Name: 从多能干细胞生成人类神经元和少突胶质细胞，用于模拟神经元-少突胶质细胞相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 了解从人多能干细胞诱导生成神经元和少突胶质细胞前体细胞的方法，用于建立共培养体系研究神经退行性疾病中神经元与少突胶质细胞的相互作用机制。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（R00 AG054616 资助 Y.A.H.，T32 GM136566 资助 K.C.）、斯坦福大学医学院以及Siebel奖学金（授予 S.C.）的资助。Y.A.H. 是布朗转化科学研究所转化神经科学中心的GFL转化教授。

1. 由人多能干细胞诱导人神经元
<ol>
	<li>慢病毒制备（约5天，详细方案如先前所述16）
	<ol>
		<li>将约100万个HEK293T细胞接种至每个T75培养瓶中，使转染时细胞融合度约为40%。使用表达四环素诱导型Ngn2和嘌呤霉素抗性基因（PuroR；在同一TetO启动子控制下）、rtTA以及三种辅助质粒pRSV-REV、pMDLg/pRRE和VSV-G的质粒进行转染（每瓶加入12 µg慢病毒载体DNA和每种辅助质粒DNA各6 µg）。每次慢病毒制备至少准备三个培养瓶。使用PEI进行转染，操作遵循制造商说明书。转染16小时后更换培养基并弃去旧培养基。</li>
		<li>连续3天每天收集含病毒颗粒的培养上清，并更换新鲜培养基。将收集的上清液合并用于病毒纯化。通过0.22 µm滤膜过滤病毒液，然后在49,000 × g条件下离心90分钟。将沉淀重悬于适当体积的PBS-葡萄糖溶液中（约150 µL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经元诱导（约5天） 
	注意：该诱导方案（图1A；流程图）对经验证具有多能性的iPS细胞和ES细胞均非常有效（可通过免疫组织化学染色检测明确的多能性标志物进行验证；图1B）。
	<ol>
		<li>使用商业化H1人源ES细胞（传代52代，见材料表）。将细胞培养于包被了细胞外基质溶液的6孔板中（每块6孔板使用约0.5 mg基质溶液；见材料表），使用ES细胞维持培养基（见材料表），在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
		<li>第-2天，用1 mL细胞解离溶液（见材料表）解离ES细胞（融合度约80%），室温孵育10分钟。将细胞转移至离心管中，用2 mL培养基冲洗孔板并将冲洗液合并至同一离心管中。在300 × g条件下离心5分钟，弃上清后将沉淀重悬于培养基中，并以每孔1 × 105个细胞的接种密度接种至包被基质的6孔板中。</li>
		<li>第-1天，在新鲜ES细胞维持培养基中加入表达Ngn2与PuroR的慢病毒以及rtTA慢病毒，同时加入polybrene（8 µg/mL）（见材料表）。病毒具体用量应根据实际滴度或滴定结果确定。通常每孔6孔板加入每种病毒各5 µL。</li>
		<li>第0天，在不含形态发生素的DMEM-F12培养基中添加N2补充剂和多西环素（2 µg/mL），以激活Ngn2表达。</li>
		<li>第1天，在含多西环素的DMEM-F12加N2新鲜培养基中加入嘌呤霉素，终浓度为1 µg/mL。用嘌呤霉素筛选转导细胞至少24小时。若病毒滴度较低，可能需要更高浓度的嘌呤霉素（最高达5 µg/mL）和更长的筛选时间（最长48小时），以充分清除未充分转导的细胞。</li>
		<li>第2天，使用细胞解离溶液（见材料表）解离正在分化的神经元，将其重新接种至包被基质溶液的24孔板中（每孔80,000–200,000个细胞；见材料表），并在不含多西环素的NBA/B27培养基中继续培养。接种密度至关重要。</li>
		<li>在此阶段，解离的神经元可使用专用的商业冻存液（见材料表）冻存，并在液氮中保存长达3个月。复苏后接种时需考虑典型的约15%–20%细胞死亡率。纯化的神经元可单独培养，也可与其他脑细胞类型共培养（共培养操作参见步骤3.2.3.中与OPCs的共培养方法）。</li>
		<li>将纯化的iNs培养于根据制造商说明包被了基于细胞外基质溶液的培养板上（见材料表）。典型的锥体样形态在第4天（及第6天；图1C）应已明显可见。通过标准的突触前和突触后标志物免疫组织化学染色，最早可在第14至16天检测到突触形成，第24天时突触形成显著增强（图1D；使用突触前标志物Synapsin 1和树突标志物Map2标记）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 多能干细胞诱导人少突胶质前体细胞（OPCs）及少突胶质细胞成熟
<ol>
	<li>神经前体细胞（NPC）的生成：单层培养法（约7天）。流程图见图2A。
	<ol>
		<li>按照前述方法培养H1人胚胎干细胞（见步骤1.2.1），并通过一种称为双抑制SMAD（dual SMADi）的成熟方法将其转分化为神经前体细胞（NPCs），该方法使用针对多个信号通路的小分子抑制剂。本文采用一种广泛认可的商用试剂盒，并遵循制造商提供的单层培养方案（见材料表）。</li>
		<li>第-1天，在经生长因子减少型基质溶液包被的6孔板中接种0.5–1 × 106个细胞/孔（见材料表；每6孔板约使用0.5 mg基质溶液），使用胚胎干细胞维持培养基（见材料表）。该生长因子减少型基质溶液用于包被后续所有步骤中将使用的培养板。</li>
		<li>第0天，使用添加2% DMSO的胚胎干细胞维持培养基处理细胞24小时（见材料表）。</li>
		<li>第1–6天，更换为预热至37 °C的神经诱导培养基（含试剂盒提供的SMAD抑制剂，见材料表）。若细胞在第7天前分裂并达到汇合状态，按前述步骤2.1.2所述方法传代，接种密度为0.5–1 × 106个细胞/孔。</li>
		<li>第7天，使用细胞解离溶液（见材料表）对NPCs进行传代，并以1–2 × 105个细胞/孔的密度接种至24孔板中。</li>
		<li>通过免疫组织化学（IHC）染色检测分化效率，确认多能性标志物（如OCT4）缺失，同时检测NPC标志物（如PAX6、Nestin和Sox1）的表达。</li>
		<li>在此阶段，解离后的NPCs可使用专用的商用NPC冻存培养基（见材料表）冷冻，并在液氮中保存长达3个月。经历一次冻融后，NPCs仍能保持多向分化潜能，可通过可靠方案分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPCs）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>少突胶质前体细胞（OPC）的生成（约7天）。流程图见图2A。
	<ol>
		<li>第7天，使用细胞解离溶液（见材料表）对NPCs进行传代，并以1–2 × 105个细胞/孔的密度接种至24孔板中，培养基为含试剂盒SMAD抑制剂的预热（37 °C）神经诱导培养基（见材料表）。</li>
		<li>第8天，配制含1% DMSO的OPC分化培养基溶液，处理已接种的NPCs 24小时。OPC分化培养基组成为：DMEM/F12培养基、1% N2添加剂、1% B27添加剂、20 ng/mL bFGF、1 µM SAG、10 ng/mL PDGF-AA（见材料表）。</li>
		<li>第9天，更换为不含DMSO的新鲜OPC分化培养基。每隔一天换液一次，直至第15天。若细胞在第15天前达到汇合状态，按步骤2.2.1所述方法传代，接种密度为1–2 × 105个细胞/孔。</li>
		<li>第14天，将OPCs以1–2 × 105个细胞/孔的密度接种至24孔板中，使用OPC分化培养基。</li>
		<li>在此阶段（第15天），通过IHC染色或qPCR检测细胞中OPC特异性标志物的表达（如O4、Olig1/2、CSPG4/Ng2、NKX2.2、PDGFRa；图2B），并确认NPC标志物（Pax6或Nestin；图2D）缺失。通常在第15天时，超过95%的细胞可检测到O4免疫反应性。与阿尔茨海默病特别相关的是，OPCs中APP（淀粉样前体蛋白）、BACE1（β-分泌酶1）以及淀粉样β肽（Aβ）的表达水平较高（图2F）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>少突胶质细胞（OL）成熟（约7–20天）
	<ol>
		<li>第15天，更换为OL成熟培养基：Neurobasal-A培养基、2% B27添加剂、1 µM cAMP、200 ng/mL T3三碘甲腺原氨酸、1 µM Clemastine（见材料表）。每隔一天或根据需要每天更换培养基。</li>
		<li>当细胞达到90%汇合度时，以1:3比例传代，最多传代2次，或直至细胞增殖显著减缓。若OPCs增殖过快，在3天内即达到汇合状态，可加入Ara-C（见材料表），浓度为2–5 µM，处理1–3天。活跃的增殖表明成熟效率降低。</li>
		<li>通过检测OL标志物（如CLDN11、PLP1、MBP）的表达（采用qPCR、IHC染色或免疫印迹法）评估少突胶质细胞成熟效率。到第28天时，应能明显观察到高度复杂的细胞形态特征（图2C）以及OL标志物的表达（图2E）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人诱导神经元（iNs）与少突胶质前体细胞（iOPCs）的共培养
<ol>
	<li>iOPC 铺板（约 3 天）
	<ol>
		<li>在第 14 天，以每孔 1 × 105 个细胞的密度将 iOPC 接种至 24 孔板中（如上文步骤 2.2.4 所述），使用 OPC 分化培养基（如步骤 2.2.2 所述）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iN-iOPC 共培养体系建立
	<ol>
		<li>在第 15 天，使用细胞解离液（见材料表）将经过嘌呤霉素筛选后第 2 天的诱导人神经元（如步骤 1.2.6 所述）从培养皿中解离下来。</li>
		<li>将神经元接种到已培养的 OPC 上，以每孔 2 × 105 个细胞的接种密度加入含有生长中 OPC 的 24 孔板（来自步骤 3.1.1）。使用含有 Neurobasal-A 培养基、2% B27 添加物和 100 ng/mL T3 三碘甲腺原氨酸的共培养培养基。次日更换培养基，之后每隔一天更换一次。如果 OPC 增殖过快，在不到 3 天内达到汇合状态，可加入浓度为 2–5 µM 的 Ara-C。共培养 7 天后 iN 和 iOPC 的代表性图像见图 3A。</li>
		<li>使用如上文步骤 1.2.7 所述制备的冻存神经元与 OPC 进行共培养。冻融神经元的接种密度应更高，为每孔 3 × 105 个细胞。</li>
		<li>共培养第 14–16 天后，可通过突触前和突触后标志物的免疫组化染色观察 iN 中的突触形成情况；到第 21 天时，突触斑点应已大量出现（图 3C），并可稳定记录神经元活动。</li>
		<li>从第 21 天开始，检测细胞中少突胶质细胞特异性标志物（例如 MBP 和 PLP1）。通常在第 28 天可观察到 iOPC 突起包绕 iN 轴突的现象，通过特异性标志物免疫组化染色可显示该结构（图 3B；iN 轴突用神经丝蛋白 NF 标记，iOPC 突起用 MBP 标记）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+treatment+of+human+pluripotent+stem+cells+with+DMSO+to+promote+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).</li>
<li>Douvaras, P., Fossati, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+isolation+of+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).</li>
<li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).</li>
<li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelinating+oligodendrocytes+in+human+cortical+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids.</a> Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li>
<li>Grubman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+entorhinal+cortex+from+individuals+with+Alzheimer%27s+disease+reveals+cell-type-specific+gene+expression+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer's disease reveals cell-type-specific gene expression regulation.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).</li>
<li>Goldman, S. A., Kuypers, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+an+oligodendrocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make an oligodendrocyte.</a> Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).</li>
<li>Behrendt, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+myelin+aberrations+and+oligodendrocyte+generation+in+chronic+amyloidosis+in+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men.</a> Glia. 61 (2), 273-286 (2013).</li>
<li>Patzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulator+signaling+bidirectionally+controls+vesicle+numbers+in+human+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses.</a> Cell. 179 (2), 498-513 (2019).</li>
<li>Piao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitors+remyelinate+the+brain+and+rescue+behavioral+deficits+following+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).</li>
<li>Keirstead, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+OPC-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+for+treating+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury.</a> Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361(2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

除了通过髓鞘化为突触结构提供物理和代谢支持并促进跳跃式信号传导外，少突胶质细胞系细胞还能通过与神经元之间快速而动态的相互作用，调控神经元活动模式5,6,7。在阿尔茨海默病（AD）病理过程中，少突胶质细胞的反应最初被认为仅仅是继发于炎症和氧化应激；但现在已有令人信服的证据表明，髓鞘完整性受损是在Aβ聚集和tau蛋白过度磷酸化出现之前发生的早期致病事件9。此外，在AD中，通过少突胶质前体细胞（OPC）自我更新实现的髓鞘修复过程尤为脆弱38，而这一过程高度依赖于神经元活动。因此，阐明支持健康神经元-少突胶质细胞信号传导的机制，为发现新的治疗靶点提供了重要机遇。
单转录因子 Ngn2 方案是目前最常用的干细胞来源人神经元的生成技术之一，本文所述步骤进一步优化了该方法，以获得高纯度的神经元培养物。我们的 iOPC...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61778/generation-human-neurons-oligodendrocytes-from-pluripotent-stem-cells">Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions</a>. The Representative Results section has been updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="IN-OPC co-culture results; neurofilament staining, synaptic density diagram, marker expression graph." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61778/61778fig03.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61778/61778fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Microscopy analysis, astrocyte markers, iOPC-neuron interaction, fluorescence labeling." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61778/61778fig3v2.png" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61778/61778fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The fourth paragraph was updated from:
Co-culturing of iNs and iOPCs 
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).
to:
Co-culturing of iNs and iOPCs 
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61778/generation-human-neurons-oligodendrocytes-from-pluripotent-stem-cells">Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions</a>.&#160;The Representative Results section has been updated.

Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

少突胶质细胞谱系细胞——包括少突胶质前体细胞（OPCs）、形成髓鞘的少突胶质细胞以及介于两者之间的过渡类型——是人类脑细胞中的一个重要类别1，在神经发育和衰老过程中积极参与中枢神经系统的正常运作与维持的多种关键功能2,3,4。尽管少突胶质细胞因生成髓鞘以促进神经元活动传导并支持白质中轴突健康而广为人知，但OPCs在髓鞘化稀少的灰质中却十分丰富（约占5%），并执行依赖神经活动的信号传导功能，调控学习行为与记忆形成5,6,7,8。然而，少突胶质细胞在阿尔茨海默病（AD）及其他与年龄相关的神经退行性疾病发病机制中如何发挥功能及其功能障碍，目前研究仍不充分9。造成这一研究空白的主要原因在于缺乏合适的模型系统，以及缺乏指导实验路径的普遍性知识。
鉴于近年来在从多能干细胞（包括胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS））中获取人类脑细胞方面的最新突破，这类细胞模型结合现代基因编辑工具已成为研究大脑中复杂细胞相互作用的有力手段，并能够展示人类特有的疾病表型10,11。考虑到在相同的阿尔茨海默病（AD）促进条件下，不同类型的脑细胞可能表现出独特甚至相互矛盾的作用12,13，该干细胞技术可提供特定细胞类型的信息，而以往的体内或体外模型仅能从多种脑细胞混合群体中获得整体性读数，无法实现此类特异性分析。在过去十年中，已开发出大量可靠的方案，用于通过ES/iPS细胞的转分化或其他终末分化细胞类型（如成纤维细胞）的直接转化来生成人类神经元14,15。特别是，将关键的神经源性转录因子（如神经源素2，Ngn2）16应用于人类多能干细胞，可生成高度均一且特征明确的神经元细胞群体，实现无需与胶质细胞共培养的纯培养体系12,17,18。对于诱导生成的人类少突胶质细胞，已有若干已发表的方案可生成在功能上高度类似于原代细胞的成熟细胞，但其效率以及在时间和资源需求方面存在较大差异19,20,21,22,23,24,25,26,27,28。迄今为止，尚无任何一种方案被用于研究少突胶质细胞如何响应并影响阿尔茨海默病的发病过程。
本文中，我们描述了人源诱导神经元（iNs）与少突胶质前体细胞/少突胶质细胞（iOPCs/iOLs）的单培养及共培养的优化方案。此处所述的iN诱导方案基于广泛使用的Ngn2方法16，并额外具备无胶质细胞污染的特点。所获得的iNs具有高度均一性，且在形态学、基因表达谱及电生理特性方面均高度类似于大脑皮层第2/3层的兴奋性神经元，呈现典型的锥体形结构17,18（图1）。为克服多能干细胞定向分化中的一些根本性障碍，我们开发了一种简单而有效的低剂量二甲基亚砜（DMSO）预处理方法29,30，并基于Douvaras与Fossati广泛采用的方案32，报道了人胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）向iOPCs和iOLs转分化能力的显著提升31。我们进一步简化了该流程，并引入了一种可有效促进分化的化合物——氯马斯汀（clemastine）7,33,34，以加速少突胶质细胞的成熟过程。结果表明（图2），iOPCs可在2周内生成（约95%表达标志物O4），而iOLs则在4周内成熟（表达成熟标志物MBP和PLP1）。有趣的是，我们发现单独培养的iOPCs即可分泌大量淀粉样β蛋白（Aβ），这与独立的转录组数据一致，后者显示少突胶质细胞谱系细胞中淀粉样前体蛋白（APP）及其加工蛋白酶β-分泌酶（BACE1）均呈高表达35,36。此外，我们的iN-iOPC共培养体系能够促进MBP阳性iOL突起对轴突的包绕，并显著支持突触的形成（图3）。因此，下文详述的这些实验方案在技术与生物学层面均优于以往记录的神经元-少突胶质细胞共培养方法，在更真实地模拟阿尔茨海默病（AD）中的神经退行性变方面具有重要潜力。

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>ThermoFisher</td><td>PHG 0266</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>MilliporeSigma</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>氯马斯汀</td><td>MilliporeSigma</td><td>SML0445</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>强力霉素</td><td>MilliporeSigma</td><td>D3072</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ScienCell</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>H1人胚胎干细胞</td><td>WiCell</td><td>WA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>ThermoFisher</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>R&amp;D Systems</td><td>221-AA-010</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>VWR</td><td>71002-812</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-REV</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Tocris</td><td>4366</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff神经前体细胞冻存培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5838</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi神经诱导试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>T3三碘甲腺原氨酸</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Tempo-iOlogo：人iPSC来源的少突胶质前体细胞</td><td>Tempo BioScience</td><td>SKU102</td><td></td></tr><tr><td>TetO-Ng2-Puro</td><td>Addgene</td><td>52047</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr></tbody></table>

由多能干细胞生成人神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用

多能干细胞, 神经元, 少突胶质细胞, 细胞分化, 神经发育, 共培养, 神经退行性疾病, 人源细胞模型, 髓鞘形成, 神经胶质生物学

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

在阿尔茨海默病（AD）及其他神经退行性疾病中，少突胶质细胞功能障碍是一种常见的早期病理特征，但其如何参与疾病的发生与发展，特别是在大脑灰质中的作用，目前仍知之甚少。少突胶质细胞谱系细胞的功能障碍主要表现为髓鞘形成缺陷以及少突胶质前体细胞（OPCs）自我更新能力受损。这两种缺陷至少部分是由于随着病理过程的积累，神经元与少突胶质细胞之间的相互作用遭到破坏所致。在中枢神经系统发育过程中，OPCs可分化为具有髓鞘形成能力的少突胶质细胞。在成熟的脑皮层中，OPCs是主要的增殖性细胞（约占脑细胞总数的5%），并以神经活动依赖的方式调控新髓鞘的形成。此类神经元-少突胶质细胞间的通讯机制迄今研究仍十分不足，尤其是在AD等神经退行性疾病的背景下，主要受限于缺乏合适的工具。近年来，我们课题组及其他研究团队已在优化现有技术方面取得显著进展，能够分别从人多能干细胞高效诱导生成功能性神经元和少突胶质细胞。在本论文中，我们详细描述了经过优化的实验流程，包括建立共培养体系以模拟神经元与少突胶质细胞之间的连接。我们的示例结果提示，OPCs/少突胶质细胞可能对脑内淀粉样蛋白沉积及突触完整性具有意料之外的作用，并凸显了该方法在AD研究中的应用价值。这种还原论方法有助于从大脑固有的复杂性中解析出特定的异细胞间相互作用。本文所述的实验方案有望推动未来关于少突胶质细胞缺陷在神经退行性疾病发病机制中作用的深入研究。

直接从人多能干细胞生成人诱导神经元 
起始使用的人多能干细胞必须具有高度的多能性，这对于成功生成诱导神经元（iNs）或诱导少突胶质前体细胞/少突胶质细胞（iOPCs/iOLs）至关重要。因此，在启动本论文所述的任一诱导方案之前，应使用特定标志物（如 Oct4 和 SOX2）对细胞进行染色鉴定（图1A）。本研究采用人 H1 细胞，依据 Zhang 等人先前发表的方案并加以部分修改，获得诱导性兴奋性前脑神经元（图1C）12,16,17,18。本文介绍了一种在第2天将iNs重新接种于基质溶液（见材料表）中进行纯培养的方案，无需任何饲养层（如胶质细胞或成纤维细胞）。除此前已发表的方案外，我们还观察到，...

由于缺乏足够的工具和方法，神经退行性疾病中神经元与胶质细胞之间的相互作用尚未被充分理解。在此，我们描述了从人多能干细胞获得诱导神经元、少突胶质前体细胞以及少突胶质细胞的优化方案，并举例说明这些方法在理解阿尔茨海默病中细胞类型特异性贡献方面的应用价值。

在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）及其他神经退行性疾病中，少突胶质细胞功能障碍是一种常见的早期病理特征，但其机制尚不明确……

本文所述方案有望促进未来对少突胶质细胞缺陷在神经退行性疾病发病机制中作用的研究。这是一种改进的方法，可在仅三至四周内生成功能性人源少突胶质细胞系细胞，并建立共培养系统以模拟神经元-少突胶质细胞之间的连接。该方案不仅可用于研究阿尔茨海默病，还可用于研究任何其他与神经元-少突胶质细胞相互作用相关的疾病方面。首先，将约一百万个 HEK293T 细胞接种至每个 T75 培养瓶中，使其达到 40% 的融合度，然后使用 PEI 转染含有四环素诱导型 NGN2 和嘌呤霉素抗性四环素转录激活因子基因的质粒，同时转染三种辅助质粒。转染后 16 小时更换培养基。每天收集培养基以收获释放的病毒颗粒，并更换新鲜培养基，持续三天。合并收集的培养基用于纯化，经0.22微米滤器过滤后，在49,000 × g离心90分钟。离心后，将沉淀物重悬于适当体积的PBS葡萄糖溶液中。使用商业化获得的 H1 人胚胎干细胞进行神经元诱导。将细胞培养于包被有细胞外基质溶液的 6 孔板中，加入 ESL 维持培养基，并在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育。在诱导分化前两天，加入 1 毫升细胞解离溶液，室温孵育 10 分钟，使胚胎干细胞脱离。将细胞转移至离心管中，然后用两毫升培养基洗涤孔板，并将洗液加入同一离心管中。以300 × g离心五分钟。随后将沉淀重悬于培养基中，并将细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的接种密度接种至包被基质的6孔板中。第二天，在新鲜的胚胎干细胞维持培养基中加入表达 NGN2 和嘌呤霉素抗性（puro. R）以及四环素转录激活因子的慢病毒，并加入聚凝胺。在第 0 天，在添加 N2 但不含形态发生素的 DMEM/F-12 培养基中加入 2 微克/毫升的多西环素。第一天，在新鲜的DMEM/F-12培养基中加入嘌呤霉素、N2补充剂和多西环素，使嘌呤霉素终浓度为每毫升1微克。用嘌呤霉素筛选转导细胞至少24小时。第二天，用细胞解离液将正在分化的神经元解离，并重新接种至预先用基质溶液包被的24孔板中。在不含多西环素的MBA B27培养基中维持培养。将纯化的诱导神经元接种于包被有基于细胞外基质溶液的培养板上进行培养。为生成神经前体细胞，请按照文本手稿中的描述，培养H1人胚胎干细胞并将其转分化为神经前体细胞。在第负一天，将0.5×10⁶至1×10⁶个细胞接种于含生长因子减量基质溶液包被的6孔板中，每孔加入胚胎干细胞维持培养基。在第零天，使用添加2% DMSO的胚胎干细胞维持培养基处理细胞，持续24小时。从第一天至第六天，更换为预热的神经诱导培养基，该培养基含有商业试剂盒中的特定添加抑制剂，每次更换全部培养基。第7天，使用细胞解离溶液传代神经前体细胞（NPCs），并以每24孔板孔1×10⁵至2×10⁵个细胞的密度接种。通过免疫组织化学染色检测多能性标志物的缺失以及NPC标志物的存在，以评估分化效率。为生成少突胶质前体细胞，将NPCs接种于含有商用试剂盒中特定添加抑制剂的预热神经诱导培养基中。第8天，在少突前体细胞（OPC）分化培养基中配制含1% DMSO的溶液，对已接种的神经前体细胞（NPCs）处理24小时。第9天，更换为不含DMSO的新鲜OPC分化培养基，之后每隔一天换液一次，直至第15天。若细胞在第15天前达到汇合状态，应传代至每孔接种密度为1至2×10⁵个细胞。第14天，将少突胶质前体细胞（OPC）以每孔1×10⁵至2×10⁵个细胞的密度接种于24孔板中，使用OPC分化培养基。通过免疫组化染色或qPCR检测细胞是否表达OPC特异性标志物，并确认不表达神经前体细胞（NPC）标志物。第15天，更换为少突胶质细胞（OL）成熟培养基。每隔一天或每天更换一次培养基。当细胞融合度达到90%时，以1:3的比例传代，最多传代两次，或直至细胞分裂速度显著减慢。如果少突胶质前体细胞（OPCs）分裂过快，在不到三天内即达到融合状态，可加入浓度为2至5微摩尔的阿糖胞苷（Ara-C），持续处理1至3天。第14天，将IOPC以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于24孔板中，每孔加入少突前体细胞分化培养基。次日，使用细胞解离液将诱导的人神经元解离，并将神经元接种至培养的OPC上，接种密度为每孔2×10⁵个细胞。使用含有神经基础培养基A（neurobasal A medium）、2% B27添加剂以及100纳克/毫升T3三碘甲腺原氨酸的共培养基。次日更换培养基，之后每隔一天更换一次。若少突胶质前体细胞（OPCs）增殖过快，在不到三天内达到汇合状态，可加入2至5微摩尔的Ara-C。起始使用的人多能干细胞必须具有高度的多能性，才能成功诱导生成神经元、少突胶质前体细胞（OPCs）或少突胶质细胞。因此，在启动任一种诱导方案之前，应对细胞进行特定标志物染色检测，例如 OCT-4 和 SOX2。本研究使用人 H1 细胞获得诱导性兴奋性前脑神经元。培养的纯神经元在第14至16天开始表达突触。诱导型少突胶质前体细胞（IOPCs）在两周内生成，成熟少突胶质细胞在四周至五周内形成。DMSO处理使处于早期G1期的细胞数量增加，有利于信号整合。在ES H1细胞接种后两周即可检测到特异性少突胶质前体细胞（OPC）标志物。接种两周时的IOPC群体较为均一，超过95%的细胞O4染色呈阳性，且对其他标志物也表现出高水平的免疫反应性。在启动少突胶质细胞成熟后，从第28天开始可检测到特异性少突胶质细胞标志物。为了实现适当的分化，需要通过一系列细胞数量滴定实验来确定诱导神经元和诱导少突胶质前体细胞（IOPCs）的理想铺板密度。在共培养四周后，IOPCs 应充分分化为表达特定标志物（如 MBP）的少突胶质细胞。该共培养系统可显著增加突触数量，表明 IOPCs 通过物理接触或释放神经营养因子为神经元提供了支持作用。通过添加不同类型的脑细胞，可进一步完善所述实验流程。例如，利用干细胞衍生的人星形胶质细胞，可建立用于研究健康与疾病状态下神经元-胶质细胞相互作用的新模型。

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从多能干细胞生成人类神经元和少突胶质细胞，用于模拟神经元-少突胶质细胞相互作用

本视频展示了如何从人类胚胎干细胞生成少突胶质细胞前体细胞（OPCs），随后将OPCs成熟为少突胶质细胞。该少突胶质细胞生成过程为改善包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病的研究与治疗开辟了众多途径。...

将人类胚胎干细胞分化为少突胶质细胞

本视频展示了人源诱导神经元（iNs）与诱导少突胶质前体细胞（iOPCs）共培养体系的建立。将iNs与iOPCs混合后进行共培养，并孵育以促进iNs向神经元、iOPCs向少突胶质细胞的成熟。神经元与其他神经元及少突胶质细胞形成突触连接，而少突胶质细胞则在神经元轴突周围发育出髓鞘结构。...

一种用于模拟神经元-少突胶质细胞相互作用的共培养方法

本视频展示了将人类多能干细胞（hPSCs）转化为球形脑类器官的过程。通过使用特定的抑制剂，引导hPSCs向神经细胞谱系分化，形成神经外胚层样细胞集落。随后引入特殊的生长因子，促进这些细胞集落的自我组织与增殖，最终形成球形脑类器官。...

由人类多能干细胞生成球形体

本视频展示了通过转染携带受四环素反应元件调控的神经发生转录因子基因的工程化慢病毒，诱导人多能干细胞分化为神经元，并随后用四环素衍生物和成熟培养基处理的过程。...

利用基因工程慢病毒实现人多能干细胞向神经元的分化

该实验通过模拟人类发育过程中所经历的类似检查点，获得端脑神经元。细胞首先被允许自发分化，随后暴露于促使其向神经谱系分化的因子中，再经过分离后接种至盖玻片上，以促进其终末分化与成熟。...

从人类多能干细胞诱导端脑谷氨酸能神经元的特化

我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。...

由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

人诱导多能干细胞（hiPSCs）被认为是药物和化学物质筛选以及新药开发的有力工具 体外...

人诱导性多能干细胞向神经元与胶质细胞混合培养物分化的实验方案用于神经毒性检测

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。...

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

本研究提供了一种详细的技术方法，用于建立一种简单且稳健的皮质类器官培养体系，该体系基于标准的无饲养层人多能干细胞（hPSC）培养系统。该方案快速、高效且可重复，可用于生成模拟脑衰老特征的类器官。 体外.

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

现有的多能干细胞（PSC）向功能性细胞分化的体系目前受到严重的细胞系间和批次间变异性的阻碍。本文以心肌细胞分化为主要示例，介绍了一种基于图像的机器学习方法，用于智能监测和调控PSC分化过程的实验方案。...

一种基于活细胞成像的机器学习策略用于监测多能干细胞分化

了解从人多能干细胞诱导生成神经元和少突胶质细胞前体细胞的方法，用于建立共培养体系研究神经退行性疾病中神经元与少突胶质细胞的相互作用机制。

由多能干细胞生成人神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用多能干细胞, 神经元, 少突胶质细胞, 细胞分化, 神经发育, 共培养, 神经退行性疾病, 人源细胞模型, 髓鞘形成, 神经胶质生物学

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