Name: LQ α和β参数、辐射剂量模式和体内剂量沉积评估的辐照器调试和剂量测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 学习临床前放射治疗实验的剂量测量方法，使用固体水模体和电离室进行辐照器调试，结合放射胶片校准技术确保剂量准确性，为癌症治疗研究提供标准化实验方案。

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作者感谢西弗吉尼亚大学显微镜与动物模型成像设施提供设备支持，该设施由资助号 P20GM103434 支持。此外，本研究&#160;得到了&#160;美国国立卫生研究院普通&#160;医学科学研究所资助号&#160;P20GM121322、国家癌症研究所资助号&#160;F99CA25376801&#160;以及 Mylan 讲席捐赠基金的支持&#160;。

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作者无任何披露事项。

上述方案描述了一种简便的辐射剂量测定方法、肿瘤细胞系中α/β值的确定方法，以及乳腺癌脑转移临床前模型中照射实验的简要示例。这些方法可用于研究任何类型的癌症模型，不仅限于乳腺癌脑转移。在本节中，我们将讨论临床前放射治疗实验中涉及的相关复杂因素。
剂量测定包含两个部分：1）使用 Farmer 型电离室校准输出，以确定 X 射线装置的剂量率；2）利用放射变色薄膜建立实用的剂量测量系统。关于输出校准，TG-61 提供了在水中可重复的方法。本方案采用 XStrahl 公司（辐照仪制造商）推荐的 Gammex RMI 457 固态水模体。尽管使用固态水进行相对剂量测定（如归一化至最大剂量的剂量分布曲线或深度剂量曲线）的结果与水中的结果差异优于 1%，但由于固态水的质量能量吸收系数高于水，其绝对剂量存在约 3% 至 4% 的差异。然而，由于所有 XStrahl 系统的安装均采用固态水协议进行输出校准，因此我们未对这些差异进行修正。已知输出剂量后，即可计算出递送目标剂量所需的照射时间。将薄膜置于与 Farmer 型电离室相同的设置中，可使薄膜接受已知剂量的照射。扫描薄膜后可获得光密度值。随后可将薄膜所受剂量与其相应的净光密度（照射前后光密度的差值）作图，从而得到薄膜校准曲线。当实验设置发生变化时，由于剂量率受照射野大小、深度及被照材料的影响，该条件下的剂量率可能发生变化。使用实验设置对薄膜进行照射，可获得其净光密度，再结合薄膜校准曲线即可确定对应的剂量。将该剂量除以薄膜的照射时间，即可得到剂量率。此剂量率可用于计算在特定实验设置下递送目标剂量所需的照射时间。上述方案处理了薄膜剂量测定中的若干细节问题。例如，照射后，薄膜活性层内的化学反应需要约 24 小时才能基本完成。若未等待足够时间，将导致测得的光密度偏低。
任何研究若要实现可重复的剂量测定，了解并理解特定辐照仪的若干关键要素至关重要。尤其需要明确并详细告知其他研究人员所用辐照仪的制造商和型号、辐射源类型（如X射线、放射性源等）、能量、半值层、照射野大小、源到表面距离以及源到等中心距离、被辐照材料的尺寸、辐照材料前的衰减以及辐照后产生的背向散射、实验特定的剂量率、分次照射方案、所使用的精确剂量测定设备以及所采用的剂量测定协议。所有这些信息共同完整地描述了在对任何动物或细胞施加辐射剂量之前，该辐照仪射束的质量特征19。本方案及其他相关方案中另一个重要的信息点是，方案1中获得的剂量率仅仅是所用辐照仪的输出值。对于任何特定实验而言，通过与生成的放射变色薄膜校准曲线（方案2）进行比较，来定义该实验设置下的具体剂量率（方案4），是十分重要的。
体外实验可提供有关癌细胞系放射生物学行为的重要信息。体外克隆形成细胞存活实验能够准确估算并量化细胞系固有的放射敏感性20，有助于设计后续细胞或小型动物实验中的分次照射方案21。具体而言，这些实验可估算线性-二次模型中用于预测放射治疗所致细胞死亡的参数α和β的数值，该模型的方程如下：
<img alt="静力平衡方程 SF=e^-α*D-β*D²；指数衰减；数学公式。" src="/files/ftp_upload/61692/61692equ09.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 9"> （公式 9）
其中，SF 是克隆源性存活细胞的存活分数，D 是以 Gy 为单位的辐射剂量，α 和 β 为拟合参数22。α/β 比值可作为细胞放射敏感性的内在度量指标，其值越高，表明细胞系的敏感性越强22。由于该函数关系在剂量上呈非线性，放射治疗分次方案的生物学效应不仅与总照射剂量有关，还取决于分次次数和每次剂量的大小23。生物有效剂量（BED）用于衡量实际递送到组织的生物学剂量，可实现不同分次方案之间的直接比较24,25。BED 的计算仅需提供 α/β 的估计值，其公式如下所示：
<img alt="生物有效剂量公式，BED=n*D*[1+D/(α/β)]，放射治疗计算。" src="/files/ftp_upload/61692/61692equ14.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 14"> （公式 14）
其中 n 为剂量 D 的分次次数。克隆源性细胞存活实验可估算 α/β 值，并通过 BED 公式实现放射治疗分次方案的直接比较。如果在实验组内或实验组间，BED 不相等，则可能对组织或器官对放射治疗（或放射治疗与其他治疗方式的联合方案）的反应得出错误结论。例如，2 次 10 Gy 的照射与 4 次 5 Gy 的照射所产生的 BED 并不相同，因此这些给药方案在生物学效应方面无法直接比较。尽管 BED 公式因线性二次模型本身存在局限性而并不完美，但对于广泛的实验治疗条件，其仍能可靠地估算等效效应24,25。
克隆形成细胞存活实验在研究癌症模型中放射治疗效应方面具有重要作用，但体外实验还提供了多种其他选择，可进一步深入探讨癌细胞放射生物学的机制细节。通过对克隆形成细胞存活实验进行简单改进，可用于确定某些放疗增敏化疗药物的作用机制，例如紫杉醇或依托泊苷26,27。进一步的体外实验选择包括免疫细胞化学研究，以检测特定的细胞修复通路，例如双链DNA断裂修复相关的γ-H2AX焦点形成和/或53BP1染色28。在比较单一放疗与联合治疗方案时，尤其是针对特定细胞系探究其作用机制时，这类实验可能尤为有意义。其他实验方法还包括细胞因子检测，以评估细胞对辐射引发的炎症反应的固有作用，或在不同治疗条件下分析细胞死亡方式（如凋亡、坏死、有丝分裂灾难等）29,30,31。此类实验可补充甚至替代动物实验，从而更全面地理解特定癌细胞系的放射生物学特性。无论选择何种附加实验，如方案3所述的标准克隆形成细胞存活实验，始终是细胞系放射生物学特性评估的重要初始步骤。
克隆形成实验与辐射剂量测定为研究者提供了精确规划实验的方法，使其更直接地模拟临床情况。结合临床前癌症小型啮齿类动物模型，可以在体内研究单独辐射或在治疗方案背景下的辐射反应。在使用动物之前，如果实验装置与用于确定剂量输出的装置不同，则确定该特定装置的相对剂量输出至关重要。32,33. 当确定非标准照射野尺寸的剂量率时 &lt;10 mm时，由于小野内的准直问题以及部分容积平均效应，电离室的测量准确性会降低33使用放射变色膜结合体内免疫组织化学实验，过去已被用于确定输出量和剂量沉积。16,34,35,36,37,38.

癌症总体上是美国及全球许多国家的第二大死亡原因1。放射治疗是多种肿瘤亚型治疗的核心手段，约一半的癌症患者接受过放疗2,3。随着放射治疗设备的持续进步以及一些有效的多模式治疗方案的开发，几乎所有类型癌症患者的治疗效果均随时间推移而有所改善4,5,6，但对于某些类型肿瘤的患者，复发率和死亡率仍然较高7,8,9。因此，癌症放射治疗仍是基础与临床研究的活跃领域。许多临床前放射治疗研究采用小型辐照仪对体外模型或动物癌症模型进行辐射照射。在开展大量探索放射生物学机制细节或新型治疗方法的潜在实验过程中，可能会遇到一些常见陷阱，导致得出错误结论、结果重复性差以及资源浪费。这些陷阱主要涉及三个关键方面：辐照仪的剂量测定、体外模型细胞系的表征，以及体内辐照的剂量方案与实验设置。若不事先关注放射治疗研究中的这些基本要素，更高级实验的准确性和可重复性结果将难以实现。
本文所述方案介绍了一种避免或减轻上述问题的通用策略，并借鉴了多种先前开发的、原本独立使用的实验方法。这些不同的方法已被整合，以便有意开展或改进临床前放射治疗实验的研究人员可将其作为可靠的实验框架。该建议框架包括小型动物辐照仪的调试方法、模型癌细胞系基本放射生物学特性的测定方法，以及针对体内肿瘤模型合理设计和实施剂量与分次照射方案的方法。

<table><tbody><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>本品或性能相当的冰醋酸产品均可使用。</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td>本品或性能相当的结晶紫产品均可使用。</td></tr><tr><td>数字气压计</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-650-118</td><td>用于压力和温度测量。</td></tr><tr><td>静电计</td><td>Standard Imaging</td><td>CDX 2000B</td><td>需由ADCL校准；需要修正因子，P&lt;sub&gt;elec&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>胶片</td><td>Gafchromic</td><td>EBT3 Film</td><td>每包25张；校准用胶片与实验用胶片必须来自同一批次</td></tr><tr><td>电离室</td><td>Farmer</td><td>PTW TN30013</td><td>由ADCL在两个校准点进行校准</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>本品或性能相当的甲醇产品均可使用。</td></tr><tr><td>光扫描仪</td><td>Epson</td><td>Perfection V700</td><td>同等型号包括V800、V10000、V11000、V12000</td></tr><tr><td>XenX</td><td>Xstrahl</td><td>NA</td><td>所使用的辐照装置。</td></tr></tbody></table>

放射源校准与剂量学：用于评估lq α和β参数、辐射给药方案及体内剂量沉积

Irradiator Commissioning and Dosimetry for Assessment of LQ &alpha; and &beta; Parameters, Radiation Dosing Schema, and in vivo Dose Deposition

辐射剂量测定对于在临床前模型中准确递送和重复辐射方案至关重要，以确保高度的转化相关性。在进行任何体外或体内实验之前，必须评估辐照仪的特定剂量输出以及各个实验设计的参数。使用电离室、静电计和固体水模体装置，可以确定等中心处大照射野的剂量输出。采用类似的装置，将电离室替换为放射变色胶片，还可以测定不同深度下小照射野的剂量率。针对癌细胞在辐射处理下的体外克隆形成存活实验是一种成本较低的实验方法，通过将实验数据拟合传统的线性二次模型，可评估细胞系固有的放射敏感性。从这些实验中估计出的模型参数，结合生物有效剂量原理，可用于设计不同的分次照射方案，从而在荷瘤动物实验中实现等效的生物有效剂量。在比较体内放射治疗方案时，这是一个需要重点考虑并校正的因素，以避免因递送的有效剂量差异而导致结果出现潜在的混杂效应。综上所述，本文提供了一种通用方法，用于临床前动物和柜式辐照仪的剂量输出验证、体外放射敏感性评估，以及对小型活体生物中辐射递送的验证。

按照方案1操作将获得以 Gy/min 为单位的剂量率，该数值特定于所使用的照射设备。然而，无论照射设备的类型如何，只要已知剂量率，即可通过方案2生成校准曲线，得到与图2A-B中相似的胶片结果和类似的校准曲线。成功执行方案3将产生界限清晰、染色均匀呈紫色的细胞克隆。所估算的α/β值可与文献报道值或其他处理组进行比较，以评估该细胞系的放射敏感性。利用按照方案2建立并在图2B中显示的校准曲线，方案4将产生两个类似于图2A的胶片样本，可用于估算实验所需的照射时间。如果所用照射设备配备有内置的门控成像相机，则可获取小动物在有无准直条件下的放射影像。将这些图像叠加后，可明确显示准直辐射束相对于被处理小动物的精确位置，如图4A所示。方案5中成功的剂量沉积可通过方案6进行验证。体内或体外系统中发生辐射沉积的一个指标是检测到双链DNA断裂。如图4B所示，同一只小鼠仅右侧半脑接受照射（如图4A所示），结果仅在受照半脑中观察到γH2AX阳性染色。在该图中，细胞核经DAPI染色以显示两点：1）组织学分析过程中抗γH2AX抗体作用的整个脑区范围；2）未受照射的脑半球保持无染色信号。
<img alt="辐射测量示意图；电离室装置、静电计、温度计、压力表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：用于测定剂量输出的电离室与水等效模体的粗略装置示意图。该图示说明了在辐照仪机箱内使用电离室和固体水等效模体进行剂量测量所需各组件的基本装置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光密度分析；(A) 颜色变化，(B) 剂量-反应曲线，放射治疗效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：使用放射变色胶片生成校准曲线。（A）放射变色胶片随剂量增加而发生颜色变化的代表性示例。左上角（0 cGy）；右下角（2000 cGy）。（B）比较净光密度与剂量的放射变色胶片可能的校准曲线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="集落形成实验示意图及结果；用于增殖分析的细胞培养。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：癌细胞的克隆形成实验。细胞的辐射处理可在接种至六孔板/培养皿之前（A）或之后（B）进行。在图（C）中，展示了按照第3节实验方案操作后，MDA-MB-231乳腺癌细胞成功完成克隆形成实验的代表性图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脑光学成像；X射线与荧光显微镜，脑结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：使用双重叠加放射自显影图像进行定位（如可用）以及通过γH2AX免疫组织化学阳性染色确认剂量沉积。（A）代表性叠加放射自显影图像，显示辐射束的放置位置。（B）代表性结果，显示通过γH2AX信号强度增加证实右侧半球的剂量沉积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>修正因子</td>
			<td colspan="2">说明</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nκ</td>
			<td colspan="2">空气比释动能校准因子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[(µen/ρ)Wair]water</td>
			<td colspan="2">水与空气的质量能量吸收系数比值；约为 1.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pq,Cham</td>
			<td colspan="2">考虑电离室杆部对光子注量扰动影响的修正；约为 1.022</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Psheath</td>
			<td colspan="2">考虑保护电离室的护套影响的修正；由于电离室防水，该值为 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ppol</td>
			<td colspan="2">考虑极性效应的修正因子；在方案 1 中测定</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pion</td>
			<td colspan="2">考虑离子复合效应的修正因子；在方案 1 中测定</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTp</td>
			<td colspan="2">考虑实验当天温度和压力影响的修正因子；在方案 1 中测定</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：方案1中测定剂量率所需的校正因子。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>剂量</td>
			<td>N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">*仅在单个实验的剂量超过10时才需要。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：生成放射变色胶片校准曲线时应使用的剂量。

辐射剂量测定提供了一种提高临床前实验准确性的技术，可确保所施加的辐射剂量与临床参数密切相关。本方案描述了在临床前辐射实验各阶段应采取的步骤，以确保实验设计的正确性。

放射源校准与剂量学：用于评估LQ α和β参数、辐射给药方案及体内剂量沉积

辐射剂量测定对于在临床前模型中准确实施和重复具有高度转化相关性的辐射方案至关重要。

本方案结合了多种放射生物学和辐射剂量测定方法，是一种新颖的组合，旨在确保准确、可重复的临床前放射治疗实验。这些方法将实验条件与国家标准剂量相联系，能够准确测量与放射治疗剂量相匹配的剂量。本方案聚焦于可重复性放射治疗实验的设计，为研究人员提供了开展具有高度转化相关性研究所需的工具和方法。对于初学者而言，尤其是缺乏医学物理背景的人员，剂量测定校准协议可能具有挑战性。我们建议在首次尝试这些实验时咨询放射治疗物理师。本方案中的技术在放射物理师和生物医学研究人员中均较为常见。然而，其中一些参数通常不联合使用。为确定适当的剂量输出，将照射仪设置为在220千伏峰值和13毫安的条件下照射，照射野开放为17厘米×17厘米，距离射线源35厘米。使用0.15毫米厚的铜滤过片（宽焦点）对射线束进行滤过，并依次放置1厘米厚的模体板、2厘米厚的模体板、带有电离室的2厘米厚模体板以及1厘米厚的模体板。设置好模体堆叠后，将电离室插入模体中，并调整模体堆叠，使源到表面的距离在适当调平后为33厘米。然后确认这些测量位置在距离等中心点35厘米处正确地位于电离室内。为建立放射变色胶片的校准曲线，准备若干相同尺寸和方向的额外胶片，并将胶片置于固体水模体堆叠中2厘米深度处。开始照射时，将一片胶片置于四厘米厚的固体水模上方，并将剩余的两厘米厚固体水模放置在胶片上方。完成曝光后进行胶片扫描，将图像文件以 tiff 格式导入 ImageJ，选择图像、颜色，然后选择拆分通道。仅在红色图像通道中，使用矩形工具绘制一个感兴趣区域，然后按 Ctrl+M，以便从结果窗口中转录平均值。在获取未曝光和已曝光胶片的所有像素值后，根据所示公式计算净光学密度，然后将净光学密度对胶片曝光剂量作图，并用二次曲线拟合该图。通过克隆形成实验确定特定癌细胞系的α/β值时，计数各处理组中形成的克隆数量，以计算每块培养板的存活分数，然后将存活分数的自然对数对相应照射剂量作图，并用二次函数拟合曲线。为确定不同实验设计下的特定剂量输出，选择所需的射野大小和源距离，并使用固体水模体提供所需的建成区和背向散射，将胶片按最能反映实验设计的方向放置。随后可根据胶片的净光密度，利用剂量校准曲线确定剂量。为了确定荷瘤小鼠治疗时的合适射束位置，在确认小鼠无足底反射反应后，使用机载定位相机和铝滤片，在未加准直的条件下获取实验小鼠的X射线影像，然后在加用准直装置的条件下再次获取X射线影像，并在ImageJ中将两张影像叠加，以确定射束定位。通过如上所述的校准曲线，可制备两份胶片样品，用于估算所需的实验照射时间。叠加这些图像将揭示准直辐射束相对于被处理小动物的精确定位。随后可通过此代表性分析中仅在处理半脑内观察到的阳性γ-H2AX染色来确认成功的剂量沉积。从确定辐照仪输出到生成胶片校准曲线，再到为理想的实验设计确定剂量的过程中保持一致性至关重要。遵循这些方案可使研究人员在临床前环境中研究多种具有临床应用价值的放射生物学问题。这些问题的研究可能有助于更好地理解患者的治疗效果。本方案并非一种独立的全新技术。然而，结合这些方法将具有直接的临床相关性，并有助于深入了解临床中所用剂量的效果。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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