大规模培育三维重建人类表皮
May 28th, 2021
该协议描述了一种简单明了的方法，以可复制和稳健的方式培养三维重组的人类表皮。此外，它还特征了表皮屏障模型的结构-功能关系。还介绍了重组后的人类表皮对前燃刺激的生物学反应。
体外或构造的人类表皮模型最早于90年代开发，其主要目标是开发动物实验的替代测试方法。这些3D表皮模型现在通常用于测试化妆品成分的安全性和有效性。虽然它可以从几个组织供应商处购买，但能够在实验室中重新构建 3D 模型，可以更加灵活地达到兴趣的终点。
有几篇研究文章简要地描述了3D表皮模型的重组方案，但迄今为止，还没有视频显示重建过程的关键步骤。这就是发表这篇视频文件的原因。内部重建的人类表皮的制备允许在培养过程中获得很多自由，例如改变培养媒介的组成、亲炎或氧化应激触发、对感兴趣的基因的沉默以及某些生物过程的抑制或刺激。
首先，在37摄氏度的水浴中解冻一个拥有100万低温保存的正常人类表皮角蛋白（NHEK）的瓶，将小瓶的一部分浸入水中。在水浴中孵化小瓶一到两分钟，直到只看到一小片冰。通过上下管道两到三次，非常小心地补充细胞。
将细胞悬架转移到两个 T75 烧瓶中，其中含有总共 15 毫升的预警告解冻介质，导致播种密度为每厘米 6.7 倍 10 至第四个细胞平方。预填充 24 个井板，采用 1.5 毫升的水下介质，理想情况下使用分配器移液器。将细胞培养成80%的共生细胞后，它们准备在插入物中播种，用于培育重建的人类表皮或RHE。
用 NHEK 从 T75 烧瓶中取出基底介质。通过在每个 T75 烧瓶中加入五毫升预热 PBS 来冲洗细胞，然后从烧瓶中取出 PBS。在每个烧瓶中加入两到三毫升预热的 0.05% Trypsin-EDTA，确保试剂溶液均匀分布在烧瓶的细胞培养区域。
将烧瓶放在细胞培养孵化器中四分钟，然后检查细胞是否在 10 X 倍大时使用显微镜分离。敲击烧瓶，帮助细胞从烧瓶表面释放。分离所有细胞后，在每个 T75 烧瓶中加入同等数量的预热肌平素抑制剂，并将细胞悬浮液从烧瓶转移到离心机管中。
用五毫升预热 PBS 冲洗烧瓶，并将其转移到含有细胞悬架的离心管。以400倍G分5分钟将收获的细胞离心。小心丢弃大部分超自然人，在管内留下大约100至200微升。
用手指轻轻轻拂管子，小心松开颗粒。在低容量的水下介质中轻轻补充细胞颗粒，上下管道 5 到 10 次，以确保细胞悬架均匀。从低体积开始，以避免细胞聚合物的形成，并加起来每个初始 T75 烧瓶一毫升的淹没介质。
使用尝试盘蓝色排除方法计算悬架中的细胞。使用文本手稿中提供的第一个方程，用额外的浸入介质稀释细胞悬架，达到每毫升 10 到 5 个细胞的浓度 3.525 倍。执行稀释溶液的第二个单元格计数，并使用文本手稿中的第二个方程来计算要播种到培养插入中的单元格悬架体积。
将24井培养插入载体板的最高位置，并将载体板转移到24个预填充的井板中。将单元格悬架的确定体积添加到每个插入中，注意不要触摸插入物。播种后，在室温下孵化24个井板10至15分钟，以克服边缘效应。
在此期间不要移动板。将板子转移到细胞培养孵化器，并把它们留在水下三天。在细胞培养孵化器中孵化三天后，通过用吸气系统和玻璃巴氏杆管从凹陷舱中取出浸入的介质，将粘附在膜表面的细胞暴露在空气液体接口（ALI）中。
用1.5毫升的新鲜预热ALI介质填充新的24个井板，并将带文化插入的载体板转移到新的多井板中。将多井板移回细胞培养孵化器。每两到三天刷新一次 ALI 介质，为期 14 天。
2D 文化中的角蛋白细胞表现出具有一致多边形的传统形态。在ALI工作15天后，重建的人类表皮形成一个完全分层的组织，由其四个主要表皮层表示。重建协议中不同时间点重建的人类表皮的超结构分析揭示了角膜化过程，随着时间的推移角膜部位层数量增加。
表皮中的角蛋白细胞根据其分化阶段显示不同的蛋白质表达特征。非自愿表达更主要地出现在 SG 层中，而纤维蛋白和洛里林的表达位于上层。除了 SB 层之外，在所有可行的层中都发现了 Keratin-10 表达式。
重建的人类表皮显示功能性脱脂结，如在可行的表皮层的细胞间空间中表达的Desmoglein-1所表明的那样。通过评估已知阻隔破坏者在局部治疗时的组织生存能力，以及评估组织完整性，对重建表皮模型的屏障特性进行了研究。组织完整性在15天后通过用伏表测量TEER来确定。
研究了表皮对脂糖和肿瘤坏死因子α的反应。LPS 和 TNF 阿尔法治疗均无毒。相对于特里顿X-100控制。
使用 IL 裂解对 RHE 介质中内柳金-1α 和因特卢金-8 的释放进行量化。LPS治疗导致在释放蓝素-1阿尔法和蓝金-8时出现具有统计学意义的上行调节。TNF阿尔法治疗只在释放蓝素-1阿尔法时，就产生了具有统计学意义的上升调节。
然而，在与TNFα的刺激下，也观察到白细胞间-8水平增加的明显趋势。按照此协议，TEER 可作为屏障完整性的值进行测量。例如，可行性或细胞毒性可以通过 MTT 或 LDH 检测来测量。
超自然分子可用于测量细胞因子或其他蛋白质的分泌。此外，组织还可用于研究蛋白质或感兴趣的基因的表达。
概述
本协议概述了培育三维重建的人类表皮的方法，强调其结构-功能关系及其对促炎刺激的生物反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 组织工程
背景
- 3D表皮模型的开发是为了提供动物测试的替代方案。
- 这些模型被广泛用于测试化妆品成分的安全性和有效性。
- 在实验室中重建3D模型允许定制实验条件。
- 之前的文献缺乏重建过程的详细视觉协议。
研究目的
- 提供重建人类表皮的全面协议。
- 展示表皮对各种刺激的生物反应。
- 增进对表皮屏障模型的理解。
所用方法
- 解冻和培养正常人表皮角质细胞（NHEKs）。
- 将细胞接种到培养插入物中以重建表皮。
- 在水下条件下孵育，然后暴露于气液界面。
- 评估组织活力和屏障特性。
主要结果
- 重建的表皮在15天后形成一个完全分层的组织。
- 角质细胞根据分化阶段表现出不同的蛋白表达谱。
- 在活力的表皮层中存在功能性桥粒连接。
- 使用已知的屏障破坏剂评估了模型的屏障特性。
结论
- 该协议允许对人类表皮模型进行灵活的实验。
- 重建的表皮有效地模仿了体内条件。
- 该模型可用于研究各种生物过程和反应。
常见问题
Executive Industry Relevance
Large-scale cultivation of three-dimensional reconstructed human epidermis (RHE) enables robust, physiologically relevant in vitro models for skin biology and barrier function studies. This capability supports predictive confidence in early safety, efficacy, and mechanistic de-risking for dermatological and transdermal product pipelines. RHE models facilitate portfolio decisions by providing standardized, reproducible systems for compound evaluation and environmental effect assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of skin barrier mechanisms and cellular differentiation pathways.
- Supports functional validation of targets involved in epidermal structure and response.
- Facilitates mechanistic de-risking for compounds affecting skin integrity or inflammation.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, stratified tissue platform for quantitative barrier and viability assays.
- Enables standardization of cytokine release and protein expression readouts for screening.
- Supports scalability and adaptation for high-throughput compound or environmental testing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant human skin biology for translational biomarker studies.
- Bridges discovery findings to preclinical validation of skin-targeted interventions.
- Reduces reliance on animal models by offering human-relevant tissue responses.
Pipeline & Workflow Integration
This RHE cultivation protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, screening, and translational validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven studies of epidermal differentiation, barrier function, and inflammatory response.
- Screening: Delivers quantitative outputs such as TEER, cytokine release, and viability for compound triage.
- Analytics: Supports immunofluorescence and protein localization analyses for comparative condition assessment.
- Translational Research: Provides continuity for biomarker alignment and disease-relevant modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable platform adaptable to diverse R&D objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in skin biology studies.
- Operational Value: Standardizes tissue model production for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust in vitro testing.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of dermatological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary keratinocyte culture and tissue engineering.
- Needs access to cell culture infrastructure, TEER measurement, and immunofluorescence capabilities.
- Demands cross-team standardization for reproducible tissue generation and assay outputs.
- Adaptable to various experimental triggers, gene silencing, or compound testing as supported by the protocol.
- Limitations include model complexity and the need for careful handling to maintain tissue integrity.
