从高粱叶片组织中分离组蛋白用于潜在表观遗传标记的自上而下质谱分析

本方案揭示了高粱植株发育和抗旱性的表观遗传标记。这种分子层面的理解将有助于开发更优的解决方案，以适应未来极端气候下的作物种植。该方案可从高粱叶片组织中提取高纯度的组蛋白，适用于通过质谱技术进行非靶向的翻译后修饰分析。

演示该实验步骤的是来自EMSL的学士后研究助理Shadan Abdali和Tanya Winkler。首先，用液氮研磨少量高粱叶片，并将其储存于50毫升离心管中，置于负80摄氏度条件下。每个样品的组蛋白分析使用约4克叶粉。

按照文本稿件中的描述配制提取缓冲液1、2A和2B，并向提取缓冲液1中加入一片蛋白酶抑制剂，使其终浓度为0.2X。然后向研磨后的叶片粉末中加入20毫升配制好的提取缓冲液1，轻轻混合或涡旋振荡10分钟。使用100目筛网，每次用两毫升提取缓冲液1将过滤后的材料冲洗两次。

接下来，在4°C条件下，使用摆桶转子以3,000 × g离心滤液10分钟，以沉淀细胞碎片和较大的亚细胞器。同时，通过加入蛋白酶抑制剂配制提取缓冲液2A，使其终浓度为0.4X。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。

然后将沉淀重悬于5 mL已配制的提取缓冲液2A中，冰上轻柔混匀，孵育10分钟。将溶液在4°C条件下，以2,100 × g离心15分钟（使用摆桶转子），以沉淀细胞碎片和细胞核。

小心倾去上清液，避免扰动沉淀。通过加入蛋白酶抑制剂至终浓度为1X，制备提取缓冲液2B。将5 mL该制备好的缓冲液加入离心后获得的沉淀中。

在4°C条件下，使用摆桶转子以2,100 × g离心15分钟，使碎片和细胞核沉淀。同时，通过加入一片蛋白酶抑制剂片剂来配制细胞核裂解缓冲液。小心倾倒上清液，避免扰动沉淀物，并将沉淀物重悬于250 µL裂解缓冲液中。

以最大速度涡旋震荡溶液15秒以混匀并重悬物质。然后在4摄氏度下超声处理5分钟，并在-80摄氏度下保存。解冻冷冻的细胞核样品，加入750微升5%胍缓冲液。

然后在 4°C 下超声处理 15 分钟。将样品转移至 2 毫升离心管中，在 4°C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟。同时，通过用 2 毫升乙腈和 4 毫升水冲洗离子交换色谱柱，以尽量减少柱表面的污染。

将约 200 至 300 微升弱阳离子交换树脂上样至色谱柱中，静置使树脂沉降。用胍缓冲液洗涤树脂四次，将收集管和色谱柱置于冰上。将色谱柱置于 2 毫升收集管上，缓慢将制备样品的上清液加至树脂床中，避免扰动树脂。

当溶液流经柱子时，将洗脱液重新加载到柱子顶部六至八次，以确保与树脂的最大结合。然后加入2 mL 5%盐酸胍缓冲液，洗涤去除非组蛋白。用1 mL 5%盐酸胍缓冲液洗脱组蛋白，并收集洗脱液。

用500微升洗涤溶剂清洗一个三万道尔顿截断的离心过滤器，然后使用预先清洗过的离心过滤器对剩余洗脱液进行脱盐。在LC-MS特征图谱的特定区域观察到主要的组蛋白，表明实验成功。该代表性图谱中，虚线框内显示了完整的全长组蛋白。

通过H2B和16千道尔顿H2A蛋白变体的LC-MS特征图谱可以看出，两者均具有多个序列相似的同源物，这由独特的产物会话编号标明。另一组不具有延伸尾部的H2A组蛋白也可观察到。通过分析此处所示LC-MS特征图谱中的质量差异，可观察到H4组蛋白蛋白的N端乙酰化、额外的赖氨酸乙酰化以及甲硫氨酸氧化修饰。

已鉴定出两种H3组蛋白的蛋白质序列，分别为H3.3和H3.2。采用电子转移解离碎裂技术生成所鉴定的H3.2蛋白变体的碎裂谱图。此处展示了前体离子以及前一个和后一个Ms1谱图，其匹配的同位素峰以紫色标出。

可以利用序列覆盖图谱对翻译后修饰进行定位。通过比较不同蛋白形式的相对丰度，发现了与样本条件特异相关的截短组蛋白蛋白形式的变化。在部分样本中，仅在第三周和第九周观察到H4的C末端截短现象。

对于H3.2，N端截短的蛋白形式在第10周通常更为丰富。相比之下，C端截短的H3.2则出现在较早的时间点。H4的C端截短蛋白形式在BTx642中显著多于RTx430。

进行该实验方案时，需密切注意上清液和沉淀的颜色。颜色变化有助于识别叶绿体研磨或裂解过程中可能出现的问题。我们希望这一从小麦叶片中分离组蛋白的可靠方案能够为其他类似植物的表观遗传学研究提供支持。