Name: 通过实验室间比较，对液态介质中的金纳米粒子进行纳米粒子跟踪分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学习使用纳米粒子跟踪分析技术测量液态介质中金纳米粒子的水动力直径。该方法基于布朗运动和斯托克斯-爱因斯坦方程，可实现准确、可靠的粒径测定，适用于纳米材料表征和质量控制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢H2020资助项目ACEnano（资助协议编号720952）提供的经费支持。本工作还部分得到了国际科技合作研究计划的支持。&amp;#38;D 计划，由韩国产业通商资源部资助（项目编号 N053100009，“Horizon2020 韩国-欧盟合作研发”）&amp;#38;BD 在 ACEnano 工具箱”），该支持使得韩国合作方能够参与“地平线2020”ACEnano 项目联盟。

本文所述方法用于第三次实验室间比对。
1. 样品制备
<ol>
	<li>使用 0.02 µm 注射器滤膜过滤水。在将水用于样品稀释前，必须进行水的过滤以去除任何污染颗粒。</li>
	<li>如需分析新制备的样品，将 60 nm 金胶体分散液用过滤后的超纯水按体积稀释 50 倍。建议用于 NTA 分析的浓度为每毫升 1 × 107 – 1 × 109 个粒子。</li>
</ol>
2. 进行测量
<ol>
	<li>启动系统
	<ol>
		<li>连接纳米颗粒追踪分析仪（NTA）、注射泵和计算机。开启硬件和软件。相关软件（见材料表）将确保所有硬件通信正常运行，并显示实时温度读数。</li>
		<li>从NTA中取出激光模块，使用擦镜纸和压缩空气彻底干燥玻璃表面以及低体积流通池（LVFC）的内部通道、管路和流体接口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>管路预润
	<ol>
		<li>用超纯水冲洗进样流体管路，以去除任何颗粒物，并减少可能干扰测量的气泡产生。冲洗时，将仪器外壳内进样管路的末端放入废液容器中。</li>
		<li>将装有1 mL过滤水的1 mL注射器（无针头）插入鲁尔接口，并在背压允许的情况下尽可能快地推动约900 μL液体通过进样管路。保留含有剩余液体的注射器连接在管路上，以防止虹吸现象发生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射泵管路连接
	<ol>
		<li>将LVFC安装到激光模块上，形成样品室，如图1所示。将出样管路连接至LVFC右侧接口。 
		注意：进样和出样管路的直径不同，进样管路直径小于出样管路。若将进样与出样管路连接颠倒，可能导致流通池压力过高并发生泄漏。</li>
		<li>断开进样管路上的注射器，更换为装有1 mL过滤水的新注射器，确保液体与液体直接接触。将进样管路连接至LVFC左侧接口。缓慢向样品室中注入约500 µL液体，注意避免引入气泡。最终的管路连接配置如图2所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于分子生物学应用中DNA分离的电泳槽。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：安装在激光模块上的低体积流通池组件。 
<img alt="流动池示意图：带有注射器、进液管和出液管的低体积流动池装置，用于流体分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：低体积流动池管路配置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>激光模块装载与系统检查
	<ol>
		<li>将装有注满水的LVFC的激光模块插入仪器中，并锁定到位。</li>
		<li>将注射器放入注射泵支架中并固定。在软件界面中点击Start Camera以初始化相机。在界面的Hardware选项卡中，点击Scatter以移动至参考位置。</li>
		<li>将相机增益设为16，并手动调节焦距，检查稀释液中是否存在颗粒。通过在主观察窗口左键单击并上下拖动鼠标，调整视野位置以检查是否有颗粒。若视野中颗粒数量超过三个，则表明水质或清洗过程存在问题，因此需要重复清洗过程，或更换、过滤用水。</li>
		<li>从仪器中取出激光模块。</li>
		<li>断开注射器与进样管路的连接，更换为仅充满空气的注射器。缓慢将空气注入样品室，以排出内部液体。从激光模块上取下LVFC，并断开管路连接。使用水清洁LVFC的玻璃表面及激光模块的光学玻璃，然后用纸巾和压缩空气干燥。用压缩空气干燥管路。将LVFC重新组装到激光模块上并连接管路，准备进行样品装载。 
		注意：此步骤并非总是必需，但在本实验中作为额外预防措施加入，以进一步减少可能的变异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>装载样品
	<ol>
		<li>重复步骤2.2.2。将装有1 mL第1.1步制备的60 nm金纳米颗粒分散液的注射器连接至Luer接口。在激光模块置于仪器外部可视条件下，通过进样管路缓慢注入750 µL样品，确保不引入气泡。</li>
		<li>将激光模块重新装入NTA仪器中，并在软件界面中点击Start Camera以初始化相机。在界面的Hardware选项卡中，点击Scatter以移动至参考焦距位置，检查设置是否正确，以获得清晰的颗粒图像。</li>
		<li>检查视野是否相对于激光束位置居中。如有需要，在软件的主观察窗口中左键单击并上下拖动鼠标进行调整。</li>
		<li>运行AutoSetup功能，自动优化焦距和相机增益，确保获得最佳图像质量。 
		注意：自动化的相机和焦距参数设置可在不同实验室之间提高一致性，因其不受操作者影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品分析
	<ol>
		<li>在Standard measurement的SOP选项卡中创建测量程序，以在缓慢流速（颗粒应约在10秒内从屏幕一侧移动到另一侧）和恒定流速条件下获取5段重复的60秒视频（Supplementary File 1）。 
		注意：建议使用流动模式，以确保测量时能更好地代表整体样品。当对样品施加缓慢流动时，更多新颗粒会流经测量区域并在实验过程中被分析，从而显著提高浓度测量的精确度和重复性。视频时长取决于粒径分布特征及其在分析过程中的变化情况。通常认为5段60秒的视频为典型的测量时长。</li>
		<li>设置实验数据的文件名和保存路径，然后开始运行。按照上述流程进行的分析由“地平线2020”ACEnano项目中的七家实验室完成17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
注意：所有数据分析均在 v 3.4 软件中完成（参见材料表），未使用任何额外的手动换算或计算。颗粒粒径数据以直方图分布形式直接呈现，该数据基于颗粒位置变化的测量结果，利用斯托克斯-爱因斯坦方程计算得出。软件可确定每个颗粒在 x 和 y 平面上移动的平均距离。该值可用于确定颗粒的扩散系数（D），若已知样品温度 T 和溶剂黏度 η，则可进一步计算出颗粒的等效球形流体动力学半径 RH。样品温度由纳米颗粒追踪分析仪（NTA）自动记录。软件默认采用水的黏度值，并已包含在上述测量脚本中；但当使用不同的样品稀释液时，用户可在测量前或测量后根据需要修改黏度值。
<ol>
	<li>在软件的检测阈值（Detection Threshold）下，通过拖动滑动条或点击+和-按钮设置检测阈值（DT），该参数用于优化可视化颗粒的追踪效果，其取值范围为2至20。应确保所选的DT值能够识别并追踪尽可能多的可见颗粒（软件图像屏幕上会自动以红色叉号标记）。
	<ol>
		<li>设置检测阈值的参考标准为：一幅图像中被识别出的颗粒数量应大致在30–80个之间，其中观察者认为并非真实颗粒的位置所对应的红色叉号不应超过10个，且观察到的蓝色叉号（代表噪声）不应超过5个。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="粒径分布图；浓度与直径关系；纳米技术分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：检测阈值设置的观察结果。 左侧为不良的检测阈值设置，右侧为良好的检测阈值设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>通过点击软件中的 Process 按钮，自动处理粒子追踪分析视频。所有处理参数均保持默认自动设置，并将数据导出为 .csv 格式的结果文件，其中包含完整的粒径分布以及描述测量设置的附加元数据。为验证测量质量，可查看软件中的 Analyze 选项卡，或检查 .csv 输出文件中是否存在警告信息或提示。PDF 结果报告的示例如 Supplementary File 2 所示。</li>
	<li>从 PDF 报告中读取众数粒径结果及其对应的标准偏差。 
	注：众数粒径结果用于比较七家实验室之间获得的粒径数据，结果展示并讨论于第 5 节中。</li>
</ol>
4. 清洗与干燥
<ol>
	<li>使用后，用清水彻底冲洗系统，以清除管路和光学表面残留的所有样品痕迹。可通过观察视野中颗粒物的数量来监测清洗效果。</li>
	<li>从NTA仪器上拆下激光模块。</li>
	<li>通过系统加载一管空气，以排空管路和LVFC。</li>
</ol>

<ol><li>Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxidative+toxicity+of+Ag+and+ZnO+nanoparticles+towards+the+aquatic+plant+Spirodela+punctuta+and+the+role+of+testing+media+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science-Processes+and+Impacts%22%5BJournal%5D)">The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters.</a> Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).</li>
<li>Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformations+of+nanomaterials+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Transformations of nanomaterials in the environment.</a> Environmental Science & Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).</li>
<li>Auffan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+definition+of+inorganic+nanoparticles+from+an+environmental%2C+health+and+safety+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective.</a> Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).</li>
<li>Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+safe+are+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How safe are nanomaterials.</a> Science. 350 (6259), 388-389 (2015).</li>
<li>Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+impacts+of+polyvinylpyrrolidone+%28PVP%29+capped+metal+oxide+nanoparticles+on+Daphnia+magna%3A+role+of+core+composition+and+acquired+corona%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona.</a> Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).</li>
<li>Hassellöv, M. aR. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHassell%C3%B6v%2C+MaRK+%22Analysis+and+Characterization+of+Manufactured+Nanoparticles+in+Aquatic+Environments.+Environmental+and+Human+Health+Impacts+of+Nanotechnology%22">Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 211-266 (2009).</li>
<li>Hoet, P., Brüske-hohlfeld, I., Salata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+known+and+unknown+health+risks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and known and unknown health risks.</a> Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12(2004).</li>
<li>Briffa, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+transformations+of+manufactured+nanomaterials+as+a+proposed+proxy+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing.</a> Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).</li>
<li>European Commission. Nanotechnology. European Commission. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ec.europa.eu/nanotechnology/policies_en.html">http://ec.europa.eu/nanotechnology/policies_en.html</a> (2011).</li>
<li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271(2017).</li>
<li>Dynamic Light Scattering - common terms defined. Malvern. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.malvern.com/en/support/resource-center/Whitepapers/WP111214DLSTermsDefined.aspx">http://www.malvern.com/en/support/resource-center/Whitepapers/WP111214DLSTermsDefined.aspx</a> (2015).</li>
<li>Walker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nano-particle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Improved nano-particle tracking analysis.</a> Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605(2012).</li>
<li>Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx">https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx</a> (2019).</li>
<li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li>
<li>Roebben, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+size+and+surface+charge+measurements+on+nanoparticles+prior+to+biological+impact+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment.</a> Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675(2011).</li>
<li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%3A+An+Interdisciplinary+Forum+for+Nanoscale+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101(2013).</li>
<li>Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cordis.europa.ue/project/id/720952">https://cordis.europa.ue/project/id/720952</a> (2019).</li>
<li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoille%2C+P+%22Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations%22">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations</a>. 1360, VC, SPIE (1990).</li>
</ol>

作者 Jo Sullivan、Agnieszka Siupa、Pauline Carnell-Morris 和 Michele Carboni 任职于 Malvern Panalytical Ltd.，该公司生产本文所用的仪器。

第一轮ILC获得的不一致结果凸显了对较老系统进行仪器健康检查的必要性，以及制定更详细的标准操作程序（SOP）、开展实操培训、并加深对测量与分析设置的理解，以确保不同实验室之间获得更一致的结果。事实上，Hole等人的研究发现，由于缺乏关于如何使用NTA系统及制备样品的统一指南，即使对于相对单一分散的样品，不同实验室之间仍存在显著的测量差异16。因此，所有ILC参与者均参加了一次培训研讨会，内容涵盖系统操作与测量条件的最佳实践，以及针对特定NTA仪器的清洁与维护指导。所有参与者还在后续ILC轮次中，使用各自实验室内的相同仪器进行了测量。该流程首先通过在各实验室本地运行乳胶标准样品的ILC（ILC第二轮），对系统进行验证，随后由各合作方重复金纳米颗粒的测量（ILC第三轮）。通过NTA测量这些金样品的目的，在于增强纳米材料风险评估方法与实践的可信度与清晰度，从而推动纳米安全性指导规范的完善。
纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种可测量颗粒流体动力学球形等效直径的技术，可用于对粒径范围从10 nm至50 nm到约1000 nm的多分散体系（具体范围取决于样品特性和仪器配置）进行逐颗粒、实时的可视化分析。该方法所需的样品前处理步骤极少。尽管前处理操作简单，但此步骤对实验流程至关重要，在稀释样品和选择稀释液时必须格外谨慎。颗粒形状可能成为NTA应用的限制因素，因为该技术获得的是球形等效尺寸，对于非球形颗粒，其尺寸测量值的准确性会降低。
对于纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术，由于仅从整体样本中观测代表性子样本，因此始终会存在一定的结果差异。尽管如此，所有结果均符合 ISO 19430 粒径测量标准。通常，在30至60秒的分析时间内，最佳检测浓度约为108 个颗粒/mL。对于颗粒浓度较低的样本，需要延长分析时间以确保结果的可重复性。对于颗粒浓度超过109 个颗粒/mL的样本，追踪困难的可能性更高，因此需要将样本稀释至适合NTA测量的浓度范围。
总体而言，来自3的实验结果rd&#160;圆形ILC显示出NTA测量金纳米颗粒具有良好的可重复性，且准确性和重现性有所提高。所有NTA测量均采用软件中“自动设置”功能所选定的自动相机亮度和聚焦设置来调节图像。软件设定的相机亮度非常一致，在所有情况下均设置为10或11，表明正如预期，流程中自动化程度越高，结果的一致性越好。粒径测量结果与制造商通过透射电子显微镜（TEM）获得的结果相当，表明结果具有可重复性；然而，由于TEM测定的是颗粒的几何直径而非流体动力学直径，不同技术之间存在微小差异是可预期的。结果一致性的显著提升，凸显了仪器维护、详细的标准操作程序（SOP）、最佳实践更新、用户知识积累以及NTA测量自动化应用的重要性与优势。综上所述，ILC验证了该特定NTA标准操作程序，从而为这一特定纳米材料风险评估方法提供了可信度与明确性。

纳米材料（NMs）在物理和化学特性上可能具有多样性，这些特性进而影响其行为、稳定性及毒性1,2,3,4,5。在深入理解纳米材料的性质、危害和行为时，一个主要困难在于能否获得关于其物理和化学特性的可重复信息。此类物理性质的示例包括粒径及其分布6,7,8。这些是关键参数，因为它们构成了欧盟委员会（EC）对“纳米”一词定义的核心要素9。
实现精确的颗粒尺寸测量对于多种不同的工业和科研应用及过程至关重要，此外还关系到对纳米材料（NMs）归趋和毒性效应的理解6,10。必须建立完善的方法，以准确、可靠且可重复地测量纳米材料的尺寸。此外，所报告的信息应深入说明所采用的技术，例如明确尺寸参数的类型（如实际尺寸或流体动力学尺寸），以及样品所处的条件，例如纳米材料所处的具体介质，并确保该方法在不同介质中均能稳定可靠地运行。为了测量尺寸，可采用多种技术，包括电子显微镜（EM）、动态光散射（DLS）、单颗粒电感耦合等离子体质谱（spICP-MS）、差分离心沉降（DCS）、扫描探针显微镜（SPM）、小角X射线散射（SAXS）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）。
纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种相对较新的技术，近年来已得到显著发展，被证明能够可靠地测量在复杂水相介质（如具有环境相关性的淡水体系）中球形纳米材料的流体动力学直径。流体动力学直径是指“一个假设的刚性球体的直径，该球体以与被测颗粒相同的方式扩散”11；从实际意义上看，在水相介质中，该直径大于颗粒本身的尺寸，还包括被颗粒表面弱静电作用力吸附的一层分子（主要是水分子）。颗粒的流体动力学直径在不同介质中会有所变化，随着测量介质离子强度的升高而减小。
NTA 技术的另一个重要特征是，它能够实现以数量为权重的粒径测量，而这正是欧盟纳米材料定义所要求的。该技术具有高分辨率，并可对单个颗粒进行分析，因此当测试样品为异质样品且颗粒通量较高时，该方法不易受到团聚体或较大颗粒的干扰10,12。
测量过程包括制备合适的样品悬浮液，通常需要对样品进行稀释，随后记录颗粒布朗运动行为的视频并进行视频分析。从样品室中穿过一束激光，悬浮在激光路径中的颗粒会散射光线，从而可通过配备相机的光学显微镜实现可视化。相机捕获由在布朗运动下移动的颗粒所散射的激光光的视频文件。可分别追踪多个颗粒以确定其扩散系数，并利用斯托克斯-爱因斯坦方程计算其流体动力学直径：d = kT/3πηD，其中d为流体动力学直径，k为玻尔兹曼常数，T为温度，η为黏度，D为扩散系数10。纳米颗粒跟踪分析（NTA）还可用于追踪通常胶体不稳定的颗粒的聚集行为（然而，颗粒在测量时间尺度内必须保持胶体稳定）13,14。NTA是一种绝对测量方法，本研究所用仪器无需系统校准。若用户希望检查系统性能，可通过测量尺寸标准物质来轻松完成，测量频率可根据需要自行决定。
NTA 仪器操作简便，分析时间短（每个样品不到 10 分钟）。为了获得高质量、数据重复性和再现性良好的测量结果，在样品制备和仪器操作过程中均需考虑多种因素。如果未能仔细考虑这些因素，不同实验室和操作人员对同一样品的测量结果可能会存在未知或难以准确量化的不确定性。在纳米颗粒表征过程中，即使采用内部优化的最佳实践标准操作程序（SOP），也不一定能保证与其他实验室的一致性，Roebben 等人对动态光散射（DLS）技术的研究已表明了这一点15。
事实上，不同实验室、用户和仪器之间进行的早期（第一轮）纳米颗粒跟踪分析（NTA）实验室间比对（ILC）显示了结果的不一致性。其中一个主要问题在于使用了多种老旧的传统仪器，这些仪器未进行定期维护或校准检查，同时也存在方法解读上的差异。Hole 等人开展的一项 NTA ILC 研究发现，在缺乏关于如何使用系统和制备样品的统一指南的情况下，即使对于相对单分散的样品，不同实验室之间的结果变异也可能很大16。这一发现，连同 ILC 第一轮的结果，凸显了良好仪器维护、方法培训以及完善的标准操作规程（SOP）的重要性。后者作为描述和记录符合良好实践要求的有力工具，若编写详尽，标准操作规程（SOP）可提供清晰性、解释性、可理解性、标准化和质量保证。
因此，采用ILC研究的建议对于开发和测试方案均十分理想16。该ILC实验旨在验证这一特定的NTA标准操作程序（SOP），从而为这一特定的纳米材料风险评估方法提供了可靠性和明确性。该实验共包括三轮。第一轮在培训前，由每位参与者使用各自实验室的仪器分析60 nm金纳米颗粒。第二轮使用一台配置统一的新仪器分析100 nm乳胶颗粒，作为简单测试，以确认仪器设置正确，且使用者已掌握仪器操作方法。第三轮在培训后，使用配置统一的新仪器分析60 nm金纳米颗粒。参与ILC的人员来自七个不同的实验室，均为“地平线2020 ACEnano项目”17的联盟成员。
本文旨在讨论纳米颗粒追踪分析（NTA）技术第三轮比对研究的方法与结果，其中60 nm的金纳米颗粒在经过详细培训并制定标准操作程序（SOP）后，由七个合作单位重新分析。本文还将对比并参考国际实验室比对（ILC）第一轮所获得的结果。ILC第三轮的所有分析均使用相同型号且配置一致的仪器（见材料表），配备405 nm激光器和高灵敏度sCMOS相机。比对研究通过评估技术在样品上的表现，推动“最佳实践”方案的建立。因此，本文还向科学界公开了本ILC所用仪器的NTA方法，该方法已依据国际标准通过开展和评估ILC实现了标准化。

<table><tbody><tr><td>60 nm 金胶体分散液</td><td>BBI Solutions OEM Ltd.</td><td>产品编号 EM.GC60，批号 024650</td><td></td></tr><tr><td>0.02 &amp;micro;m 注射器滤器 - Whatman Anotop 25 无菌注射器滤器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA68092102</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight</td><td>Malvern Panalytical Ltd.</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 软件 v3.4</td><td>Malvern Panalytical Ltd.</td><td>v3.4</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯/聚乙烯无针鲁尔滑动接头注射器，中心式，容量 1&amp;nbsp;mL，带刻度（最小分度 0.01&amp;nbsp;mL），无菌</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z230723</td><td></td></tr></tbody></table>

通过实验室间比对对水相介质中金纳米颗粒进行纳米颗粒追踪分析

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

在纳米技术领域，分析表征对于理解纳米材料（NMs）的行为和毒性具有至关重要的作用。表征过程必须全面，所选择的技术应与待测定的性质、被分析的材料及其所处介质相适应。此外，仪器操作和方法学必须经过充分开发，并被使用者清晰理解，以避免数据采集错误。任何方法或操作步骤上的偏差都可能导致结果差异以及数据重现性差。本文旨在阐明通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测量金纳米颗粒流体动力学直径的方法。本研究在七个不同实验室之间开展了实验室间比对（ILC），以验证标准操作程序（SOP）的性能和重现性。该ILC研究的结果揭示了详细的标准操作程序、最佳实践更新、用户知识以及测量自动化的重要性与优势。

使用不同NTA仪器配置的第一轮ILC结果如图4所示。除第6号实验室外，5次捕获重复之间的重复性良好，但多家实验室记录的众数粒径高于预期。第6号实验室的结果显示出较差的重复性，且测得的众数粒径明显偏高。经调查发现，报告粒径变异最大的系统要么未按推荐要求进行维护，要么分析过程受到样品制备不一致的影响，其中稀释步骤可能因移液设备、操作人员操作和技术差异，以及测量设置（包括流动池不洁净、使用了错误的相机增益水平、图像未正确聚焦，或分析检测阈值设置不当）而引入变异。
<img alt="模式尺寸（nm）数据分析箱线图，比较不同实验室和仪器的统计结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：ILC 第一轮模式尺寸结果。 第一轮60 nm金纳米颗粒分散体系在不同NTA仪器上测得的模式尺寸结果，数据来自所有NTA基准测试合作实验室（x轴上以缩写表示）。
所有实验室通过采用相同的SOP和仪器设置，提高了第三轮NTA结果的准确性。第三轮ILC的众数粒径结果如图5所示。所有实验室测得的平均众数粒径为62.02 ± 1.97 nm。第三轮的所有测量结果相较于第一阶段结果更为一致，各结果均落在制造商声明的该批次平均粒径60.5 nm的10%范围内。制造商声明的金标样品变异系数≤8%。
<img alt="按实验室编号划分的众数粒径（nm）箱线图、统计变异性图表，显示60 nm阈值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：ILC 第三轮众数粒径结果。所有NTA基准测试合作方使用同一台NTA仪器分析60 nm金纳米颗粒ILC第三轮的众数粒径结果。所有实验室的平均众数粒径为62.02 ± 1.97 nm。
为验证制造商提供的粒径，采用透射电子显微镜（TEM）对少量颗粒（N=82）进行了分析。取约10 µl未稀释的分散液滴加到碳膜覆盖的铜制TEM载网上，空气中干燥后，在200 kV条件下使用分析型透射电子显微镜进行成像。从颗粒重叠较少的区域获取图像（如补充图1所示），并采用半自动图像分析方法进行分析。应用自动分水岭法对颗粒进行分割，排除该过程中产生的伪影及边缘颗粒18。平均直径通过长轴与短轴的平均值计算得出（61 ± 7 nm），或基于测量面积换算得到（62 ± 6 nm），后者假设颗粒为球形。颗粒形态多呈球形，平均长宽比为1.1。TEM结果显示出的直径略大于制造商提供的数值（60.5 nm），但仍在公差范围内。此外，该结果与纳米颗粒追踪分析（NTA）测得的流体动力学直径值具有很好的一致性。
补充图1：60 nm金纳米颗粒的透射电子显微镜图像。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741supfig01.jpg" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
补充文件1：测量脚本。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/Measurement_script.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：PDF 结果报告示例。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/PDF_results_report.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案旨在通过纳米颗粒跟踪分析法（NTA）测量球形纳米颗粒（更具体而言是金纳米颗粒）在水相介质中的流体动力学直径。该方法通过追踪颗粒由布朗运动引起的位移，并结合斯托克斯-爱因斯坦方程计算出其流体动力学直径。

在纳米技术领域，分析表征对于理解纳米材料（NMs）的行为和毒性具有重要作用。

本方案采用纳米颗粒跟踪分析技术，对目标纳米材料的流体动力学直径进行准确、可靠且可重复的测量。该方法操作快速简便，通过逐颗粒的实时可视化分析和极少的样品前处理，即可实现对颗粒流体动力学球形等效直径的测定。在进行测量之前，需将用于分析的超纯水体积通过0.02微米的注射器滤膜过滤。用过滤水适当稀释样品。对于此60纳米金胶体分散液样品，按体积稀释50倍。连接纳米颗粒追踪分析仪（NTA）、注射泵和计算机，并开启硬件和软件。从系统中拆下激光模块，使用纸巾和压缩空气彻底干燥玻璃表面以及LVFC的内部通道、管路和流体接口。将LVFC放置到激光模块上，然后用四颗螺丝对角拧紧以固定。将出口管路连接到细胞右侧的接口上。将进样管插入废液瓶中，并在背压允许的情况下尽快冲洗900微升清洗液。将连接在进样管上的注射器更换为含有1毫升过滤水的新注射器，然后将进样管连接到流动池的左侧端口。随后缓慢向样品室注入约500微升液体，注意在加样过程中避免引入气泡。安装激光模块时，将装有水的LVFC插入仪器中，并固定液流池。固定注射器和注射器泵支架，然后在软件界面中点击“Start Camera”以初始化相机。在硬件选项卡中，点击“Scatter”以移动参考位置，并将相机水平设置为16。手动调节焦距，检查稀释液中是否存在任何颗粒；在主观察窗口中单击并拖动鼠标左键，调整视野位置以检查是否存在颗粒。为清洁系统，将注射器更换为仅充满空气的注射器，并缓慢用空气替换腔室中的水。从仪器上取下激光模块中的样品池，并断开各段管路的连接。用清水清洁激光模块的光学玻璃以及LVFC的玻璃表面，然后用纸巾和压缩空气擦干。重新组装LVFC和激光模块并对管路进行预灌注后，将装有1毫升60纳米金纳米颗粒悬浮液的注射器连接至下方端口，缓慢将750微升样品注入LVFC腔室中。安装激光模块并初始化相机后，单击“散射”（Scatter）按钮，将参考焦点移至适当位置，确认焦点已正确设置，以获得清晰的颗粒图像。检查视野是否相对于激光束位置居中，然后运行自动设置功能，以自动优化焦距和相机亮度，确保获得最佳图像质量。为分析样品，打开标准测量标准操作程序选项卡，设置仪器在缓慢且恒定的流动条件下采集五段60秒的视频。然后设置数据的文件名和存储位置，并开始运行。为了分析数据，在“检测阈值”选项卡中拖动滑动条，设置检测阈值，以尽可能检测并追踪到所有可见的颗粒。确保观察到的代表噪声的蓝色十字不超过五个。要自动处理颗粒追踪分析视频，请点击“设置”、“确定”，并将所有处理参数保持在自动设置状态。数据处理完成后，将数据导出为 CSV 格式的结果文件。此处展示了使用不同纳米颗粒跟踪分析仪器配置获得的第一轮实验室间比对结果。除了第六实验室外，五个捕获重复之间的重复性良好，尽管有几家实验室记录的众数粒径高于预期。通过所有实验室采用相同的标准操作程序和仪器设置，第三次圆形试验的纳米颗粒追踪分析结果准确性得到提升，各实验室的平均模式为 62.02 ± 1.97 纳米。可通过透射电子显微镜图像计算颗粒的平均直径，该方法作为纳米颗粒追踪分析（NTA）的补充技术，可用于验证颗粒尺寸、形态和长径比。在此分析中，颗粒主要呈球形，平均长径比为 1.1。使用前必须确保低体积流通池已彻底清洗，样品经过适当稀释、充分加载并正确聚焦，并严格遵循标准操作程序。该方法还可用于其他各类纳米颗粒的表征，包括外泌体和病毒，以支持稳定性研究和质量控制工艺。

nanoparticle-tracking-analysis-gold-nanoparticles-aqueous-media

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

通过实验室间比较，对液态介质中的金纳米粒子进行纳米粒子跟踪分析

本文描述了一种用于评估聚合物基因递送纳米颗粒的纳米颗粒追踪分析（NTA）和高通量流式细胞术的实验方案。NTA...

通过纳米颗粒追踪分析与高通量流式细胞术评估聚合物基因递送纳米颗粒

我们利用等离子体纳米颗粒的光学追踪技术来探测和表征水生生物的运动频率。...

通过等离激元纳米颗粒的光学追踪分析卤虫无节幼体（Artemia salina）的运动

提供了一种基于可调节严格度磁珠筛选方法的小分子靶标结构转换型适体选择方案。具有结构转换特性的适体有利于需要通过构象变化来指示靶标存在的检测方法，例如文中所述的金纳米粒子检测法。...

一种用于比色法金纳米粒子检测的构象转换型适体筛选方法

我们介绍了一种合成生物相容性10 nm金纳米颗粒的方法，通过在表面包被聚乙二醇对其进行功能化。这些颗粒可用于 体外 和 体内...

功能化10 nm聚合物包被金颗粒的合成及其在内皮靶向与药物递送中的应用

本文展示了利用传统暗场显微镜监测金纳米棒（AuNRs）在细胞膜上动态行为的方法。通过ImageJ和MATLAB检测单个AuNRs的位置和取向，并利用单颗粒追踪分析对其扩散状态进行表征。...

利用单纳米颗粒暗场显微技术可视化金纳米棒在细胞膜上的扩散动力学

本方案描述了采用不对称流场-流场分离技术结合紫外-可见光检测法测定未知金纳米颗粒样品尺寸的方法。...

用于悬浮液中金纳米颗粒粒径分析的非对称流场-流场分离技术

本研究展示了为测试紫外-可见光谱法（UV-Vis）表征金（Au）胶体分散液的标准操作程序（SOP）而设计的六家实验室间比对（ILC）的基准测试结果，参与比对的六家单位均来自H2020...

水相中纳米材料的紫外-可见光谱表征

我们演示如何使用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪器，来估算从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离出的细胞外囊泡的粒径分布及总颗粒浓度。...

纳米颗粒追踪分析用于细胞外囊泡的定量与粒径测定

纳米颗粒追踪分析（NTA）是一种广泛用于表征细胞外囊泡的方法。本文重点介绍了NTA实验参数与对照，以及分析和表征样品及稀释液的统一方法，这些内容是对MISEV2018和EV-TRACK指南的必要补充，以实现实验室间的可重复性。...

提高可重复性以符合《2018年细胞外囊泡研究最低信息标准》中的纳米颗粒追踪分析指南

本实验方案描述了一种可克隆的电子显微镜标记技术，该技术利用基于新型自成核抑制机制的金纳米颗粒合成方法，用于检测细胞中金属硫蛋白标签蛋白。...

细胞内直接合成电磁可见金纳米颗粒用于超微结构良好保存的蛋白质定位分析

学习使用纳米粒子跟踪分析技术测量液态介质中金纳米粒子的水动力直径。该方法基于布朗运动和斯托克斯-爱因斯坦方程，可实现准确、可靠的粒径测定，适用于纳米材料表征和质量控制。

通过实验室间比对对水相介质中金纳米颗粒进行纳米颗粒追踪分析

探索更多视频