Name: 从植物提取物和分数中识别新型抗菌和抗生物膜分子的系统方法，以防止牙科蛀牙 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学习从植物提取物中筛选抗菌和抗生物膜分子的系统方法，用于预防龋齿。该方法利用水醇提取和超声辅助技术分离活性化合物，并通过Streptococcus mutans微生物实验验证其抑制生物膜形成的效果。

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我们感谢圣保罗州立大学（UNESP）化学研究所的天然产物生物测定、生物合成与生态生理学研究中心（NuBBE）（位于巴西圣保罗州阿拉拉夸拉市）提供实验室用于植物材料的制备。同时感谢圣保罗州立大学（UNESP）阿拉拉夸拉分校牙科材料与修复学系应用微生物学实验室的支持。本研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）的研究资助（项目编号：FAPESP #2013/07600–3，授予 AJC）以及奖学金和管理经费（FAPESP #2017/07408–6 和 FAPESP #2019/23175-7，授予 SMR；#2011/21440–3 和 #2012/21921–4，授予 PCPB）。国家科学技术发展委员会（CNPq）与 FAPESP 联合提供的支持也对此研究有所帮助（INCT CNPq #465637/2014–0 和 FAPESP #2014/50926–0，授予 AJC）。

未声明任何利益冲突。

使用天然粗提物进行研究的主要挑战包括其成分复杂以及传统生物活性导向分离研究的不足。尽管该过程较为缓慢，但其行之有效，并已在天然产物研究领域取得诸多重要发现。因此，需要采用基于合理化和优先级排序的研究策略。在此基础上，利用现代化学剖析技术对粗提物（CE）进行分析，并在分离前开展去重复化（dereplication）研究，对于表征所研究材料具有重要意义，尤其有助于避免对已知且已有生物学活性报道的化合物进行重复分离2,15。此外，获取多维数据对于后续开展多元变量数据分析至关重要，可借此识别出可能对所观察到的生物活性负责的潜在候选成分。由此，研究人员可集中精力对这些潜在候选成分进行大规模分离。
本文介绍了一种基于生物活性导向的植物提取物及组分中活性化合物的系统性鉴定方法（体外）。该方案提供了一种多靶点筛选与分析方法，可同时对多种活性成分进行筛选和分析。本方法所采用的生物测定具有样品用量少、通量高、速度快、成本低、易于重复且试剂消耗量少等优点，相较于传统方法（例如，先分离目标...

社会中最早使用的医学模型基于天然产物（NPs）。自那时起，人类一直在自然界中寻找可转化为药物的新化学物质1。这一探索推动了民族植物学筛选技术与方法的持续改进1,2,3。天然产物提供了结构多样化的丰富物质来源，具有广泛的生物活性，可用于开发替代疗法或辅助治疗。然而，植物固有的复杂基质使得活性化合物的分离与鉴定成为一项具有挑战性且耗时的工作4。
基于纳米颗粒（NPs）的药物或制剂可用于预防和/或治疗多种口腔疾病，包括龋齿4。龋齿是全球最常见的慢性疾病之一，其成因是高糖饮食与牙齿表面形成的微生物生物膜（牙菌斑）相互作用，导致微生物代谢产生的有机酸引发牙体脱矿；若不及时治疗，最终可导致牙齿脱落5,6。尽管其他微生物也可能参与其中7，但Streptococcus mutans（变形链球菌）是一种关键的致龋细菌，因其具有产酸性、耐酸性以及能够构建胞外基质的特性。该菌编码多种胞外酶（如葡萄糖基转移酶或Gtfs），可利用蔗糖作为底物8，合成富含胞外多糖的胞外基质，而该基质是其毒力的重要决定因素9。此外，真菌Candida albicans（白色念珠菌）也可促进该胞外基质的生成7。尽管氟化物以多种形式应用仍是预防龋齿的基础手段10，但仍需开发新的辅助策略以增强其效果。此外，目前可用的抗牙菌斑方法主要依赖广谱杀菌剂（如氯己定）11。作为替代方案，纳米颗粒（NPs）在控制生物膜和预防龋齿方面具有潜在治疗价值12,13。
从植物中进一步发现新的生物活性化合物包括若干必要步骤或方法：（i）采用可靠且可重复的采样方案，需考虑到植物常表现出种内变异；（ii）制备全面的粗提物及其相应的小规模分级组分；（iii）通过获取多维数据（例如气相色谱-质谱联用技术GC-MS、液相色谱-二极管阵列检测器-质谱联用技术LC-DAD-MS或核磁共振NMR）对化学谱图进行表征和/或去重复化分析；（iv）采用可行且高通量的模型评估生物活性；（v）基于多变量数据分析或其他统计工具筛选潜在的新活性化合物候选分子；（vi）对目标化合物或有前景的候选物进行分离与纯化；以及（vii）利用分离得到的化合物验证其相应的生物学活性2,14。
去重复化（dereplication）是指在粗提物中快速鉴定已知化合物，并区分出尚未被研究的新化合物的过程。此外，该过程可避免对已知具有生物活性的化合物进行重复分离，尤其有助于识别“频繁出现的活性化合物”（frequent hitters）。该方法已应用于多种非靶向研究流程中，从主要化合物的鉴定、加速基于活性的分级分离，到提取物集合的化学成分分析。它还可与代谢组学研究完全整合，用于粗提物的非靶向化学成分分析或代谢物的靶向鉴定。所有这些最终都有助于在分离纯化前对提取物进行优先级排序1,15,16,17。
因此，在本论文中，我们描述了一种系统性方法，用于从植物提取物和组分中鉴定具有抗菌和抗生物膜活性的分子。该方法包括四个多学科步骤：（1）植物材料的采集；（2）粗提物（CE）和组分（CEF）的制备，并进行化学成分分析；（3）生物活性检测；以及（4）生物学与化学数据分析（图1）。本文展示了我们所建立的实验方案，用于分析Casearia sylvestris提取物和组分对Streptococcus mutans和Candida albicans13的抗菌与抗生物膜活性，以及植物化学特征分析和数据处理的相关操作流程。为简化说明，本文重点以细菌为例，演示天然化合物筛选的方法。
<img alt="植物提取物分析：UHPLC-DAD-HRMS 分析、生物活性检测及数据分析步骤示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：从植物提取物及组分中系统性鉴定活性分子的流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>96孔微孔板&amp;nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>平底</td><td></td></tr><tr><td>活性炭</td><td>LABSYNTH</td><td>纯化和/或分级步骤</td><td></td></tr><tr><td>分析研磨仪</td><td>Ika LabortechniK</td><td>型号 A11 Basic</td><td></td></tr><tr><td>血琼脂平板</td><td>Laborclin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18色谱柱</td><td>Phenomenex Kinetex</td><td>150 &amp;times; 2.1 mm，2.6 &amp;micro;m，100&amp;Acirc;</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>溶剂溶液</td><td></td></tr><tr><td>ELISA酶标仪</td><td>Biochrom Ez</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>J. T. Baker</td><td>用于提取和分级步骤，以及流动相组成</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>溶剂溶液</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>J. T. Baker</td><td>分级步骤</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 软件</td><td>La Jolla</td><td>GraphPad Prism7</td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>J. T. Baker</td><td>分级步骤</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>J. T. Baker</td><td>用于提取步骤</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机（冻干机）</td><td>Savant</td><td>Modulyo</td><td></td></tr><tr><td>尼龙 Millipore 滤膜</td><td>LAC</td><td>0.22 &amp;micro;m × 13 mm</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Quimis</td><td>型号 G816&amp;thinsp;M20</td><td></td></tr><tr><td>聚酰胺固相萃取小柱</td><td>Macherey-Nagel</td><td>纯化和/或分级步骤</td><td></td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Merck</td><td>40&amp;ndash;63&amp;thinsp;&amp;mu;m，60&amp;thinsp;&amp;Acirc;</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Synth</td><td>水中 0.89%</td><td></td></tr><tr><td>固相萃取小柱 (SPE)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>纯化和/或分级步骤</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超高效液相色谱-二极管阵列检测器 (UHPLC-DAD)</td><td>Dionex</td><td>Ultimate 3000 RS</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>UNIQUE</td><td>型号 USC 2800</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从植物提取物和组分中系统筛选新型抗菌及抗生物膜分子以预防龋齿

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

天然产物提供了结构多样的化合物，具有多种生物学活性。然而，由于植物基质复杂，且分离与鉴定过程耗时，从植物中鉴定和分离活性化合物具有较大挑战性。因此，本文提出了一种逐步筛选植物中天然化合物的方法，包括潜在活性分子的分离与鉴定。该方法涵盖植物材料的采集；粗提物的制备与分级分离；采用色谱与波谱技术（超高效液相色谱-二极管阵列检测-高分辨质谱联用和核磁共振谱）进行分析及化合物鉴定；生物活性检测（抗菌与抗生物膜活性；细菌对唾液薄膜及经特定处理的初始葡聚糖基质的&#34;黏附强度&#34;）；以及数据分析。该模型简便、可重复，支持对多种化合物、浓度和处理步骤进行高通量筛选，并能实现一致的控制。所得数据为后续研究奠定了基础，包括采用最具活性的提取物和/或组分进行制剂开发、分子分离、以及针对微生物细胞和生物膜中的特定靶点进行分子结构模拟。例如，控制致龋生物膜的一个靶点是抑制变异链球菌（Streptococcus mutans）葡糖基转移酶的活性，该酶负责合成胞外基质中的葡聚糖。抑制这些酶的活性可阻止生物膜的形成，从而降低其毒力。

我们提供了一个采用系统性方法筛选植物提取物及组分生物活性的示例，旨在发现可能具有抗龋齿潜力的活性分子：Casearia sylvestris 来自巴西不同生态区的提取物对Streptococcus mutans和Candida albicans的抗菌及抗生物膜活性13。
背景 
特定口腔微生物、宿主因素与富含蔗糖和淀粉的饮食之间复杂的相互作用可调节致病性生物膜的形成，并启动致龋过程30,31. S. mutans 通过产生负责胞外多糖合成的葡糖基转移酶（Gtfs），并凭借其产酸性和耐酸性，调控与龋齿发生相关的生物膜的致病性31此外，Gtfs 能够促进黏附作用 白色念珠菌 （及其他微生物），增强生物膜的毒力32...

天然产物是开发新药和治疗剂的有前景的起点。然而，由于化学多样性高，从植物中发现新的治疗化合物是一项具有挑战性且耗时的任务。我们描述了一种简化的方法，用于从植物提取物和组分中鉴定抗菌和抗生物膜分子。

天然产物提供结构多样的化合物，具有多种生物学活性。然而，活性成分的鉴定与分离……

本方案用于正确筛选和分析天然产物中控制口腔生物膜的生物活性候选成分。该方法也可适用于其他生物膜研究领域的应用。这种最适淀粉筛选与分析方法能够同时去除生物活性成分。龋齿是一种由生物膜饮食引起的高发性慢性疾病。本方案有助于筛选天然产物以控制生物膜，从而防治龋齿。首先使用水醇混合物配制提取溶剂。取样浓度为每毫升提取溶剂50至100毫克，在微量离心管中进行15分钟的超声辅助提取。重复提取三次。每次提取后，离心样品以沉淀固体残渣，并移除上清液。合并各提取步骤的上清液并进行过滤。保留等分试样用于化学分析和生物测定。进行分级分离时，用初始提取溶剂将粗提物样品稀释，配制成100毫克/毫升的溶液。然后，取一毫升该样品转移至一个预处理过的固相萃取柱中，该萃取柱含有1克吸附剂，柱容量为6毫升。使用每种洗脱溶剂（LUN）约三个死体积进行分步洗脱，并按LUN组成分别收集各组分。保留等分试样用于化学分析和生物测定。在真空、氮气流或冷冻干燥条件下除去溶剂，并记录重量和产率。用最合适的溶剂重新溶解干燥物。根据文稿中的公式计算储备溶液的溶剂浓度。在血琼脂平板上复苏变形链球菌 UA 159 菌株，并将其接种于液体培养基中进行培养。用相同的培养基对初始培养物进行1:20稀释，培养至对数生长期中期。使用TYEG培养基制备含有特定菌量的接种液，用于抗菌试验；使用含1%蔗糖的TYE培养基制备接种液，用于生物膜试验。为检测抗菌活性，需确定待分析样品的浓度，并将其加入96孔板中。每个板上均需设置对照组，具体设置方法见正文手稿。使用TYEG培养基将体积调至100微升，接种100微升微生物培养物，于含5%二氧化碳的37摄氏度条件下孵育24小时。通过目测孔板浊度分析细菌生长情况。取所需稀释度的等分试样接种于特定的琼脂平板上，每个样本设两个重复，然后孵育平板。孵育结束后，进行菌落计数。将羟基磷灰石珠放入微量离心管中称重并进行灭菌处理。随后使用吸附缓冲液 Ab 洗涤珠子。向微量离心管中加入 500 微升唾液，形成唾液膜，并在 37 摄氏度、每分钟 24 转的条件下孵育 40 分钟。去除唾液上清液后，用 Ab 缓冲液洗涤珠子三次，以备后续实验使用。向每个含有唾液软垢包被微珠的微量离心管中加入 500 µL 样品或对照，于 37 °C、24 转/分钟条件下孵育 30 分钟。用 Ab 缓冲液洗涤微珠 3 次。向每管中加入 500 µL 微生物培养物，在相同条件下孵育 1 小时。随后用 Ab 缓冲液洗涤未结合的细胞 3 次。用一毫升抗体缓冲液重悬每个样品，并以7瓦功率超声处理30秒。将各悬浮液等分试样进行连续十倍梯度稀释，然后接种于特定的琼脂平板上。将平板置于5%二氧化碳环境中，37摄氏度孵育48小时，随后计数菌落。进行数据分析时，将生物测定的原始数据输入电子表格，计算每种处理对微生物生长抑制的对数值，以及与对照组相比的微生物生长抑制率的对数值。校正读数的光密度值，并计算生物量抑制的百分比。此处展示了三种 C. sylvestris 提取物（即 sylvestris、intermediate 和 lingua 品种）在生物筛选中的化学特征，包括克罗烷型二萜类化合物和糖基化黄酮类化合物的含量。原始数据分析后，有四种提取物表现出良好的反应。这四种提取物的色谱数据表明，同时存在克勒罗烷型二萜类化合物和糖基化黄酮类化合物。此外，它们来源于相同的生物群系和品种。此处显示了经处理的浮游细胞的CFU百分比、经处理的生物膜的生物量百分比以及经处理的生物膜中CFU的百分比。没有一种粗提物显著影响黏附于唾液薄膜上的变异链球菌（S.mutans）细胞的去除。三种粗提物削弱了变异链球菌（S.mutans）细胞对葡聚糖基质的黏附。由于每种植物物种都需要经过优化和特定的化学分析方法，因此必须从以往的文献报道中选择最佳的溶剂萃取组分和分析方法，或通过实验设计加以确定。制备具有最强生物活性的粗提物及组分配方，并在复杂模型上进行测试，对于预防生物膜和龋洞的形成至关重要。

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从植物提取物和分数中识别新型抗菌和抗生物膜分子的系统方法，以防止牙科蛀牙

在牙面形成的生物膜具有高度复杂性，并持续暴露于各种内在和外源性的环境挑战中，这些挑战会调控其结构、生理状态及转录组。我们开发了一套工具箱，用于研究口腔生物膜的组成、结构组织及基因表达，该工具箱亦可适用于其他生物膜研究领域。...

用于全面分析由变异链球菌介导的口腔生物膜的生化、结构及转录组学评估工具箱

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本文描述了一种基于96孔微孔板的实验方案，利用2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-羧基苯胺-2H-四唑（XTT）还原法检测抗体对C.

一种基于可溶性四氮唑还原反应的检测方法，用于评估抗体的作用效果 Candida tropicalis 生物膜

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体外评估植物源性分子对传统生物杀灭剂的增效作用

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