Name: 鼠脑水平海马片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学习制备小鼠水平海马脑片的标准化方案，用于保留关键纤维通路完整性并进行电生理学研究。该方法支持突触可塑性与神经病理机制的深入探索。

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感谢VIB-KU Leuven脑与疾病研究中心在Keimpe Wierda博士和Joris De Wit教授指导下的电生理学部门，为我们提供研究设施的使用。此外，我们感谢KU Leuven离子通道研究实验室以及子宫内膜、子宫内膜异位症与生殖医学实验室所有成员，感谢他们富有建设性的讨论和宝贵意见。
本项目获得了弗兰德斯研究基金会（Research Foundation-Flanders，项目编号：G.084515N 和 G.0B1819N，授予 J.V.）以及鲁汶大学（KU Leuven）研究委员会（C1 资助项目 C14/18/106，授予 J.V.）的资助。K.P. 是弗兰德斯科学基金会（FWO）[PEGASUS]2 玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里研究员，获得了欧盟“地平线 2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议（665501）与弗兰德斯研究基金会（FWO）（项目编号：12T0317N）的联合资助。K.H. 是比利时弗兰德斯研究基金会的博士后研究员（项目编号：12U7918N）。

本研究的所有动物实验均经比利时鲁汶大学（KU Leuven）伦理审查委员会批准（编号：P021/2012）。
1. 高蔗糖切片溶液和人工脑脊液（ACSF）的制备
<ol>
	<li>实验前一天
	<ol>
		<li>使用实验室一级纯水配制1 L的10倍切片预溶液，其中含有（单位为 mM）：25 KCl、20 CaCl2、10 MgSO4、12.5 KH2PO4（表1）。为防止磷酸钙沉淀，先在烧杯中加入800 mL H2O，然后在磁力搅拌器持续搅拌下缓慢加入上述化学试剂。溶液可储存于4 °C或室温（RT）条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验当天
	<ol>
		<li>使用实验室一级纯水配制1 L的1倍人工脑脊液（ACSF），其中含有（单位为 mM）：125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、1 MgSO4、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、25 葡萄糖（表2）。使用蒸汽压渗透压计检测其渗透压，确保在305–315 mOsm之间（pH值约为7.55–7.6）。 
		注意：为防止磷酸钙沉淀，先在烧杯中加入800 mL H2O，然后在磁力搅拌器持续搅拌下缓慢加入所有固体化学试剂。最后缓慢滴加1 M储备液中的MgSO4和CaCl2至所需量。</li>
		<li>在室温下持续用碳合气（carbogen）鼓泡1倍ACSF溶液，以调节pH值至7.3–7.4之间。 
		注意：若pH值略高或略低，轻微调整碳合气通气强度即可。若在通碳合气条件下pH仍高于7.45，可通过滴加数滴1 M NaH2PO4溶液进行调节。</li>
		<li>在烧杯中配制250 mL（每只脑组织）的1倍高蔗糖切片溶液，其中包含25 mL 10倍切片预溶液，并含有（单位为 mM）：252 蔗糖、26 NaHCO3、10 葡萄糖（表3）。确认其渗透压在320–325 mOsm之间（pH值约为7.55–7.6）。</li>
		<li>用碳合气对高蔗糖切片溶液鼓泡10–15分钟，以控制pH值在7.3–7.4之间。 
		注意：若在通碳合气条件下pH高于7.45，可通过滴加数滴1 M KH2PO4溶液进行调节。</li>
		<li>将高蔗糖切片溶液置于超低温冰箱（-80 °C）中冷冻20–30分钟，直至部分结冰。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脑解剖工作区的准备
<ol>
	<li>在高蔗糖切片溶液冷却过程中，准备以下物品。
	<ol>
		<li>将水浴锅预热至 32 °C。</li>
		<li>用饱和碳合气的人工脑脊液（ACSF）溶液填充恢复室（图 2A），并将恢复室置于水浴锅中。持续向主 ACSF 瓶和恢复室中的 ACSF 溶液通入碳合气。</li>
		<li>将动物转移至实验室内。 
		注意：动物的年龄、性别和品系需由实验人员根据具体研究问题自行确定。然而，为保证不同实验日之间的可比性，同一项研究中动物的参数应保持一致。本方案适用于 2–6 周龄的 C57BL/6J 雄性小鼠。若使用更年长的动物，可能需要相应调整切片和恢复溶液4,27（例如，采用基于 NMDG+ 的溶液23,28），以维持急性脑片的脑组织健康。</li>
		<li>准备好麻醉室。</li>
		<li>准备好以下物品：纸巾、开口较宽的塑料巴斯德吸管（已剪开）、盛有冰块的 90 mm 培养皿、置于冷藏培养皿上的滤纸片、用于断头的锋利剪刀、解剖剪、弯头镊子、刮刀、35 mm 培养皿、细毛刷、刀片、标本板（随振动切片机提供）、超级胶水、移液器吸头、四条滤纸条（约 2 cm × 0.5 cm）（图 2A）。</li>
		<li>设置振动切片机：首先，将振动切片机设定为正确的参数（刀片行进速度：0.08 mm/s，切割振幅：1.4 mm，切割频率：85 Hz），并将碳合气管路连接至切片室。然后，将切片室放入支架中，在切片室周围的支架内放入冰块，并将整个装置固定到振动切片机上。最后，将刀片安装至振动切片机的刀片夹持器中（图 2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高蔗糖溶液冷冻完成后，执行以下步骤。
	<ol>
		<li>20–30 分钟后，将高蔗糖切片溶液从 -80 °C 超低温冰箱中取出，并将烧杯置于冰上保持低温。</li>
		<li>将高蔗糖溶液放置在振动切片机旁的实验台上，用刮刀捣碎并搅拌部分冻结的溶液，使其形成均匀的冰沙状，并开始通入碳合气进行鼓泡。</li>
		<li>用塑料巴斯德吸管吸取部分高蔗糖切片溶液，润湿放置在冷藏 90 mm 培养皿上的方形滤纸。</li>
		<li>用高蔗糖切片溶液填充 35 mm 培养皿（或任何适合储存完整脑组织的等效小容器）至 75%，并将培养皿置于盛有冰块的容器上冷却，该冰容器应靠近装有剩余溶液的烧杯。同时对 35 mm 培养皿中的溶液通入碳合气。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠脑组织的解剖与定位
<ol>
	<li>使用5%异氟烷麻醉动物。通过夹捏足爪判断麻醉深度，应无足爪回缩反射。</li>
	<li>将动物置于滤纸上，用锋利的剪刀或小型动物断头器进行断头。</li>
	<li>使用解剖剪剪开头皮。</li>
	<li>沿矢状缝切开颅骨，并借助弯头镊子将其移除，直至整个脑组织（包括嗅球）完全暴露。 
	注意：操作时需小心，避免颅骨锐缘或镊子损伤脑组织。</li>
	<li>使用刮铲小心地将脑组织完整取出（嗅球应保持附着）。</li>
	<li>将脑组织转移至预冷的35 mm培养皿中，用盛有ACSF的巴斯德移液管轻轻冲洗脑组织，去除所有毛发或血渍（血液对脑组织具有细胞毒性作用29）。</li>
	<li>借助刮铲将脑组织转移至置于预冷90 mm培养皿上方的湿润滤纸上（图2A）。</li>
	<li>使用刀片将脑组织沿中线切为两半，分离左右半球，并将两个半球切面朝下放置于新鲜切割面上。</li>
	<li>使用刀片平行于背侧顶端切除每个半球背侧部分（5%–10%）（图2C）30，然后将两个半球以腹侧朝上的方向放置于新切面上。</li>
	<li>在样品板上滴加一滴超级胶水，并用移液枪头适当涂抹，以容纳两个脑半球。</li>
	<li>使用滤纸条通过毛细作用力轻轻接触脑半球腹侧，将其提起，避免直接接触组织造成损伤。</li>
	<li>使用另一条滤纸条小心地将脑半球背侧部分半干燥，然后将半球背侧朝下放置于样品板的胶水上。对第二个半球重复相同操作。 
	注意：两个脑半球应在振动切片机载物板上呈水平对称排列，头端朝外，尾端相对（但不接触）位于中央；两个半球的内侧面应朝向振动切片机刀片，外侧面朝向操作者（图2D）。</li>
	<li>将样品板放入切片室，并迅速而小心地用冰冻的高蔗糖切片液冰浆覆盖。一旦溶液接触胶水，即会凝固，从而将脑半球牢固粘附于样品板上。</li>
	<li>确保脑半球完全被高蔗糖切片液覆盖，并确认溶液已持续通入碳合气（carbogen）。 
	注意：整个解剖过程应尽可能快速完成。请确保脑组织在无氧供应状态下停留时间不过长。从断头到脑组织浸入高蔗糖切片液冰浆的时间应控制在约1–1.5分钟内。这是制备高质量急性脑切片最关键的条件。</li>
</ol>
4. 脑组织的水平切片
<ol>
	<li>将振动切片机刀片置于半球内侧前方，并将其下降至与现在朝上的半球腹侧相同高度。借助振动切片机控制装置，将刀片再向背侧方向下降600 µm，然后开始切片。刀片应接触到组织（若未接触，可反转刀片并再略微降低）。持续切片，直至前两片完全与两个半球分离。</li>
	<li>反转刀片，再降低300 µm，再次进行切片。</li>
	<li>当海马结构变得可见时（如有需要，可参考小鼠31脑图谱）（图2E），使用加宽的塑料巴斯德吸管收集切片。持续收集切片，直至在海马旁出现尾状壳核。通常，从小鼠脑中可收集到8–12片300 µm厚的切片（每半球4–6片）。</li>
	<li>使用塑料巴斯德吸管收集切片，并将其转移至水浴中的恢复室（图2F）（每次切片后立即收集，以防止切片在切片室中漂浮）。 
	注意：操作应尽可能迅速，并确保在整个过程中高蔗糖切片液保持冰冻且通入碳氧混合气（carbogen）。如有需要，及时补充切片室周围的冰块。</li>
</ol>
5. 用于电生理记录的脑切片回收
<ol>
	<li>将切片置于盛有ACSF的恢复室中，在32 °C水浴中孵育1 h。 
	注意：恢复室也可从商业途径获得。</li>
	<li>将恢复室从水浴中取出。</li>
	<li>在开始任何后续操作前，将切片在室温下至少再放置30 min以继续恢复。</li>
</ol>
6. 海马内侧穿通路（MPP）中fEPSP记录
<ol>
	<li>使用水平拉管仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制记录电极，当电极充满人工脑脊液（ACSF）并浸入盛有ACSF的记录浴槽中时，其电阻应约为 2 MΩ。</li>
	<li>将ACSF灌流液及含有适当化学物质（例如荷包牡丹碱，Bicuculline）的ACSF溶液加入重力驱动的多通道灌流系统，并连接至记录浴槽。持续用碳合气（carbogen）对所有溶液进行通气饱和。</li>
	<li>启动连接于抽吸管路的蠕动泵或真空泵，抽吸管末端应位于记录浴槽中灌流管路的对侧。打开盛有ACSF的灌流通道，建立连续灌流（每秒1–2滴）。确认参考电极已浸入ACSF溶液中。</li>
	<li>开启实验装置的计算机、放大器、显微操作器、刺激器、显微镜光源、摄像头及显示器（如配备）。</li>
	<li>打开适用于电生理记录的软件（目前存在多种不同硬件与软件供应商提供的电生理设备配套软件）。</li>
	<li>将一个脑片半球从恢复室转移至切片记录装置的记录浴槽中，并将其正确定位，使齿状回颗粒细胞层和分子层处于视野范围内。确保刺激电极能够从内嗅皮层方向到达脑片中的内侧穿通通路（MPP），同时记录电极能从CA3方向的正对侧进入MPP区域。</li>
	<li>使用回形针（图3A）或 commercially available 脑片固定网将脑片在记录浴槽中固定。 
	注意：在转移和定位脑片时，可暂时关闭灌流，但操作应迅速，以保证脑片质量。</li>
	<li>将记录电极和刺激电极降低并定位至分子层下三分之一靠近颗粒细胞层的内侧穿通通路（MPP）区域（图3B），两电极相对放置，间距约为100–150 µm。刺激电极应轻微接触组织表面，而记录电极则需略微插入脑片上层组织中。</li>
	<li>对脑片施加低强度刺激（30–50 µA，持续0.1 ms），以获取群体兴奋性突触后电位（fEPSP）信号。如有必要（例如fEPSP信号幅值过低或波形异常），调整电极位置。</li>
	<li>开始记录输入-输出（Input-Output）曲线：每隔30秒递增刺激强度，施加于脑片。</li>
	<li>将刺激强度设定为最大fEPSP反应的50%，并以该强度每隔30秒施加一次刺激，持续记录基线fEPSP 20–40分钟。</li>
	<li>若基线稳定，可继续进行后续记录（例如长时程增强/LTP或长时程抑制/LTD实验方案和/或药物干预）。本实验中，MPP的LTP诱导采用四次1秒100 Hz脉冲刺激，每次间隔5分钟；荷包牡丹碱（Bicuculline）在条件化刺激前10分钟开始施加，并持续至条件化阶段结束。 
	注意：所有记录应在电流钳模式下进行，并采用适当的低通滤波（&#60;5 kHz）和采样率（&#62;10 kHz）。</li>
	<li>将数据导出为合适的文件格式，并分析fEPSP相关参数，如纤维放电波（fiber volley）、fEPSP幅值及fEPSP斜率。</li>
</ol>
7. 脑切片的钙成像记录
<ol>
	<li>将一个脑切片半球转移至12孔板中，并加入合适的钙敏感染料孵育30分钟至1小时。通过在12孔板盖上用加热的18G针头自制的小孔插入通气管，持续对孵育液进行碳氧混合气体（carbogen）通气。 
	注意：对于内源性表达荧光报告蛋白（如GCaMP）的转基因动物脑切片制备，此步骤非必需。</li>
	<li>按照步骤6.2–6.5所述准备记录装置。 
	注意：进行微荧光成像实验时无需放大器或显微操作器。刺激器的使用取决于具体实验需求。进行荧光成像实验必须使用专用软件。</li>
	<li>调整软件至正确的成像参数设置：包括相机放大倍数和像素合并（binning）设置、波长设定、曝光时间及时间序列采集程序。具体设置可能因实验而异。（示例轨迹图采用的参数为：1 × 1像素合并，2.4倍前置放大增益，&#160;300 EM相机增益，在488 nm波长下每次曝光50 ms，每500 ms重复一次，持续整个实验过程。）</li>
	<li>染料孵育完成后，将脑切片半球从12孔板转移至记录用灌流槽，并置于显微镜载物台上。</li>
	<li>用回形针（图3A）或商业可购得的脑切片固定网（类似于步骤6.7中描述的类型）在记录槽中固定切片。</li>
	<li>确保目标区域位于显微镜视野中央并聚焦清晰。</li>
	<li>使用荧光成像软件在切片上选择多个感兴趣区域（ROIs）。 
	注意：为监测因光漂白引起的整体亮度波动，可选择整个视野作为参考区域。</li>
	<li>开始记录，并在预设的时间点施加实验性测试药物。 
	注意：建议在每次实验结束时施加高钾（K+）溶液，以验证细胞的神经元特性及脑切片的质量。</li>
	<li>将数据导出为合适的文件格式，并分析整个测量过程中各感兴趣区域（ROIs）内的荧光信号变化。感兴趣区域也可在离线分析阶段进行调整。 
	注意：文献中已有其他描述脑切片fEPSP记录和钙离子微荧光成像的实验方案24,32,33,34,35。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管脑片制备技术在神经科学领域被广泛使用，但也存在若干缺点。例如，脑片中感兴趣脑区的输入和输出连接已不再保持完整。此外，一旦被分离，脑组织会随着时间推移逐渐发生降解，这一过程可能改变脑片的生理状态。这一点尤为令人关注，因为大多数脑片记录实验持续数分钟至数小时，导致实验日程较长，而所记录的组织可能在实验开始前6–8小时就已完成分离。此外，脑片制备过程中脑脊液和血液供应中断，可能导致脑片内缺乏重要的内源性物质。最明显的是，切片操作本身可能造成机械性组织损伤，从而影响实验结果的可靠性。然而，脑片制备技术的实际优势仍远大于其缺点，因此该技术在神经科学研究中仍被视为一种极为重要且广泛应用的方法。
急性海马脑片是一种功能强大的技术，因此被广泛用于从分子水平到复杂脑环路研究的神经元过程研究。这得益于海马理想的神经解剖结构，该结构在脑片制备过程中易于保存18。因此，海马脑片被广泛应用于多种科学研究项目中，包括药物筛选17、参与认知功能的神经元和突触特性研究40,41，以及病理脑状态的探究14,42,43。然而，广泛多样的应用也导致了多种可选的脑片制备方案，这些方案在诸如解剖条件、切面方向等多个参数上可能存在差异。因此，必须根据科学研究的具体问题来确定合适的脑片制备方案。
组织切片机是制备海马脑片最早使用的技术之一44,45。该制备方法的主要优点包括切片机成本低以及操作快速简便46。然而，组织切片机会引起机械应力，导致形态学改变和细胞死亡47。相比之下，振动切片机是一种较为昂贵的设备，且切片制备时间显著延长，这可能会影响脑片的质量。但振动切片机通常能更温和地将脑片从组织中分离，并可在整个分离过程中保持脑组织良好冷却和供氧，从而改善脑片的性能46。因此，多个研究团队已常规采用该技术，并提出了使用振动切片机制备急性海马脑片的实验方案16,30,48。部分方案仅对切片过程本身提供少量细节，而更侧重于此类脑片制备的特定应用48；另一些方案则提供了详细的切片流程，在切割平面或其他实验细节（例如琼脂糖包埋或脑片孵育/恢复溶液）方面有所不同，如本文所述27,30。
本文所述方案提供了一种简便的方法，用于制备来自幼年小鼠的高质量急性水平海马脑片。该方案特别适用于保存穿通通路（内侧和外侧），即从内嗅皮层投射至海马的海马输入通路8,49,50。矢状面、冠状面以及分离海马的横切片制备方法均无法充分保留穿通通路，该通路主要起源于内嗅皮层的第二层和第五层，并投射至海马内的多个区域18。由于内嗅皮层相对于海马的解剖位置关系，必须采用水平脑片切片方式，才能在切片制备中完整保留穿通通路纤维31。此外，水平切片还能理想地保存从齿状回投射至海马CA3区神经元的苔藓纤维9,30,50。因此，该制备方法对于研究海马输入通路及与齿状回（DG）相关过程具有重要价值。此外，本方案也可用于研究Schaffer侧支通路50。然而，在研究CA3至CA1纤维投射时，通常更常使用矢状面和冠状面脑片制备方法，可能因其制备时间略短，有助于提高获得高质量切片的概率。尽管如此，水平海马切片制备仍是一种强大的研究工具，因为它可在单一切片半球内同时保留并研究所有海马纤维通路。这在研究神经环路反应时尤为有用，例如在多电极阵列记录实验中。
制备脑切片时的一个主要关注点是脑组织的适当保存。这通过本方案中的几个关键步骤实现，包括快速解剖、持续且充分的组织供氧与冷却，以及采用低钠高蔗糖切片液进行保护性切割的方法39,51。尽管本方案的成功率约为90%，但在处理来自年老或遗传背景多样的动物的组织时，或在试图保存特定细胞群体时，可能还需要额外的保护措施。已有多种方法被报道可用于保护敏感的脑组织制备。这些方法包括使用基于NMDG的切片液以减少钠离子通透52，在切片液中添加高浓度镁离子以阻断NMDA受体活性53，以及在恢复期持续使用保护性溶液23。所有这些措施均可降低兴奋性毒性。此外，在处理年老动物时，通常需要采用冰冻保护性人工脑脊液进行经心脏灌注27。
急性海马脑片因其能够从相对较厚（300–500 µm）的急性脑片中获得高幅信号，从而保证较高的信噪比，因此非常适用于并被广泛用于电生理研究11。常用的电生理技术包括细胞外场电位记录以及在电压钳或电流钳模式下的细胞内全细胞记录。为了获取高质量的电生理数据，脑片的健康状态至关重要，可通过严格遵循本方案来保障。然而，由于脑片制备是一种高度敏感的技术，建议在每次实验开始前常规进行质量检查。可采用多种参数作为脑片质量评估指标，通常通过输入-输出曲线以及基线fEPSP或EPSC记录进行标准评估19。但应注意，电生理特性不佳可能源于实验操作误差，例如电极位置、方向不当或组织损伤，并不一定完全反映脑片本身的健康状况。因此，建议进行额外的质量控制，例如在40倍物镜下直接观察细胞形态，或进行DAPI细胞核染色。此类质量检查可用于确认在多次脑片制备过程中脑片健康状态的稳定性。
钙离子微荧光测定法是一种较少使用但具有重要价值的技术，可用于研究海马脑片。该技术是对标准细胞外和细胞内电极记录的有益补充，因为它能够可视化并量化细胞内钙离子流，而钙离子流在神经元和突触信号传导中具有重要意义。细胞内钙离子浓度的变化参与了神经递质囊泡释放、突触后电位产生、突触可塑性调节以及轴突神经传导54,55,56。作为该技术的一个示例（图4），我们使用了一种市售的钙离子荧光染料。不可否认的是，使用钙离子染料处理组织切片可能会带来一些困难，例如实验时间延长以及位于较深层的神经元细胞染料加载效率低下。然而，可通过该技术的多种改进方法来克服这些技术难题。例如，可在海马脑片中将钙离子检测与膜片钳记录相结合。通过膜片钳电极将钙离子荧光染料导入特定细胞，即可实现对某一特定目标细胞中钙离子动态变化的测量57。此外，也可使用经基因工程改造、在全脑或由细胞特异性启动子驱动表达钙离子指示蛋白GCaMP58的动物。有趣的是，来自GCaMP动物的脑组织若将指示蛋白直接连接至某一目标蛋白，则可为研究神经元中的表达模式，或探讨其在钙火花和钙波中的作用提供新的机会。
综上所述，我们提供了从小鼠制备健康且具有活性的水平海马脑切片的指南，用于电生理和成像记录。该方法对于研究齿状回中描述的脑部病理所引起的神经学变化非常有用。

对海马体的广泛探索始于Scoville和Milner报告了一例患者（H.M.）在因治疗严重癫痫而接受手术切除海马体及邻近颞叶结构后，无法形成新的陈述性记忆1。自那时起，人们对海马体的研究不断深入，从基本的神经元特性与功能，逐步扩展到癫痫和阿尔茨海默病等严重脑部疾病的发病机制研究2,3,4,5。海马体是边缘系统的一部分，该系统由一组与情绪和记忆形成相关的脑结构组成6,7。多条纤维通路构成的密集网络使海马体与脑内、外结构之间建立了紧密的连接。这些通路包括内侧和外侧穿通通路（内嗅皮层至齿状回、CA3–CA1及下托）8、苔藓纤维通路（齿状回到CA3）9以及Schaffer侧支/联合连合通路（CA3到CA1）10（图1）。由于海马体神经元层具有高度保守的层状结构组织，并且相对容易获取具有活性的神经元培养物和脑切片，因此它至今已成为被研究最为广泛的脑区之一5。
<img alt="海马神经元通路示意图，显示 CA1、CA2、CA3、DG 和 EC 之间的连接及信号流向。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：示意图展示海马不同区域及主要纤维通路。 不同的海马区域以实色线条表示：内嗅皮层（EC；黑色）、齿状回（DG；橙色）、Cornu Ammonis（CA）3（青色）、2（黄色）、1（品红色）以及下托（绿色）。纤维通路以彩色虚线表示：内侧穿通通路（MPP，红色）和外侧穿通通路（LPP，蓝色）（从内嗅皮层至齿状回、CA3、CA1 和下托）、苔藓纤维通路（MF，紫色）（从齿状回到 CA3）以及Schaffer 侧支通路（SC，棕色）（同侧从 CA3 到 CA1）/联合连合通路（AC，浅绿色）（对侧从 CA3 到 CA1）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
脑切片技术通常会导致来自较远脑区与目标区域之间的连接丢失5。此外，毛细血管不再具有功能5，且血液循环被剥夺11。尽管存在这些局限性，由于具备多种优势，脑切片仍被广泛用于海马体神经生理功能的研究。首先，海马体的分离操作快速12，且所需材料较少。唯一必需的仪器包括解剖工具包、实验室水浴设备、碳氧混合气体（carbogen）供应装置以及振动切片机（vibratome）13。脑切片技术的其他优势还包括避开了血脑屏障（BBB），并在实验开始前可清除内源性释放的分子5，从而实现对药物作用的相对精确的剂量控制研究14。此外，脑切片能够保留海马体内的细胞结构和突触环路15,16，其中神经解剖结构、神经元连接以及复杂的神经元-胶质细胞相互作用等局部微环境均得以维持4,11,17。另外，海马纤维连接主要为单向性，且海马神经元具有较高的突触可塑性，这极大地简化了高质量电生理记录的获取与解释，有助于理解神经系统活动过程18,19。重要的是，脑切片是一种极具价值的研究工具，可广泛应用于多种不同的科学技术中，涵盖从分子生物学技术、成像记录到电生理测量等多个领域12,20,21,22,23,24,25,26。
如上所述，海马脑片是一种强大的实验工具，可用于研究突触连接的结构和功能特征。这为评估化学物质或基因突变对神经元兴奋性和可塑性的影响提供了机会16。
急性脑切片制备是一种相对敏感的技术，切片质量在很大程度上依赖于理想的实验条件，包括动物的年龄、安乐死方法、解剖与切片速度、切片溶液及参数（如切片速度）以及切片恢复条件4。因此，一个设计良好的实验方案至关重要，可确保不同研究单位之间的可重复性13。
本文提供了一种急性水平海马脑片制备的详细方案，旨在保持海马外侧和内侧穿通路以及苔藓纤维通路的完整性，从而便于研究与齿状回相关的过程9。我们将详细描述分离、取出及水平切取小鼠脑组织的关键步骤，并展示在野生型C57BL/6J小鼠脑片中，于基础状态下以及长时程增强（LTP）诱导过程中，钙离子微荧光记录和场兴奋性突触后电位记录（fEPSPs）的代表性结果。

<table><tbody><tr><td>麻醉室</td><td>自制 - 通用</td><td>N/A</td><td>聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）</td></tr><tr><td>麻醉蒸发器</td><td>博士&amp;auml;ger &amp;和 MSS International Ltd</td><td>异氟烷蒸汽 19.3 &amp;& MSS 异氟烷</td><td>用于啮齿类动物麻醉的异氟烷汽化</td></tr><tr><td>灌流系统的储液桶</td><td>TERUMO</td><td>无针头皮下注射器</td><td>https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html</td></tr><tr><td>荷包牡丹碱甲碘化物</td><td>hellobio</td><td>HB0893</td><td>https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>科学产品</td><td>GB150F-8P</td><td>https://science-products.com/zh/shop/微移液管制造-1/微移液管拉制仪用毛细管/硼硅酸盐玻璃毛细管/硼硅酸盐带丝环抛光毛细管</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>默克</td><td>102382</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/zh/product/氯化钙二水合物,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>钙成像软件</td><td>Till Photonics</td><td>LiveAcquisition v2.3.0.18</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen气罐</td><td>Air Liquide</td><td>Alphagaz 混合气 B50</td><td>气体混合物 CO2/O2：5/95，纯度 5</td></tr><tr><td>簇状微电极</td><td>FHC</td><td>CE2C55</td><td>https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/</td></tr><tr><td>培养皿（35 mm）</td><td>康宁生命科学</td><td>353001</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/zh/细胞培养/细胞培养器皿/培养皿/Falcon&amp;reg;-细胞培养皿/p/353001</td></tr><tr><td>培养皿（90 mm）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>101VR20</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11270-20</td><td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20</td></tr><tr><td>D-AP5</td><td>hellobio</td><td>HB0225</td><td>https://www.hellobio.com/dap5.html</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖一水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16301</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=zh&amp;和区域=BE</td></tr><tr><td>数字CMOS相机</td><td>HAMAMATSU</td><td>ORCA-spark C11440-36U</td><td>https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html</td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>精细科学工具</td><td>14058-09</td><td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut&amp;reg;/14058-09</td></tr><tr><td>DNQX</td><td>hellobio</td><td>HB0262</td><td>https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html</td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>Andor</td><td>iXon TM + DU-897E-CSO-#BV</td><td>https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE</td></tr><tr><td>EPC10 USB 双膜片钳放大器</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895278</td><td>https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>VWR</td><td>516-0818</td><td>413级</td></tr><tr><td>细毛刷</td><td>Raphael Kaerell</td><td>8204</td><td>尺寸 #1</td></tr><tr><td>18G针头</td><td>Henke Sass Wolf Fine-Ject</td><td>18G × 1 1/2&quot; 4710012040</td><td>https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>德克拉动物保健产品</td><td>Iso-Vet 1000mg/g</td><td>250 ml 瓶</td></tr><tr><td>Loctite 406</td><td>亨kel 粘合技术</td><td>Loctite 406</td><td>超级胶水</td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>默克</td><td>105886</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/zh/product/七水合硫酸镁,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Luigs &amp;和诺伊曼</td><td>SM-10 配 SM-7 远程控制系统</td><td>https://www.luigs-neumann.org</td></tr><tr><td>显微镜（用于钙成像）</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/</td></tr><tr><td>显微镜（用于电生理记录）</td><td>Zeiss</td><td>Axio Examiner.A1</td><td>https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/</td></tr><tr><td>显微镜光源</td><td>CAIRN 研究</td><td>双路 OptoLed 电源供应器</td><td>https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/</td></tr><tr><td>单色仪</td><td>Till Photonics</td><td>多色染色 V</td><td></td></tr><tr><td>N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3262</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=zh&amp;&region=BE</td></tr><tr><td>俄勒冈绿&amp;reg; 488 BAPTA-1</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>#06807</td><td>10×50 μg</td></tr><tr><td>渗透压计</td><td>Wescor</td><td>5500 蒸气压渗透压计</td><td>验证盐溶液的渗透压</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Masterflex C/L 77120-62</td><td>https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229</td></tr><tr><td>pH计</td><td>WTW</td><td>inoLab 系列 pH 720</td><td>https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf</td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>化学实验室</td><td>CL00.1133</td><td>https://www.chem-lab.be/#/zh-cn/prod/1393528</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>默克</td><td>104873</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/zh/product/磷酸二氢钾,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>用于制备半脑的剃刀刀片</td><td>SPI 供应品</td><td>安全型卡式瓶分配器 - 每包10个</td><td>GEM 科学级单刃剃须刀片</td></tr><tr><td>用于振动切片机的剃刀刀片</td><td>Ted Pella 公司</td><td>121-6</td><td>双刃可折型剃刀刀片（聚四氟乙烯涂层不锈钢）</td></tr><tr><td>恢复室</td><td>自制 - 通用</td><td>N/A</td><td>用于收集和储存脑切片（详见论文正文）</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>任何公司</td><td>N/A</td><td>刀片应锋利，长度至少15 cm，以便于断头操作</td></tr><tr><td>银电极丝</td><td>任何公司</td><td></td><td>用于记录电极和参考电极</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物</td><td>默克</td><td>106342</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/zh/product/磷酸二氢钠二水合物,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Alfa Aesar</td><td>14707</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/014707/</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3160/60</td><td>https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420</td></tr><tr><td>野外录音软件</td><td>HEKA Elektronik</td><td>PatchMaster</td><td>https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9147-12EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=zh&amp;和区域=BE</td></tr><tr><td>刺激器</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-FLEX</td><td>http://www.ampi.co.il/isoflex.html</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>VWR International Ltd.</td><td>102745C</td><td>https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf</td></tr><tr><td>用于碳合气体、灌注和抽吸管路的导管 1</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0167</td><td>用于标准阀门系统的Tygon管路（TY-50）</td></tr><tr><td>用于碳合气体、灌注和抽吸管路的导管 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>800/100/200 &amp;amp; 800/100/280</td><td>Smiths Medical Portex 细径低密度聚乙烯导管</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>自制 - 通用</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>8阀多通道灌流系统</td><td>自制</td><td>N/A</td><td>由桶体、管路和自制的自动阀门控制系统组成（所有购买部件的规格详见下表）</td></tr><tr><td>磁力阀（用于控制灌注管路）</td><td>NResearch Inc.</td><td>p/n 161P011</td><td>https://nresearch.com/</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>14912000001</td><td>半自动振动刀片切片机 VT1200</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Memmert</td><td>WNB 7</td><td>https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf</td></tr><tr><td>水纯化系统</td><td>默克</td><td>协同作用微孔板</td><td>以获得高纯度水</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>CELLSTAR，665180</td><td>http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf</td></tr></tbody></table>

小鼠脑水平海马切片

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

海马体是大脑中结构高度有序的区域，属于边缘系统的一部分，参与记忆的形成与巩固，同时也与阿尔茨海默病和癫痫等严重脑部疾病的发生密切相关。海马体具有高度的内部及外部连接性，从而确保其与大脑内部和外部结构之间的正常通信。这种连接性通过多种以纤维通路形式存在的信息传递路径实现。在研究海马体神经生理功能时，脑切片是一种常用的方法。海马体脑切片可用于多种不同的实验应用，包括电生理记录、光学显微镜测量，以及多种分子生物学和组织化学技术。因此，脑切片是研究蛋白质功能、探索神经系统疾病中病理生理过程以及开展药物发现的理想模型系统。
脑片制备有多种不同的方法。使用振动切片机进行脑片制备能够更好地保持组织结构的完整性，并在切片过程中保证充足的氧气供应，相比传统的组织切片机具有明显优势。此外，振动切片机可用于不同切面方向的脑片制备。本文提供了一套详细的实验方案，用于成功制备小鼠脑组织的振动切片式水平海马脑片。与其他脑片制备方法相比，水平切片能够使海马输入通路（穿通纤维）的纤维结构在脑片内保持完全完整，从而有利于研究内嗅皮层-海马之间的相互作用。本文详细介绍了小鼠脑组织的解剖、取出及急性水平切片的完整操作流程，并讨论了该技术中的难点与潜在问题。最后，我们还将展示脑片在后续应用中的一些使用实例。

实验方案所需工具与关键步骤的总体概述 
图2 展示了本方案所述制备水平急性海马脑片所需的所有必要工具和关键步骤。通常，仅需少量关键仪器，包括若干解剖工具和一个切片恢复室（图2A），实验室水浴锅，以及切片振荡器（vibratome）图2B). 图2C–E 在切片制备过程中可视化大脑及半球的重要步骤和方位。 图 2F 是水平脑切片预期结果的示意图。
内侧穿通通路中 fEPSP 的记录 
经过恢复期后，脑片可用于 fEPSP 的电生理记录。本实验使用配备多通道重力控制灌流系统的直立显微镜（图 3A 和 图 3B）。将玻璃微电极（~ 2 MΩ）充满 ACSF 溶液，并连接至涂有氯化银的银电极上，该电极安装在与浴槽中氯化电极构成回路的运算放大器上。通过将玻璃微电极插入脑片上层海马的 MPP 区域，利用放大器和相应的记录软件进行 fEPSP 的记录与可视化。使用双触点簇状微电极在记录电极上游的 MPP 区施加不同强度的刺激电流以诱发 fEPSP。需注意，本方案的目的并非详细说明如何获取 MPP 记录，而仅以 MPP 区的记录为例，展示本文所述脑片制备方案的成功效果。若研究者拟开展 MPP 记录，可能需要进行特定对照实验（如双脉冲记录），以确认记录位点的准确性，并将 MPP 与 LPP 区分开来8,36,37。
图3C 展示了fEPSP记录的一个阴性（左图，质量较差的脑片）和一个阳性（右图，高质量脑片）示例。阴性示例的轨迹显示纤维容积（FV）振幅很大，甚至高于实际的fEPSP振幅（≈0.5 mV）。相比之下，高质量脑片示例（右图）显示出较小的FV/fEPSP比值以及较高的fEPSP振幅（&gt;0.5 mV）。纤维容积（FV）是在刺激的神经纤维去极化时产生的信号，因此出现在突触后电位（fEPSP）之前。FV与fEPSP特性之间的关系提供了有关轴突和突触特性保存状况的重要信息。具有完整神经纤维的高质量脑片应表现出较高的fEPSP振幅与FV的比值。相反，传导特性受损的低质量脑片则fEPSP/FV比值降低。类似地，脑片的存活能力可通过绘制fEPSP斜率与纤维容积振幅的关系图进行分析（图3D）。
此外，输入-输出曲线（fEPSP斜率和FV振幅随刺激强度的变化）通常用于评估脑片质量。该曲线通过向脑片施加逐渐增强的电流刺激，并记录相应的fEPSP反应而获得。由于保存不良的脑组织传导性能较差，低质量脑片表现出降低的输入-输出曲线（图3E,F）。此外，输入-输出曲线对于确定研究突触过程的理想刺激强度范围至关重要。理想情况下，刺激强度应设定在引发最大反应所需强度的50%左右。在此选定的刺激强度下，fEPSP反应对突触可塑性的任何变化均高度敏感，从而为研究长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）提供了机会。
为了研究突触可塑性，需在诱导阶段之前，对选定的50%刺激强度下脑片的突触传递（fEPSP斜率）进行较长时间的监测（通常为20–40分钟）。健康的脑片应具有稳定的基线，而基线不稳定的脑片则不能用于后续的诱导实验，以研究脑环路的突触可塑性（图3G，上图）。fEPSP基线记录也可用于监测药物对突触传递本身的效应（图3G，下图）。通常将记录的fEPSP基线信号的平均值用于标准化fEPSP的时间进程，并将其设定为100%。
可通过向脑片施加特定的条件化方案来研究突触可塑性。这些方案取决于所研究的脑回路及感兴趣的机制（例如LTP或LTD）。由于门控γ-氨基丁酸能抑制作用在齿状回MPP突触中较强，因此在该部位诱导LTP需要采用较强的条件化刺激方案38。据报道，在使用高蔗糖切片液制备的脑片中，γ-氨基丁酸能抑制作用更为显著39。在此，我们采用一种包含四次刺激的方案，每次刺激为持续1秒的100 Hz脉冲，各次刺激间隔5分钟，并在GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱（Bicuculline）存在下进行（图3H）。在条件化期间同时加入NMDA和荷包牡丹碱可增强LTP（图3H）。脑片质量差或突触传递不稳定（fEPSP基线不稳定）可能导致LTP或LTD诱导异常或失败。因此，在研究突触过程时，必须使用高质量的脑片制备，并严格采用剔除标准：包括fEPSP幅度与纤维容积比过低（<3）、fEPSP斜率过小（<0.5 mV/ms）或幅度过小（<0.5 mV），以及fEPSP基线不稳定（变化超过5%）的脑片均视为不可用。
齿状回颗粒细胞层中的钙微荧光测量 
恢复后，将脑切片在室温下孵育 2 µM 避光条件下，在含碳合气的ASCF中孵育钙敏感性染料1小时。将脑片转移至记录室（图 3A) 在配备多通道重力控制灌流系统的直立荧光显微镜下进行。在488 nm激发光照射后，每500毫秒采集一次荧光发射图像图4A,B）。激发采用氙灯和装有扫描衍射光栅单色仪的系统，图像采集由计算机控制的CCD相机完成。在测量过程中，脑片用NMDA受体拮抗剂APV处理，导致细胞内钙浓度降低。用含高钾浓度（50 mM）的细胞外溶液刺激脑片，引起大量细胞外钙离子内流，这是由于神经元去极化及电压门控离子通道开放所致。图 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化合物</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
			<td>分子量 (g/mol)</td>
			<td>质量 (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>25</td>
			<td>74.55</td>
			<td>1.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>20</td>
			<td>147.01</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>246.48</td>
			<td>2.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>12.5</td>
			<td>136.08</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：10倍切片预溶液（1 L）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化合物</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
			<td>分子量 (g/mol)</td>
			<td>用量 (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>2</td>
			<td>来自 1 M CaCl2 溶液</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>1</td>
			<td>来自 1 M MgSO4 溶液</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 * 2H2O</td>
			<td>1.25</td>
			<td>156.02</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose * H2O</td>
			<td>25</td>
			<td>198.17</td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：1x ACSF（1 L）（渗透压介于305–315 mOsm之间）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化合物</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
			<td>分子量 (g/mol)</td>
			<td>用量 (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x 切片预溶液</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蔗糖</td>
			<td>252</td>
			<td>342.3</td>
			<td>21.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖 * H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>198.17</td>
			<td>0.49</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：1倍高蔗糖切片溶液（250 mL）（渗透压介于320–325 mOsm之间）。
<img alt="组织切片工作流程；包括工具、切片机设置、脑切片方向示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：制备水平海马脑切片的详细信息。（A）用于啮齿类动物脑组织解剖与切片所需工具的照片：（a）长约±2 cm、宽约±0.5 cm的滤纸条（例如，413号滤纸）；（b）刀片；（c）强力胶；（d）移液器吸头；（e）样品托盘（随振动切片机配备）；（f）35 mm培养皿；（g）细毛刷；（h）刮勺；（i）弯头镊子；（j）解剖剪刀；（k）粗剪刀（刀刃长度大于10 cm）；（l）开口较宽的塑料巴斯德移液管（直径介于0.6至0.8 cm之间）；（m）恢复室（自制，使用250 mL烧杯、塑料环、尼龙网及一段10 mL血清移液管制成）；（n）盛有冰块的90 mm培养皿，以及（o）置于冷却培养皿上方的滤纸片。（B）振动切片机照片，标注包括：（a）装有冰的切片室固定架；（b）切片室；（c）碳合气管路；（d）切片用剃刀刀片。（C）示意图，展示为制备水平切片而对一侧半球背侧进行切割时的取向（见步骤3.9）。（D）脑组织在振动切片机样品托盘上的等轴测位向示意图。（E）示意图，展示两个脑半球在样品托盘上放置位置的俯视图。（F）示意图，显示水平脑切片中海马的定位。图中标注了齿状回（DG）及海马区Cornu Ammonis（CA）—下托（SB）区域。（G）恢复室照片，其中含有经碳合气饱和人工脑脊液（ACSF）孵育的10片新制备的水平脑切片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑片电生理实验装置及电极；fEPSP与纤维簇电位结果对比图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：海马脑片的电生理记录。（A）在直立显微镜下使用的记录室图像，包含灌流和吸引装置。实验开始前，将脑片置于记录室中，并用回形针片段固定。（B）在直立显微镜下（10倍物镜）拍摄的海马脑片明场图像。图中标注了齿状回（DG）和CA3区，以及刺激电极（左下）和记录电极（右下），在fEPSP记录过程中靶向内侧穿通路径。（C）左：低质量脑片的fEPSP记录示例，显示较强的纤维簇电位但幅值较小；右：高质量脑片的fEPSP记录示例。灰色线表示基线水平，虚线表示0.5 mV的幅值截断标准。（D）高质量（黑色；n=10）和低质量脑片（灰色；n=4）的fEPSP斜率与FV幅值的关系图。数据以均值±标准误（SEM）表示。（E）不同刺激强度（µA）下高质量脑片（黑色；n = 10）和低质量脑片（灰色；n = 4）的输入-输出关系图（fEPSP斜率）。（F）同（E），但为FV幅值与刺激强度的关系图。（G）三个不同基线fEPSP记录的时间进程（fEPSP斜率以%表示，归一化至前5分钟fEPSP斜率的均值）。上图显示一个正常（黑色）和异常（红色）示例，后者因记录期间未通入碳合气（carbogen）导致基线不稳定；下图显示经处理（在基线稳定20分钟后，通过给予AMPA受体拮抗剂DNQX（10 µM）阻断AMPA受体）（蓝色）与未处理条件（黑色）下的两个稳定基线记录。（H）不同处理条件下长时程增强（LTP）记录的时间进程（如下图所示）。上图中黑色表示条件化刺激期间给予荷包牡丹碱（Bicuculline，20 µM），蓝色表示同时给予荷包牡丹碱（20 µM）和NMDA（10 µM）。上图中箭头指示高频刺激施加的时间点（4次，每次1秒，100 Hz）。下图柱状图表示上图所示实验在LTP诱导后50–60分钟内的平均fEPSP斜率（%）（每种条件取一个代表性记录）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig3v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="海马荧光成像与分析；示意图、显微图像、荧光图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：海马脑片的钙离子微荧光测定。（A 和 B）小鼠脑组织水平海马脑片的荧光图像（激发波长488 nm）（A）及其对应的热图（B）。图A中标注了齿状回（DG）、CA3区以及一个兴趣区域（ROI）的示例。（C）急性海马脑片齿状回某一ROI在给予NMDA受体拮抗剂APV（50 µM）及高细胞外钾（K+）溶液（50 mM）处理期间的钙离子反应时间进程（F488 nm）。曲线以高K+灌流期间的最大钙反应为基准进行归一化，并对光漂白效应进行了基线校正。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文旨在描述一种系统性的方案，用于获取小鼠的水平脑切片。该方法的目的是保持海马纤维通路（如穿通通路和苔藓纤维束）的完整性，以评估与齿状回相关的神经过程。

海马体是大脑中一个高度有序的结构，属于边缘系统的一部分，参与记忆的形成与巩固……

本方案有助于制备用于多种科学研究的海马水平脑切片。该技术可在单一半球切片内保持海马所有纤维通路的完整性。该切片方案特别适用于评估在齿状回发育和表现的脑病理过程中发生的神经学变化。本方案最重要的方面是找到尽可能快速操作与轻柔处理脑组织之间的平衡。配制1升人工脑脊液（ACSF）时，先在800毫升水中加入磁力搅拌子持续搅拌，然后缓慢加入所列的各种固体化学试剂，再缓慢滴加适量体积的硫酸镁和氯化钙。随后使用蒸气压渗透压计检测渗透压，确保其在305至315毫渗量（milliosmole）之间，并在室温下持续用碳氧混合气（carbogen）鼓泡，使pH值维持在7.3至7.4之间。配制250毫升高蔗糖切片溶液时，按照表格中的指示将化合物加入25毫升预切溶液中，并确保其渗透压在320至325毫渗之间。然后用碳氧混合气（carbogen）鼓泡处理高蔗糖切片溶液10至15分钟，使pH值维持在7.3至7.4之间，随后将该溶液置于–80 °C条件下保存20至30分钟，直至部分冻结。为准备解剖操作的工作环境，用通入碳氧混合气的ACSF溶液填充复苏室，并将复苏室置于32 °C水浴中。将振动切片机设置为合适的切片程序，向切片槽中加入冰块，将切片槽安装到振动切片机上，并将刀片固定在振动切片机的刀臂上。使用刮铲碾压并混合部分冻结的高蔗糖切片液，直至形成不均匀的泥状物。随后用碳氧混合气（carbogen）对该溶液进行鼓泡处理，并用该溶液浸润置于预冷的 90 毫米培养皿顶部的一片滤纸，同时将另一份溶液倒入置于冰上的 35 毫米培养皿中。为获取脑组织，使用解剖剪剪开一只2至6周龄雄性小鼠的头皮，并沿矢状缝切开颅骨。用弯头镊子去除颅骨，直至包括嗅球在内的整个脑组织暴露可见，再用刮勺小心地将完整的脑组织取出。将脑组织放入35毫米的培养皿中，并用装有高蔗糖切片液的巴斯德移液管轻轻冲洗组织，以去除任何毛发或血块。用解剖刀将清洗后的脑组织转移至浸湿的滤纸上，用刀片沿纵轴将脑组织切成两半。将两个半脑的新鲜切面朝下放置，用刀片在每个半脑的背侧顶部做平行切割，以去除脑组织各部分的背侧区域。将两个半脑的新鲜切面朝下放置，使脑组织的腹侧朝上，并在样品载片上滴一滴超级胶水。使用移液器吸头将胶水涂抹成较大面积，以容纳两块组织，然后将一条滤纸带接触其中一个半脑的腹侧。用另一条滤纸带小心地半干燥脑组织的背侧，并将该半脑背侧朝下放置于样本板上的胶水上。再使用两条额外的滤纸带，按照上述方法将第二个半脑放置到胶水上，随后将样本板放入切片室中。然后迅速但小心地用冰冻的高蔗糖切片溶液冰浆覆盖切片。为了获取脑组织切片，将振动切片机的刀片置于半球内侧前方，并升起振动切片机载物台，使刀片与现在朝上的半球腹侧处于同一高度。使用振动切片机控制装置将刀片进一步向背侧降低 600 微米，并切削组织，直至前两片切片完全与两个半球分离。获得前两片组织切片后，反转切割方向，并将刀片再下降 300 微米后继续切片。当海马结构开始可见时，使用加宽的塑料巴斯德移液管收集切片，并将其转移至水浴中的恢复室。将切片置于盛有 ACSF 的恢复室中孵育 1 小时，然后将恢复室置于室温下 30 分钟，再进行组织样本的电生理记录。此处可分别观察到来自低质量和高质量脑片的典型阴性与阳性场兴奋性突触后电位记录。阴性示例轨迹在刺激神经纤维去极化时表现出较大的纤维容积波幅，甚至高于实际的fEPSP幅度；而高质量轨迹则显示出较小的纤维容积波与fEPSP幅度之比，以及较高的fEPSP幅度。脑片的存活状态还可通过绘制场兴奋性突触后电位斜率相对于纤维容积波幅的散点图进行分析。通常使用输入/输出曲线来评估脑片质量，可通过向脑片施加逐渐增强的电流刺激并记录相应的fEPSP反应获得该曲线。由于保存较差的脑组织传导性能次优，低质量脑片表现出降低的输入/输出曲线。 viable脑片具有稳定的突触传递基线，而基线不稳定的脑片则不能用于后续的条件化实验，以研究脑环路的突触可塑性。场兴奋性突触后电位（fEPSP）基线记录也可用于监测药物对突触传递本身的效应。此外，脑切片可与钙离子指示剂联合使用，以获取荧光成像记录，并在不同切片条件或处理下研究钙离子内流情况。确保在动物处死后不超过1.5分钟内完成脑组织分离，以保证脑组织在缺乏冷却和供氧条件下的暴露时间极短。海马脑片具有多种不同的应用，从分子生物学技术到电生理学均有涉及。该操作步骤有助于深入研究海马的解剖结构及神经生理过程。

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鼠脑水平海马片

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海马体小鼠脑片的改良制备与保存方法以实现长期增强作用的非常稳定且可重复的记录

本视频文章介绍了利用啮齿类动物急性海马脑片研究CA1锥体神经元中长期可塑性及其相关联的突触标记、捕获和交叉标记等过程的实验方法。...

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我们介绍一种制备小鼠背侧-中间海马区急性脑片的方案。我们将这种横向切片制备方法与冠状切片在记录质量以及所记录神经元形态特征的保存方面进行比较。...

成年小鼠背侧海马急性脑片制备用于全细胞记录及齿状回神经元重建

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小鼠脑水平海马切片

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