白偶联受体识别。当趋化因子与受体结合后，受体构象发生改变，导致相关三聚体G蛋白被激活并解离为具有功能的信号亚基，进而促进细胞骨架的改变和定向迁移1。随后，趋化因子受体会被磷酸化，这一修饰导致细胞对趋化因子的敏感性降低，之后可能发生快速再敏感化/再循环，或发生细胞内降解以及从细胞表面下调2。这些受体动态变化影响细胞接收到的信号持续时间和剂量，但其如何影响白细胞在体内的迁移行为仍难以阐明。
在传统的哺乳动物系统中，追踪活体白细胞受体动态面临诸多挑战。进行活体研究时，必须在细胞中表达与荧光蛋白融合的受体。然而在原代白细胞，尤其是中性粒细胞中实现这一操作十分困难，迄今为止的研究多采用中性粒细胞替代细胞系来表达趋化因子受体3,4。构建转基因小鼠模型——使白细胞表达荧光标记的受体或具有明确转运缺陷的突变受体5,6——需要耗费大量时间和资源。即使在这些模型中，活体动物内成像受体动态的分辨率和对比度仍可能受限，因此部分研究仍依赖对固定组织切片进行免疫组织化学分析5。鉴于上述技术难题，目前我们对趋化因子受体动态如何影响活体组织环境中细胞行为的理解仍然十分有限。
本文提供了一种用于监测斑马鱼中性粒细胞受体转运的方法。斑马鱼与小鼠类似，具有良好的遗传可操作性，但通过高效的转座子系统和对受精卵的直接操作，其转基因过程相对更为简便7。其透明的幼体非常适合活体成像。通过表达与荧光报告分子融合的相应蛋白，已有研究实现了原始生殖细胞和侧线原基中趋化因子受体动态的可视化8,9,10。斑马鱼幼体拥有成熟的中性粒细胞，这些细胞在基因和细胞特性方面与哺乳动物中性粒细胞高度保守。通过构建相应的转基因品系，研究人员已实现了对这些细胞中亚细胞信号动态（如细胞骨架动态和极性调控因子）的可视化观察11,12,13。最近，我们对中性粒细胞在组织损伤引发的炎症反应过程中趋化因子受体的动态变化进行了可视化观察和功能分析14。在此，我们描述了用于中性粒细胞趋化因子信号研究的转基因报告品系的构建方法、用于活体成像的胚胎制备、研究中性粒细胞信号的伤口实验，以及图像采集与分析的操作流程。此外，我们还提供了一个辅助实验方案，用于检测趋化因子受体对候选配体的响应，这在研究尚未明确特征的受体配体识别模式时尤为有用。这些技术可与其他遗传操作手段联合使用，例如抑制内源性趋化因子的表达，或构建具有配体诱导转运异常的突变型受体，以探究特定信号动态如何影响白细胞在体内的行为。表达荧光标记趋化因子受体的转基因品系还可作为内源性趋化因子梯度的报告系统，而此类梯度通常难以通过直接抗体染色进行检测。本方法为拓展其他免疫信号受体报告系统的构建提供了可行路径。

<table><tbody><tr><td>1-苯基-2-硫脲</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL CellStar 离心管</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>克拉克毛细管玻璃</td><td>哈佛仪器公司</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline 超薄漂白剂</td><td>科学实验室用品</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>解剖范围</td><td>尼康</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Block加热器</td><td>特内</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子，珠宝匠用杜蒙特5号</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底细胞培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德玻璃吸管</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 体外转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc.，美国马萨诸塞州纳蒂克</td><td></td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>显微注射系统</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>微载样移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer 转盘式超景深成像系统 UltraVIEW ERS，Olympus IX81 转盘式共聚焦显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（120 mm）</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)加尾试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小号画笔</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research LMM5 激光模块</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片编号23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity 软件</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>横河CSU10转盘共聚焦扫描仪</td><td>横河</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼中性粒细胞在伤口反应期间趋化因子受体的活体成像

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

白细胞通过化学梯度引导对免疫反应至关重要。中性粒细胞是首先被招募到组织损伤部位的细胞，它们在该部位执行关键的抗微生物功能。这些细胞向损伤位点的迁移由多种炎症性趋化因子（包括趋化因子）协调调控。在分子水平上，趋化因子信号传导受到相应受体内吞运输的调控。然而，目前尚不清楚趋化因子受体在亚细胞层面的变化如何影响白细胞在细胞和组织水平上的迁移动态。本文介绍了一种用于在组织损伤引发的炎症反应过程中，对中性粒细胞内趋化因子受体动态进行活体成像与定量分析的方法。这些工具揭示了斑马鱼中性粒细胞中趋化因子受体运输的差异性可协调中性粒细胞在组织损伤部位的聚集与分散，这对理解炎症反应如何实现自我消退具有重要意义。所描述的技术可用于研究中性粒细胞在多种生理和病理条件下的迁移模式，并且该方法也可拓展至其他信号受体的研究。

腹鳍损伤后，嗜中性粒细胞在30–60分钟内迅速从尾部造血组织（CHT） mobilize 至腹鳍，并在伤口边缘聚集。图1）。我们对斑马鱼中性粒细胞表达的两种趋化因子受体Cxcr1和Cxcr2的分布进行了可视化观察24 并识别 Cxcl8a 和 Cxcl8b14，使用转盘共聚焦显微镜观察。我们构建了两个相应的转基因品系，Tg(lyz:Cxcr1-FT) 和 Tg(lyz：Cxcr2-FT），其中中性粒细胞表达受体的荧光计时器（FT）构建体，即与sfGFP和tagRFP串联融合的构建体图2 和参考文献14）。使用这两种荧光染料旨在监测受体多种不同的命运，并评估受体蛋白在质膜上的周转时间，因为新合成的受体呈绿色荧光，随着其老化会逐渐转变为红色荧光8,14然而，这些受体在中性粒细胞质膜上表现出快速的组成型转换，其驻留时间短于tagRFP的成熟时间，因此在稳态下sfGFP显示膜定位，而tagRFP显示囊泡定位补充视频 1 以及参考文献14）。因此，我们聚焦于sfGFP的分布，以监测配体诱导的在组织损伤部位的内化过程。受体分布模式通过对比度指标进行量化，该指标反映相邻像素间强度的差异。其原理在于：当受体分布呈膜状且均匀时，对比度值较低；当受体分布呈囊泡状且更为点状时，对比度值则较高（图3).
另一种方法是量化受体水平（sfGFP 荧光强度）相对于对照膜标记物（如膜定位的 CFP（mCFP））的比值（图 3）。这两种方法均可检测受体的内化，表现为细胞内整体上受体分布更呈囊泡样（对比度值更高）或膜上受体水平降低（sfGFP/mCFP 比值更低）。然而，对比度指标还可用于检测伤口处中性粒细胞簇中的受体内化，而在这些区域，膜分割的准确性较低，因而不适用（图 3）。利用该指标，我们能够量化伤口处中性粒细胞中 Cxcr1 与 Cxcr2 转运行为的可见差异（图 4 和 补充视频 2）。Cxcr1-FT 在伤口处的细胞中发生内化，而 Cxcr2-FT 在伤口处的中性粒细胞中仍保留在膜上（图 4A-C、补充视频 2 和 补充视频 3）。通过吗啉代寡核苷酸处理抑制 Cxcl8a 和 Cxcl8b 后，对伤口处 Cxcr1-FT 内化的影响存在差异（图 4C,D）。为进一步验证 Cxcr1-FT 对 Cxcl8a 的响应，我们在早期胚胎中进行了趋化因子应答实验。结果发现，在共表达 Cxcl8a 的胚胎中，Cxcr1-FT 显著发生内化（图 5）。综上所述，这些结果表明，所描述的方法可用于测量中性粒细胞中趋化因子诱导的受体内化，并确定介导这些效应的配体身份。
<img alt="中性粒细胞迁移示意图及显微镜图像，显示斑马鱼血管系统对伤口的反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：中性粒细胞向腹鳍伤口迁移。（A）（左）3天龄幼鱼示意图，显示尾部造血组织（CHT）、静脉循环（VC，蓝色）、腹鳍（VF）及伤口位置。（右）示意图展示伤口区域（W），中性粒细胞从CHT被动员并聚集于伤口处。CHT组织的尾静脉丛（CVP）以蓝色绘制。（B）明场图像（左）和共聚焦投影图像（右），显示Tg(mpx:GFP)幼鱼在造伤后2小时的腹鳍伤口及中性粒细胞分布情况。虚线表示VF和CHT的轮廓。比例尺 = 25 µm。示意图和荧光图像修改自参考文献14（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="转基因斑马鱼趋化性与动员、lyz 启动子图解、荧光显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：中性粒细胞中趋化因子受体转运的活体成像。（A）用于中性粒细胞特异性转基因表达 Cxcr1-FT（荧光计时器）和 Cxcr2-FT 的构建体。3 日龄转基因幼鱼头部中性粒细胞的共聚焦投影图像（Tg(lyz:Cxcr1-FT)，上图；Tg(lyz:Cxcr2-FT)，下图），显示 tRFP（品红色）和 sfGFP（绿色）通道。比例尺 = 20 µm。（B）3 日龄幼鱼的解剖示意图，同 图 1A。幼鱼下方的示意图展示了伤口区域（W），中性粒细胞从中动脉-静脉毛细血管丛（CHT）动员（上图）或进入腹鳍后执行趋化运动（下图）。虚线方框表示右侧快照中成像的区域。（C）Tg(lyz:Cxcr1-FT) 幼鱼中的中性粒细胞（显示 sfGFP）从中动脉-静脉毛细血管丛（CHT）动员（上图）或向伤口趋化（下图）。箭头表示随时间变化的同一细胞。右侧图像的时间点表示自左侧图像起经过的分钟数。比例尺 = 10 µm。（D）趋化因子受体转运活体成像实验方法的示意图。图 A-C 改编自参考文献14（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞轮廓分割过程；GFP对比度与CFP/GFP比值分析；显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：受体动态的定量分析示例。对伤口处的单个（蓝色）或成簇中性粒细胞（绿色），以及尾部造血组织（CHT）中未迁移的中性粒细胞（红色、橙色）采用不同方法进行分割与分析，以比较结果。同一示例细胞通过两种方法进行分析，以关联图像中观察到的内容与提取的数值范围。(A) 基于sfGFP通道中的轮廓定义，对选定的示例细胞表面进行分割。(B) 计算A图中所示示例细胞的对比度。(C) 基于CFP通道中的轮廓定义，对选定的示例细胞膜进行分割，随后进行sfGFP/CFP比值分析。(D) 对C图中所示示例细胞计算sfGFP/CFP比值。误差线表示来自单个细胞的标准误（S.E.M.）；当n&gt;1时，此处数值未用于统计分析，仅用于展示不同定量方法所获得的测量结果。比例尺 = 10 µm。本图改编自参考文献14（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼伤口反应的显微图像和图表；sfGFP表达；Cxcr1/Cxcr2分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：Cxcr1与Cxcr2在伤口响应中的差异性动态变化。（A）Tg(lyz:Cxcr1-FT) 或 Tg(lyz:Cxcr2-FT) 幼鱼在受伤后80分钟时伤口处中性粒细胞的共聚焦投影图像（显示sfGFP通道）。比例尺 = 10 µm。（B）伤口处Cxcr1-FT中性粒细胞（左）与Cxcr2-FT中性粒细胞（右）的放大图像。绿色受体以灰色显示。比例尺 = 5 µm。（C）归一化对比度（每个中性粒细胞的对比度相对于CHT中未动员细胞的平均对比度进行归一化）。cxcl8a 表示注射针对 cxcl8a 的剪接阻断型和翻译阻断型吗啉代寡核苷酸；cxcl8b 表示注射针对 cxcl8b 的剪接阻断型吗啉代寡核苷酸。对于Tg(lyz:Cxcr1-FT)：来自8条幼鱼的n=24个细胞（CHT），n=47个细胞（伤口）；对于注射吗啉代寡核苷酸的Tg(lyz:Cxcr1-FT)：来自5条幼鱼的n=28个细胞（Cxcl8a-MO），来自5条幼鱼的n=16个细胞（Cxcl8b-MO）；对于Tg(lyz:Cxcr2-FT)：来自3条幼鱼的n=10个细胞（CHT）和n=20个细胞（伤口）。数据来自1–5次独立成像实验中获取的幼鱼。Tg(lyz:Cxcr1-FT)组采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn多重比较检验，Tg(lyz:Cxcr2-FT)组采用双尾非配对Mann-Whitney检验。（D）经 cxcl8a 吗啉代寡核苷酸（MO）（左）或 cxcl8b MO（右）处理的Tg(lyz:Cxcr1-FT)转基因幼鱼在鳍部伤口处中性粒细胞的共聚焦投影图像（绿色显示sfGFP通道）。图像拍摄于中性粒细胞聚集程度相当的时间点（左图：受伤后85分钟；右图：受伤后45分钟）。比例尺 = 10 µm。该图改编自参考文献14（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像：标记蛋白、受体-配体结合、细胞定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：早期胚胎中的趋化因子反应检测。 原肠胚形成期胚胎的激光共聚焦切片图像，显示Cxcr1-FT的表达与分布情况。将100 pg的Cxcr1-FT mRNA注射至单细胞期卵母细胞中，部分样本同时注射150 pg的Cxcl8a mRNA。绿色和红色受体分别在独立通道中显示。对照组膜标记物CFP（mCFP）在青色通道中显示。比例尺 = 20 μm。本图改编自参考文献14（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充视频 1：3 dpf 时 Tg(lyz:Cxcr1-FT)（左）和 Tg(lyz:Cxcr2-FT)（右）幼鱼头部的转基因中性粒细胞。sfGFP（绿色），tagRFP（品红色）。帧间隔为 30 秒，帧速率为 5 fps。比例尺 = 20 μm。该视频源自参考文献14（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 2： Tg(lyz:Cxcr1-FT)（左）和 Tg(lyz:Cxcr2-FT)（右）转基因幼鱼中性粒细胞对鳍部伤口的响应。视频始于损伤后 10 分钟内，持续 60 分钟。sfGFP（绿色），tagRFP（品红色）。帧间隔为 30 秒，帧速率为 10 fps。CHT = 尾部造血组织。VF = 腹鳍。比例尺 = 25 μm。视频来源参见文献14（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频3。 来自一只受伤的Tg(lyz:Cxcr1-FT)转基因幼鱼（与视频2中所示为不同个体）的中性粒细胞的额外示例，以更高分辨率采集，显示中性粒细胞在尾部造血组织（CHT）中迁移或进入腹鳍并进行趋化运动时受体的内化（sfGFP通道以绿色显示）。帧间隔为30秒，播放速率为2帧/秒。比例尺 = 10 μm。本视频源自参考文献14（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充文件 1： <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2： <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3： <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 4： <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文描述了在斑马鱼中性粒细胞中进行趋化因子受体动态活体成像和定量分析的实验方案

白细胞通过化学梯度导向是免疫反应的关键。中性粒细胞是最早被招募到组织损伤部位的细胞……

中性粒细胞是重要的炎症细胞，可响应局部产生的化学配体而浸润伤口。本方案可实现体内可视化观察受体在这些配体作用下的动态变化。趋化因子受体报告系统还可拓展应用于其他生理环境，如感染和肿瘤模型，以及其他免疫细胞。该方法能够追踪白细胞在组织中何时何地感知趋化分子，有助于更好地理解免疫反应的发生与消退过程。在斑马鱼幼鱼中进行腹鳍损伤实验需要精细的操作技术，因此需先使用非实验用幼鱼进行一定练习。受精后2.5至3.5天，将麻醉的斑马鱼幼鱼置于荧光解剖显微镜下，筛选出具有转基因受体表达的幼鱼。将筛选出的幼鱼转移至含有补充了Tricaine的E3培养基的120毫米培养皿中，使用无菌手术刀对每条幼鱼的腹鳍进行切割，切口深度应足以引起大量中性粒细胞募集，但避免切断尾部造血组织的血管。向玻璃底培养皿中加入500微升2X Tricaine溶液，再加入500微升琼脂糖溶液，用移液枪头轻轻搅拌混合。使用移液器将受伤且已麻醉的斑马鱼幼鱼转移至培养皿中，并将其侧向摆放，同时轻轻下压，使鱼体尾部尽可能贴近玻璃底部。胚胎定位后，让琼脂糖冷却。5到10分钟后，用小号画笔轻轻触碰凝胶以确认其是否凝固，随后向培养板中加入2毫升E3培养基，其中添加0.2毫克/毫升的Tricaine。使用转盘共聚焦显微镜对伤口部位进行成像。琼脂糖凝固后应尽快将胚胎转移至共聚焦显微镜的转盘成像平台，利用载物台操纵杆和显微镜物镜定位鱼体。使用30至40倍物镜，聚焦于伤口区域，并选择围绕伤口的成像视野。选择激光并调整曝光时间，然后设置每30秒拍摄一次的延时成像，持续所需时长，并获取明场图像以记录视野。为了定量分析伤口部位中性粒细胞受体的内化情况，在Fiji中打开图像数据集，并使用时间滑块为每个数据集选择具有代表性的感兴趣时间段。在MATLAB中创建一个新的脚本，并包含用于图像读取、打开以及手动选择感兴趣点的函数。运行脚本以打开目标帧，并点击中性粒细胞进行分析。分别记录腹鳍伤口和尾部造血组织中中性粒细胞中心点的估计位置。使用主动轮廓技术对每帧中的中性粒细胞进行分割，并编写脚本，为每个中性粒细胞添加灰度共生矩阵的计算，包括基于灰度共生矩阵计算中性粒细胞的对比度。添加命令，以分别保存腹鳍中各个中性粒细胞的数值，并计算尾部造血组织中所有中性粒细胞的平均对比度值。将伤口部位单个中性粒细胞的对比度值相对于尾部造血组织中性粒细胞的平均对比度进行归一化处理，从而获得归一化对比度，该值可反映在单个应答细胞中受体分布的斑点化程度相对于对照非应答细胞的情况。然后点击“运行”以执行脚本。腹鳍损伤后，中性粒细胞会迅速从尾部造血组织动员至腹鳍，并在损伤诱导后30至60分钟内聚集于伤口边缘。在本项分析中，利用转盘共聚焦显微镜对斑马鱼中性粒细胞表达的趋化因子受体CXCR1和CXCR2进行成像。受体分布模式通过对比度指标进行量化，该指标反映相邻像素间荧光强度的差异。另一种方法是量化受体水平与受控膜标志物水平的比值。利用对比度指标检测伤口处中性粒细胞簇中的受体内部化，可对伤口部位中性粒细胞中CXCR1与CXCR2转运的可见差异进行量化。例如，在本项分析中，位于伤口部位细胞中荧光标记的CXCR1内部化随时间推移而增加，而荧光标记的CXCR2则仍保留在伤口处中性粒细胞的膜上。通过吗啉代寡核苷酸处理抑制 CXCR1 和 CXCR2 配体后，可在伤口部位观察到不同荧光标记的 CXCR1 发生差异性内化。此外，在早期胚胎中，当受体配体共表达时，荧光标记的 CXCR1 在胚胎中显著发生内化。在实施本方案时需注意，应在损伤后尽快进行成像，以捕捉中性粒细胞募集至伤口过程中受体的动态变化。在对正常幼虫中的趋化因子受体进行成像后，研究人员可在炎症调控异常的突变幼虫中进行比较成像。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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利用斑马鱼模型研究人类甲型流感病毒感染以筛选抗病毒药物并表征宿主免疫细胞反应

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为了检测趋化因子对体内巨噬细胞募集的影响，采用整体原位杂交技术来检测趋化因子的异位表达，并使用免疫染色标记巨噬细胞。通过活体成像技术对巨噬细胞迁移进行实时观察。...

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监测斑马鱼幼虫中的靶向信号响应——Z-REX揭示亲电性药物与代谢物的精确作用机制

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斑马鱼中性粒细胞在伤口反应期间趋化因子受体的活体成像

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