使用下一代测序技术进行T细胞和B细胞受体免疫组库分析

该方法能够在核苷酸或氨基酸水平上探索特定的T细胞和B细胞，从而识别不同疾病中淋巴细胞群体及多样性参数的动态变化。新一代测序技术的优势在于能够识别独特的T细胞或B细胞克隆，并在不同解剖部位或不同个体中对其进行追踪。这为在多种疾病中发现新的生物标志物提供了可能。

由本实验室研究助理 Naomi Salamon 演示该操作流程。首先对肠活检组织进行消化和细胞裂解。获取新鲜采集或保存在负20或负80摄氏度的肠活检组织。

若使用冷冻的活检样本，请将其置于冰上解冻。向一个预先在冰上预冷的无菌1.7毫升微量离心管中加入600 µL细胞核裂解液。然后将一块活检组织放入管中，在65 °C下孵育15至30分钟。

加入17.5微升浓度为20毫克/毫升的蛋白酶K，将离心管置于55摄氏度下温和振荡孵育过夜。孵育结束后，让样品在室温下冷却5分钟。从血液中分离DNA时，轻轻摇动离心管直至充分混匀。

然后将血液转移至含有9毫升细胞裂解液的无菌15毫升离心管中。在室温下孵育10分钟，期间反复倒置混匀数次。在室温下以600g离心10分钟。

然后尽可能弃去上清液，注意不要扰动可见的白色沉淀。剧烈涡旋振荡管子15秒，直至沉淀完全重悬。加入3 mL细胞核裂解液，并反复吹打数次，使溶液变得黏稠。

向样品中加入蛋白沉淀缓冲液。然后剧烈涡旋振荡20秒，并在冰上孵育5分钟。在16,000g离心4分钟，以形成含有沉淀蛋白的紧密沉淀。

小心转移上清液，避免扰动沉淀，至一个新的1.7毫升离心管中。向含有上清液的管中加入1毫升2-丙醇，并通过轻柔颠倒混匀。DNA应以白色絮状漂浮物的形式变得可见。

在16,000 × g条件下离心1分钟，彻底去除上清液。加入1毫升新鲜配制的70%乙醇，倒置离心管数次。在室温下以16,000 × g离心1分钟。

然后小心弃去上清液。重复乙醇洗涤步骤。随后将DNA沉淀在空气中干燥10至15分钟。

向 DNA 中加入 50 µL 超纯水，并按照文稿中所述方法进行 DNA 定量。使用 150 ng DNA 构建测序文库。将移液器和吸头置于带有紫外灯的生物安全柜中照射 15 分钟，以降解残留的 DNA。

同时，将不同的index管和DNA聚合酶置于冰上融化。在生物安全柜中，从不同的index管中各取45微升加入PCR管中，注意避免交叉污染。然后向PCR管中加入0.2微升DNA聚合酶和5微升已制备的DNA。

根据制造商说明书，使用预设程序进行PCR反应。采用磁珠去除多余的引物、核苷酸和酶。将磁珠在室温下预热至少30分钟，并为每个样本准备足够量的新鲜80%乙醇400微升。

将磁珠加入每个PCR管中，用移液器吹打10次以混匀。室温孵育10分钟。将混合后的样品置于磁力架上静置5分钟。

然后吸去上清液并弃去。使用10微升吸头吸去残留液体。向每个样本中加入200微升80%乙醇，并孵育30秒。

吸取195微升乙醇并弃去。然后使用10微升吸头吸取剩余液体。重复乙醇洗涤步骤。

然后打开管盖，室温下静置干燥5分钟。5分钟后，将样品从磁力架上取下，加入25 µL洗脱缓冲液。用移液器吹打混匀至溶液均匀，室温孵育2分钟。

将试管置于磁力架上静置5分钟。随后转移22微升至新的PCR管中，测定DNA浓度。按照文稿中所述方法对扩增产物进行定量。

在计算出最终的DNA浓度以及产物峰的碱基对大小后，为每个样本配制新的稀释混合液，并取其中2微升转移至一个新的混合池中。配制新鲜的0.2 N氢氧化钠溶液，向稀释后的文库中加入10微升。室温孵育5分钟，以使双链DNA变性。

然后向含有 DNA 的离心管中加入 980 微升试剂盒中的预冷缓冲液，短暂涡旋振荡。将 600 微升最终文库上样至指定的测序芯片中，并将样本放入仪器。进行测序分析时，从测序仪下载测序指标数据，并确认数据处于适当范围内。

对于不符合标准的样本，需重复检测。本方案用于对一名患有IL10受体缺陷且有严重婴儿期发病炎症性肠病（IBD）病史的患者，其自体血液及直肠样本进行代表性基本分析。样本同时进行了TCR-beta和IGH组库的检测。

所有克隆均可通过其在核苷酸或氨基酸水平上的独特序列进行鉴定。这些序列可用于不同患者之间寻找共有的克隆，或同一患者不同解剖部位之间的比较。此处显示每个样本中频率最高的五个克隆。

生成了树状图（TreeMap）图像，以全面概览克隆谱系。每个彩色方块代表一个不同的克隆，其大小与频率相关。这些树状图图像展示了肠道IgH谱系中的克隆扩增现象。

相比之下，在TCR-beta受体库中，血液中的克隆扩增显著高于自体肠道。在基因水平上，NGS可提供关于V、D和J基因在单个基因、基因家族或等位基因水平上的使用情况。此外，可从数据中推断出TCR-beta和IGH受体库的特异性VDJ组合，揭示不同条件下基因使用的差异模式。

该方案可应用于DNA和RNA，可用于构建TCR-α、TCR-γ和IGL的受体库。经过轻微的消化条件调整后，也可适用于其他器官。