Name: 使用等温微计算法确定新天然产物的杀菌或杀菌作用的代谢分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习使用等温微量热法分析新型抗菌化合物的作用机制，实时监测A.baumannii等细菌的代谢变化。该方法为药物研发提供重要的杀菌效果评估手段。

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作者谨向Symcel团队致以感谢，感谢他们富有成效的讨论；同时感谢Ganna Oliynyk和Wilhelm Paulander提供的大力支持。我们还要感谢Daniel Kohnhäuser提供天然产物，以及Stefanie Schmidt提供的娴熟技术协助。

注意：仪器温度必须根据所使用的细菌至少提前一天设定，以确保系统的稳定性。此处，Acinetobacter baumannii DSM30008 样品在 30 °C 下运行。
1. 培养物制备
<ol>
	<li>将待研究的菌株（此处为 A. baumannii）划线接种于CASO琼脂平板上，在30 °C静置培养箱中过夜培养。</li>
	<li>挑取单菌落接种于MHB（Mueller-Hinton肉汤）中，制备过夜培养物，并在30 °C、180 rpm振荡培养箱中培养。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>使用 1.5 mL 离心管配制所选药物或化合物的浓度梯度（例如，加入 1.5 µL 以 DMSO 溶解的 100 倍浓缩母液；参见步骤 2.3）。</li>
	<li>将过夜培养物用 MHB 培养基稀释。
	<ol>
		<li>使用分光光度计在 600 nm 波长下测定过夜培养物的光密度。</li>
		<li>将培养物稀释至新鲜 MHB 培养基中，使菌液浓度达到 5 × 105 菌落形成单位（CFU）/mL。光密度 OD600 为 1 时，约相当于 5 × 108 CFU/mL（例如，Escherichia coli、Staphylococcus aureus、A. baumannii）。 
		注意：必须针对每种细菌菌株在特定培养条件下校准 OD600 与 CFU/mL 之间的换算系数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向步骤 2.1 中准备好的测试管中加入 150 µL 菌液，确保药物或化合物的终浓度以及细胞终浓度正确。</li>
	<li>通过涡旋振荡使化合物与菌液充分混匀。 
	注意：样品板（参见材料表）共有六行，每行八个孔，总计 48 个孔；其中 A 行和 F 行为热力学参比孔，因此不能加入样品，应向这些孔中加入相应的培养基。每次运行最多可检测 32 个测试样品，使用 B 至 E 行的孔位。每个测试样品至少应设置两个重复（本实验中所有样品均设三个重复），并应包含生长对照。</li>
</ol>
3. 插入物制备
<ol>
	<li>从步骤 2.4 制备的混合物中转移 120 µL 至塑料插件中。 
	注意：在步骤 3.1 中使用反向移液法，以防止液体喷溅到塑料插件的侧壁，否则可能导致信号读数干扰。</li>
	<li>使用镊子将所有钛瓶放入支架中（参见材料表）。</li>
	<li>轻柔地将插件转移至支架板中的钛瓶内。</li>
	<li>将钛盖松松地盖在所有钛瓶上。</li>
</ol>
4. 加样
<ol>
	<li>将带有钛杯的支架转移到样品台，并放置在指定区域。</li>
	<li>使用扭矩扳手，设定为 40 cNm 力，拧紧所有盖子。</li>
</ol>
5. 样品的运行
<ol>
	<li>在 calView 软件中，启动一个新的实验（补充图 1）。</li>
	<li>将样品插入臂从仪器中缩回。</li>
	<li>将杯架放置在“桥”上，第 8 列朝向样品插入口，并轻轻将杯架推入仪器至指定的“位置 1”。等待 10 分钟，使系统稳定。标记实验孔。</li>
	<li>推动样品插入臂，直至杯架到达指定的“位置 2”。等待 20 分钟，使系统稳定。</li>
	<li>将样品插入臂推至“位置 3”，然后将样品插入臂缩回至“运行位置”。在软件中高亮所有孔，并选择 反应开始（补充图 4）。</li>
	<li>运行实验，直至热释放读数稳定地回到零值。 
	注意：请确保所有孔在此过程中表现出相似的行为。补充图 5 展示了当孔加载正确时应观察到的现象。如果加载不正确，请重复步骤 5.2–5.4。</li>
</ol>
6. 移除杯托
<ol>
	<li>在软件中选择 停止（补充图 6）。软件将提示“您确定吗？”，选择 是（补充图 7），并将实验数据保存至驱动器或桌面以供后续数据分析（补充图 8）。</li>
	<li>将样品插入臂完全插入仪器中，并启动磁铁以回收杯架。</li>
	<li>松开瓶盖，取出内衬，将小瓶和瓶盖放入玻璃支架中，在 180 °C 下放置 4 小时，随后将小瓶和瓶盖置于干燥器中，确保小瓶和瓶盖完全干燥。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>打开软件（补充图 9），在左上角选择打开实验（补充图 10）。在弹出窗口中选择目标实验，然后点击打开（补充图 11）。应用程序将以默认的孔位视图打开该实验（补充图 12）。</li>
	<li>点击全选或按下Ctrl+A（补充图 13）。</li>
	<li>点击定义基线，此参数将对每个位置的数据进行归一化处理（补充图 14）。在弹出窗口中选择一个位于延滞期、时长&#62;30 分钟的时间段（热流必须较低，介于 0 至 10 µW 之间；补充图 15）。选定基线时间段后，所选基线将在热谱图中以绿色显示。关闭定义基线区间窗口。</li>
	<li>点击保存或Ctrl+S，然后关闭软件（补充图 16）。</li>
	<li>打开基于网页的 Symcel 量热分析应用程序（https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/）。</li>
	<li>要将文件上传至量热分析应用程序，请点击浏览（补充图 17），选择实验文件后点击打开（补充图 18）。该网络应用程序将自动为 32 个样品计算代谢参数（补充图 19）。</li>
	<li>为将热流数据拟合至 Gompertz 和/或 Richards 生长模型，请点击生长函数。生长模型的拟合结果将在“累积”部分显示，并在“流速”部分与原始数据进行比较（补充图 20）。</li>
	<li>要下载所有已计算的参数，请点击下载测量值。选择文件保存位置后点击保存（补充图 21）。文件将被导出至电子表格，以便进行后续计算。</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization (WHO). Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO). , Available from: 
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<li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li>
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</ol>

该项目由 calScreener 技术的开发公司 Symcel 合作完成。作者声明无利益冲突。

等温微量热法通过测量样品随时间释放的能量，反映所有生物、物理以及（生物）化学过程所产生的能量变化。由于该方法能够连续实时监测代谢活性，因此所测得的热流可用于评估或确定物质的抗菌效果。
为了获得可靠的分析数据，需要针对所使用的每一种或每一株微生物，分别确定其正确的起始菌落形成单位（CFU）。如果CFU数量过低，会导致较长的延滞期，因为系统需要更长时间才能达到产生足够热量以被检测到的生物量临界值。如果CFU数量过高，则延滞期会非常短，且产生的热量可能传递至邻近的传感器细胞（参考孔和实验孔），从而导致热谱图失真。过高的CFU数量还会导致氧气更快耗尽，使体系迅速转入厌氧状态。此外，还需注意，在实验开始的前30分钟内，系统正处于平衡阶段，无法进行数据采集，因此对效应的实际记录会被延迟。另外，CFU测定不准确会导致最低抑菌浓度（MIC）的错误判断，最终影响实验结果及所观察到的变化25。另一个关键点是基线的正确确定。通常，基线信号应在延滞期内选择，此时热流信号为零，理想情况下，用于定义基线的时间范围应&#62;30分钟。然而，这并不总是可行的，因为不同菌株或物种达到热信号检测限所需的时间各不相同。某些菌种或菌株需要超过30分钟才能达到热信号检测限，而另一些则可在前30分钟内即达到。在此情况下，可以选择在实验结束时所有热信号均已回落至零并保持稳定时确定基线信号。或者，也可使用相同细菌菌株在其他实验中获得的基线数据，但这种方法并不推荐。
该系统在实验设计、优化及故障排除方面具有一定的灵活性。使用塑料插件时，所用体积范围为100–300 µL，而使用无塑料插件的钛杯时，体积范围为100–600 µL。制造商推荐的工作体积为120 µL。在建立新的实验系列以及寻找最佳测量条件时，使用不同体积主要影响两个参数。较低的体积可减少所需测试化合物的用量，这对于仅能获得少量的化合物尤为重要。此外，所用体积直接影响测量过程中的氧气供应，较低的体积会增加细菌生长所需的可用氧气量。氧气耗竭是限制实验最长时间的主要因素之一。重要的是，不仅可以使用液体培养基，还可以使用固体培养基。这对于生长缓慢的微生物尤其重要，因为在固体与气相界面处生长可实现更好的氧气供应9。
等温微量量热法（IMC）是一种有用的分析工具，可用于发现物理学、化学和生物学领域中的未知过程。该方法通过测量封闭系统内的热交换，对记录的热交换数据进行分析，从而提供一些常规方法无法获得的额外信息。在微生物学和抗生素研究中，IMC 最大的优势之一是能够区分活细胞、死细胞以及持留细胞或休眠细胞，而这是标准浊度法无法实现的11。此外，IMC 具有高度灵敏性，能够检测低至 104–105 个细胞产生的热释放9。另一个优点是实验装置快速且简便，可实现连续、实时的监测，且几乎无需人工干预。此外，IMC 是一种非破坏性方法，因此可对样品进行后续分析。数据分析可将生物量形成过程与代谢活性分别解耦，直至对数生长后期或稳定期初期，并可独立分析稳定期的代谢活性。
除了上述新颖且令人兴奋的应用特点外，该方法也存在一些不足之处。主要局限在于，等温微量热仪（IMC）测量的是特定系统内产生并释放的总热量，其中也包含非特异性信号。因此，实验设计时必须设置适当的对照，以准确评估通过记录热流所测得的热量信号变化9,20。
在我们看来，等温微量热法（IMC）是研究新型天然产物抗菌效果及确定其有效浓度范围的重要工具。除了能够区分抑菌与杀菌效应外，未来该方法还可用于靶点鉴定研究和作用机制（MoA）的确定。这可以通过将不同抗生素类别的热图谱与新型活性化合物的热图谱进行比较来实现，如本文所示。然而，仍需进一步研究从实验数据中提取的某些可量化参数是否足以支持此类比较，或者是否需要开发基于完整热图谱生成指纹特征的算法。在抗生素研究领域的另一潜在应用是将野生型菌株与耐药克隆株进行比较，并结合全基因组测序，有助于阐明新型抗菌药物的耐药机制（MoR）。由于该方法具有静态特性，可用于研究新型药物对生物膜形成过程或已形成生物膜的影响，从而加深对不同休眠阶段微生物生物学过程及其受干预效应的理解。IMC记录的是以热能形式释放的总能量，因此也适用于研究活性物质在亚抑制浓度下的效应，这些效应可与转录组学数据关联分析。此外，该方法还可应用于临床场景中，用于检测样本污染或生成抗菌谱（antibiogram），以帮助快速确定患者的最终治疗方案11。

本方法旨在将等温微量热法（IMC）作为中通量筛选手段，用于新型抗菌化合物的作用机制（MoA）分析。该方法可提供化合物对细菌物种活性的相关数据，并揭示化合物本身是具有杀菌作用还是抑菌作用。
新兴抗菌药物耐药性（AMR）的上升是一个全球性问题，导致已知抗生素对常见感染的治疗效果降低1然而，寻找能够替代已知抗生素或与之联合使用的新化合物和药物的研究仍在持续进行，这些研究基于多种不同的方法。天然产物在当前的药物发现工作中发挥着关键作用，尤其在抗感染药物的发现中尤为重要。2然而，为抗生素研发寻找新的先导化合物是一个耗时且资金投入巨大的过程3因此，早期发现阶段极为重要，以便在早期就筛选出最有前景的骨架化合物。天然产物药物发现的初始步骤包括确定化合物的结构以及其活性 体外 以及作用机制（MoA）和靶点鉴定。最有希望进入后续开发阶段的化合物应表现出良好的活性谱（例如，抗菌药物应具有广谱活性），并通过一种新颖的作用机制克服已有的抗菌耐药性（AMR）。随后，通常对有前景的骨架化合物进行次级筛选，包括 体内 生物利用度、毒性和代谢4除了经费问题外，天然产物药物发现还面临与化合物分离和纯化相关的成本及技术难题，这可能导致在发现过程的早期阶段难以获得数百毫克甚至克级的样品量5,6因此，在天然产物研究中，能够使用极少量化合物进行前沿的初筛显得至关重要，以便就是否进一步投入资源将新型天然产物推进至临床前开发阶段做出科学决策。采用成像流式细胞术（IMC）进行抗菌谱分析，与传统方法相比可显著减少所需化合物的用量，同时还能提供有关新药与微生物群落相互作用的更深入信息。7.
等温微量热法（IMC）是一种成熟的技术，用于测量生物系统中所有生物、物理及生化过程与反应所产生的总能量。细菌释放的能量与其总的代谢反应成正比8。在封闭系统（如所使用的微量热仪）中，可在微瓦（µW）量级测量热量，以研究细菌的代谢动力学9,10,11,12。细菌释放的热能（能量）与其细胞代谢相关的各种细胞功能相关，但并不一定与细胞生物量成正比。
最初，由于等温微量热法通量较低且检测所需样品量较大，其在微生物分析中的应用受到限制。然而，所使用的微量热仪具有独特优势，它结合了等温微量热法的优点，同时提高了通量并降低了对化合物的需求量，使其成为药物发现应用中的有力工具10。此外，该仪器相较于其他测定细菌生长动力学的方法（如基于600 nm波长处光密度测量的标准浊度法，即OD&#60;600）也具有更多优势。OD600的测定依赖于“光密度增加等同于微生物生长”的假设，因而忽略了非活细胞的存在。该方法还因无法检测微小菌落变异株和持留细胞而受到批评11。相比之下，等温微量热法（IMC）能够实时监测所有类型的活细胞。即使细胞处于休眠状态，仍具有代谢活性，因此可被IMC检测到，而此类现象在标准浊度法中无法被识别11。IMC的其他优势还包括更短的抗菌药物敏感性测试时间、可在复杂群落中测定药物相互作用，以及采用无需破坏样品的标准分析方法7。
IMC 技术已广泛应用于多种研究领域，涵盖微生物学、产热作用以及癌症生物学13,14,15,16,17。在微生物学方面的应用包括测定化合物对不同细菌菌株的最低抑菌浓度（MIC）。已有多个研究证实，与其它（标准）MIC测定方法相比，利用等温微量热法获得多数细菌物种的MIC数据更为快速，且结果具有一致性12,18,19。IMC 的其他应用还包括观察药物及其联合治疗方案与复杂细菌群落（如生物膜）之间的相互作用11。一项专注于作用机制（MoA）分析的研究表明，微量热仪能够区分第一代与第二代头孢菌素所产生的热谱差异，而具有相同作用机制的不同抗生素则表现出相似的热流曲线18。
本文介绍了利用新型等温微量热仪通过等温微量热法（IMC）对新型天然产物进行作用机制（MoA）分析的方法。该方法可用于确定抗生素的有效浓度，并根据其杀菌或抑菌机制对抗生素特性进行表征。该方法可广泛应用于化合物的作用机制谱型分析，有望替代或至少补充传统的微生物学方法。未来的研究将包括深入的指纹图谱分析，从而能够基于作用靶点机制区分不同的抗生素类别。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Acinetobacter baumannii&lt;/em&gt;</td><td>DSMZ</td><td>DSM-30008</td><td>本研究中使用的参考菌株</td></tr><tr><td>calPlate</td><td>Symcel</td><td>1220093</td><td>用于插入钛杯的48孔板</td></tr><tr><td>calScreener</td><td>Symcel</td><td>1200001</td><td>等温微量热仪</td></tr><tr><td>calView 软件</td><td>Symcel</td><td></td><td>数据采集与分析软件</td></tr><tr><td>calWell</td><td>Symcel</td><td>1901004</td><td>微生物级（非活性）48孔板，含可插入钛杯中的塑料插件</td></tr><tr><td>CASO 琼脂</td><td>Carl Roth</td><td>X937.1</td><td>用于微生物的分离与培养</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>环丙沙星</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Brand</td><td>759015</td><td>1.5 mL 比色皿</td></tr><tr><td>一次性接种环</td><td>Sarsted</td><td>86.1562.050</td><td>10 &amp;micro;L 接种环</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL Eppendorf 安全锁扣管</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10428671</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管</td><td>Sarsted</td><td>62.554.502</td><td>15 mL Falcon 管</td></tr><tr><td>盐酸 (HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10316380</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A412-500</td><td></td></tr><tr><td>穆勒-欣顿肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70192</td><td>用于抗生素敏感性研究的液体培养基</td></tr><tr><td>阳离子调节型穆勒-欣顿肉汤 II 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90922</td><td>阳离子调节至 1.25 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、0.8 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的穆勒-欣顿肉汤</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>LABSOLUTE</td><td>7696404</td><td></td></tr><tr><td>移液器 100 - 1000 &amp;micro;L</td><td>Brand</td><td>705880</td><td></td></tr><tr><td>移液器 2 - 20 &amp;micro;L</td><td>Brand</td><td>705872</td><td></td></tr><tr><td>移液器 20 - 200 &amp;micro;L</td><td>Brand</td><td>705878</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 100 - 1000 L</td><td>Brand</td><td>732032</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 2 - 200 &amp;micro;L</td><td>Brand</td><td>732028</td><td></td></tr><tr><td>硫酸多粘菌素B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0972</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>利福平</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>170356N</td><td>10 mL Nunc 血清移液管</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Eppendorf AG</td><td>6135 000.017</td><td></td></tr><tr><td>无菌滤器</td><td>Minisart</td><td>16534----------K</td><td>孔径 0.2 &amp;micro;m 的无菌滤器</td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>NORM-JECT</td><td>22778</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>钛杯</td><td>Symcel</td><td>1220089</td><td>插入 48 孔钛制 calPlate 中</td></tr><tr><td>钛盖</td><td>Symcel</td><td>1220091</td><td>拧紧并密封至钛杯上</td></tr><tr><td>甲氧苄啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7883</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Symcel</td><td>1900602</td><td></td></tr></tbody></table>

利用等温微量热法进行代谢谱分析以确定新型天然产物的杀菌或抑菌效应

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

由于全球范围内抗菌耐药性问题日益严重，亟需开发新型抗生素。我们研究黏细菌产生的天然产物作为&#160;此类新化合物的创新来源。该过程中的一个瓶颈通常是阐明其作用模式。我们近期已将等温微量热法纳入常规分析流程。该技术可用于研究抗生素暴露对细菌整体代谢反应的影响，包括与生物量形成无关的代谢过程。重要的是，在测量过程中无需任何人工干预，即可轻松区分抑菌效应与杀菌效应。然而，等温微量热法仍属较新的技术，将其应用于不同细菌种类时，通常需要预先评估合适的测量条件。目前已有部分特定细菌的参考热谱图，可极大促进结果的解读。随着参考数据的持续积累，我们预计该方法未来将产生日益广泛的影响，并有望实现深入的指纹图谱分析，从而区分不同类别的抗生素。

阐明一种新型抗生素的作用机制是药物发现过程中的一项具有挑战性的任务。本文所述方法的目标是应用calScreener进行等温微量热法，用于抗菌谱分析，以进一步揭示药物与微生物相互作用的细节。

由于全球范围内抗菌耐药性问题日益严重，亟需开发新型抗生素。我们研究黏细菌产生的天然产物作为……

了解新型抗菌化合物的作用机制是一项重要但困难的任务。该方法可深入揭示此类作用机制，且易于实施。该技术能够以非侵入性方式实时观察抗菌效果，从而实现对样品的进一步分析。尽管掌握微生物学技术是实验的前提条件，但该实验本身易于操作。初次进行微量热法实验时，务必仔细进行数据分析。首先使用分光光度计在600纳米波长下测定过夜培养物的光密度。将菌液稀释至每毫升新鲜MHB培养基中含有5 × 10⁵ CFU（菌落形成单位）的浓度，并向每支含有目标浓度抗生素的1.5 mL离心管中加入150 µL菌液。随后通过涡旋振荡使化合物与菌液充分混合。为制备插入物，将120 µL的每种细菌-抗生素混合液分别加入48孔板相应孔中的独立塑料插入物内，并使用镊子将所有钛制小管放入支架中。轻柔地将插件转移至支架板中的钛管内，并将钛盖松松地盖在所有管子上。当所有插件均转移完毕后，将支架放置于样品站的指定区域，并使用设定为40厘牛·米的扭矩扳手拧紧所有管盖。在系统软件中，启动新实验，并将样品插入臂从仪器中缩回。将杯架放置在桥架上，使第八列对准样品插入孔，并轻轻将杯架推入一号位置的仪器中。等待10分钟，待系统稳定后，对实验孔进行标记。接着，推动样品插入臂，直至杯架到达二号位置。待系统稳定20分钟后，将样品插入臂推至位置3，再将样品插入臂缩回至运行位置。在软件中高亮所有孔，选择“反应开始”，然后运行实验，直至热释放读数稳定回到零。分析结束后，选择“停止”。软件随后会询问您是否确认。请选择“是”，并保存实验以进行数据分析。然后将样品插入臂完全插入仪器中，并启动磁铁以取回杯架。为分析数据，打开软件并选择“打开实验”。在弹出窗口中，选择目标实验并点击“打开”。点击“全选”并定义基线，以对每个位置的数据进行归一化处理。在弹出窗口中，选择迟滞期中超过 30 分钟的时间段。选择后，基线将以绿色显示在热谱图中。关闭定义基线部分窗口，然后点击保存并关闭软件。接下来，打开基于网页的 SymCel 量热分析应用程序。单击“浏览”以上传目标文件并选择实验。系统将自动计算 32 个样品的代谢参数。要将热流数据拟合到Gompertz和/或Richards生长模型，请点击生长函数。生长模型将在累积部分显示，以便与流动部分中的原始数据进行比较。如需下载计算得到的参数，请点击下载参数，选择文件保存位置，然后点击保存。该文件将被导出至电子表格以进行进一步分析。此处显示的是通过将鲍曼不动杆菌 DSM-30008 暴露于连续稀释的环丙沙星所获得的热图谱。0.005 至 0.1 微摩尔浓度范围对鲍曼不动杆菌的生长和代谢影响较小。然而，用 0.5 微摩尔环丙沙星处理细胞会导致滞后期持续时间显著延长，并使最大热流降低。这两个变化共同影响了达到峰值的时间，导致其延长约六小时。在该图中，累积释放的热量随时间变化，每种浓度的影响通过斜率的倾斜程度来反映。通过量化热图斜率，可计算出在环丙沙星存在条件下鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的最大代谢速率，同时观察到经0.5微摩尔环丙沙星处理的细胞其代谢速率相应下降。利福平处理对鲍曼不动杆菌DSM-30008的热图具有显著影响，也观察到热释放明显减少，这与代谢活性的降低相关。注意所有测试浓度下达到峰值时间的延长，以及由于各浓度斜率降低所导致的代谢速率下降，这通常归因于杀菌效应。为确保最佳结果，在转移样品时应使用反向移液技术，并防止插入物侧壁残留额外液体，同时确保盖子已正确关闭。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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我们介绍一种结核分枝杆菌计数的替代方法...

一种功能性全血检测法，用于测定分枝杆菌的存活能力，使用报告基因标记的卡介苗或结核分枝杆菌（BCG lux/M.Tb lux）

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样品制备 结核分枝杆菌 核磁共振代谢组学研究用提取物

对细菌培养物进行连续稀释，并将等分试样加入含有比色培养基的量热小瓶中。将密封的小瓶装入等温微量热仪的多孔板中，以测量代谢产热。该设备保持恒定温度，以确保检测到的热量完全来源于细菌代谢。当细菌代谢营养物质并增殖时，会释放热量，传感器可实时检测到这些热量。同时，将相同的试管放入培养箱中孵育。使用分光光度计测量光密度（OD）以监测细菌生长情况。利用稀释过程中的量热信号，构建热活性曲线，并将其与OD值进行关联。明显的第一个峰表明在指数生长期发生了有氧呼吸。当氧气变得受限时，细胞会转向无氧发酵，产生第二个明显的峰值。进入稳定期后，细菌会分泌酶以降解胞外蛋白质并维持代谢，从而产生一个宽峰。...

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本方案描述了一种利用高通量条件筛选噬菌体混合物抗菌效果的可靠方法。...

通过高通量条件评估噬菌体对食源性病原体的生物防控效果

我们描述了使用薄层色谱直接生物自显影法和液相色谱-质谱联用技术，以植物病原真菌Sclerotinia...

基于薄层色谱-直接生物自显影技术的生物测定导向天然产物生防活性成分鉴定

本方案通过将培养组学与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）相结合，实现对乳制品中微生物组成的快速、低成本评估。该方法获得的分类学结果与16S...

利用细菌蛋白质组学分析评估乳制品的微生物安全性 通过 基质辅助激光解吸电离方法

学习使用等温微量热法分析新型抗菌化合物的作用机制，实时监测A.baumannii等细菌的代谢变化。该方法为药物研发提供重要的杀菌效果评估手段。

利用等温微量热法进行代谢谱分析以确定新型天然产物的杀菌或抑菌效应

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