大规模培养三维重建人表皮
2021年5月28日
本方案描述了一种简便的方法，可重复且稳定地培养三维重建人表皮。此外，还对表皮屏障模型的结构-功能关系进行了表征。同时展示了重建人表皮在受到促炎刺激后的生物学反应。
体外构建的人类表皮模型最早于20世纪90年代开发，其主要目标是建立替代动物实验的检测方法。目前，这些3D表皮模型已广泛用于化妆品原料安全性和功效性的测试。尽管可从多家组织供应商处购买，但在实验室中自行重建3D模型可为特定研究终点提供更大的灵活性。
已有若干研究文章简要描述了三维表皮模型的重建方案，但迄今为止，尚无视频展示该重建过程中的关键步骤。这正是本视频论文发表的原因。自行制备重建人表皮模型可在培养过程中提供极大的灵活性，例如可改变培养基成分、引入促炎或氧化应激刺激、沉默特定目的基因，以及抑制或激活某些生物过程。
首先，将一管含有100万个冻存的正常人表皮角质形成细胞（NHEKs）的冻存管部分浸入37摄氏度的水浴中，进行解冻。将冻存管在水浴中孵育1至2分钟，直至仅剩少量冰晶可见。用移液器轻柔吹打2到3次，将细胞重新悬浮。
将细胞悬液转移至两个T75培养瓶中，共加入15毫升预热的复苏培养基，使接种密度达到每平方厘米6.7 × 10⁴个细胞。使用排液移液器，提前在24孔板中每孔加入1.5毫升浸没培养基。当细胞培养至80%融合度时，即可用于插入物中接种，以构建重组人表皮（RHEs）。
移除含有NHEKs的T75培养瓶中的基础培养基。向每个T75培养瓶中加入5毫升预热的PBS，洗涤细胞，然后吸去培养瓶中的PBS。向每个培养瓶中加入2至3毫升预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，确保胰蛋白酶溶液均匀覆盖培养瓶的细胞培养区域。
将培养瓶放入细胞培养箱中孵育 4 分钟，然后在 10 × 放大倍数下使用显微镜检查细胞是否已脱落。轻敲培养瓶以帮助细胞从瓶壁表面脱落。待所有细胞完全脱落后，向每根 T75 培养瓶中加入等体积预热的胰蛋白酶抑制剂，并将细胞悬液从培养瓶转移至离心管中。
用五毫升预热的 PBS 清洗烧瓶，并将液体转移至含有细胞悬液的离心管中。在 400 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞。小心弃去大部分上清液，管中保留约 100 至 200 微升。
用手指轻轻弹击离心管，小心地松动沉淀物。用少量悬浮培养基将细胞沉淀重新悬浮，上下吹打5至10次，以确保形成均匀的细胞悬液。起始体积宜小，以避免细胞聚集体的形成，每瓶初始T75培养瓶最多可加入1毫升悬浮培养基。
使用台盼蓝排斥法对悬液中的细胞进行计数。根据文稿中提供的第一个公式，用额外的浸没培养基稀释细胞悬液，使其浓度达到每毫升3.525 × 10⁵个细胞。对稀释后的溶液进行第二次细胞计数，并利用文稿中的第二个公式计算需接种到培养插件中的细胞悬液体积。
将24孔培养插件悬挂在载体板的最高位置，并将载体板转移至预先加入浸没培养基的24孔板中。向每个插件中加入确定体积的细胞悬液，注意不要触碰插件。接种后，将24孔板在室温下孵育10至15分钟，以克服边缘效应。
在此期间不要移动培养板。将培养板转移至细胞培养孵箱中，并在浸没条件下培养三天。在细胞培养孵箱中孵育三天后，使用吸液系统和玻璃巴斯德吸管从顶端腔室中移除浸没的培养基，使已贴附于膜表面的细胞暴露于气液界面（air liquid interface, ALI）。
将新的24孔板中加入1.5毫升新鲜预热的ALI培养基，然后将带有培养插件的载体板转移至新的多孔板中。将多孔板放回细胞培养孵育箱。每2至3天更换一次ALI培养基，持续14天。
二维培养的角质形成细胞呈现典型的形态，具有均匀的多边形形状。在气液界面（ALI）培养15天后，重建的人表皮形成完全分层的组织，表现为四个主要表皮层。在重建方案的不同时间点对重建人表皮进行超微结构分析，揭示了角化过程，随时间推移角质层结构的数量逐渐增加。
表皮中的角质形成细胞根据其分化阶段表现出不同的蛋白质表达谱。内披蛋白的表达主要出现在颗粒层（SG层），而丝聚合蛋白和兜甲蛋白的表达则位于更上层。角蛋白-10的表达存在于除棘层（SB层）以外的所有活细胞层中。
重建的人表皮显示出具有功能性的桥粒连接，这通过在活性表皮层细胞间区域表达桥粒芯糖蛋白-1得以证实。通过使用已知的屏障破坏剂进行局部处理后评估组织活性，以及评估组织完整性，来研究重建表皮模型的屏障特性。组织完整性在15天后通过使用电压计测量经皮电阻（TEER）来确定。
研究了表皮对脂多糖和肿瘤坏死因子α的反应性。与Triton X-100对照相比，LPS和TNFα处理均无细胞毒性。
使用IL裂解法对RHE培养基中白细胞介素-1α和白细胞介素-8的释放进行定量。LPS处理导致白细胞介素-1α和白细胞介素-8的释放量显著上调，具有统计学意义。TNFα处理仅导致白细胞介素-1α的释放量显著上调，具有统计学意义。
然而，在 TNF alpha 刺激下，也观察到白细胞介素-8 水平升高的明显趋势。按照本方案，可通过测量 TEER 来评估屏障完整性。细胞活力或细胞毒性可通过 MTT 或 LDH 检测等方法进行测定。
上清液可用于检测细胞因子或其他蛋白质的分泌情况。此外，还可利用该组织研究目的蛋白质或基因的表达。
概述
本方案概述了一种三维重建人表皮的培养方法，重点强调其结构与功能的关系以及对促炎刺激的生物学反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 组织工程
背景
- 开发三维表皮模型旨在提供替代动物实验的新方法。
- 这些模型被广泛用于化妆品原料安全性和功效性的测试。
- 在实验室中重建三维模型可实现对实验条件的定制化调控。
- 以往文献中缺乏关于重建过程的详细可视化操作方案。
研究目的
- 提供一种重建人类表皮的全面实验方案。
- 展示表皮对各种刺激的生物学反应。
- 增进对表皮屏障模型的理解。
使用的方法
- 解冻并培养正常人表皮角质形成细胞（NHEKs）。
- 将细胞接种至培养插件中以重建表皮。
- 先在浸没条件下孵育，随后进行气液界面暴露。
- 评估组织活力及屏障功能。
主要结果
- 重建的表皮在15天后形成完全分层的组织。
- 角质形成细胞在不同分化阶段表现出特异的蛋白质表达谱。
- 活性表皮层中存在功能性的桥粒连接结构。
- 通过已知的屏障破坏剂评估了该模型的屏障特性。
结论
- 该方案支持对人表皮模型进行灵活的实验操作。
- 重建的表皮能够有效模拟体内环境。
- 该模型可用于研究多种生物学过程及生物学反应。
常见问题
执行行业相关性
大规模培养三维重建人表皮（RHE）可为皮肤生物学和屏障功能研究提供稳定且具有生理相关性的体外模型。该技术能力有助于提高对皮肤科及透皮产品管线在早期安全性、有效性以及作用机制风险评估方面的预测可靠性。RHE模型通过提供标准化、可重复的体系用于化合物评价和环境效应评估，从而支持产品组合决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可探究皮肤屏障机制和细胞分化通路。
- 支持对参与表皮结构和应答的靶点进行功能验证。
- 有助于对影响皮肤完整性或炎症的化合物进行机制性风险评估。
筛选与检测方法开发
- 提供可重复、分层的组织平台，用于定量屏障和活性检测。
- 支持细胞因子释放和蛋白质表达读数的标准化，适用于筛选实验。
- 支持可扩展性和适应性，可用于高通量化合物或环境因素测试。
转化与临床前研究
- 与疾病相关的真人皮肤生物学特性一致，适用于转化生物标志物研究。
- 将发现阶段的研究结果与靶向皮肤干预措施的临床前验证相衔接。
- 通过提供与人类相关的组织反应，减少对动物模型的依赖。
流程与工作流整合
该RHE培养方案贯穿早期发现至临床前研究，支持假设验证、筛选及转化验证。
- 发现生物学：支持对表皮分化、屏障功能和炎症反应进行假设驱动型研究。
- 筛选：提供经皮电阻（TEER）、细胞因子释放和细胞活力等定量输出，用于化合物初筛。
- 分析：支持免疫荧光和蛋白质定位分析，用于不同实验条件间的比较评估。
- 转化研究：为生物标志物的对接和疾病相关模型的构建提供连续性支持。
- 企业级复用：提供灵活且可修改的平台，可适应多样化的研发目标。
运营与企业影响
- 科学价值：提高皮肤生物学研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化组织模型的制备，实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过实现可靠的体外测试，提升决策效率，优化资本使用。
- 组合影响：支持基于风险调整的皮肤科学资产优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备原代角质形成细胞培养和组织工程方面的专业知识。
- 需要具备细胞培养基础设施、跨上皮电阻（TEER）测量以及免疫荧光检测能力。
- 要求跨团队标准化操作，以确保组织生成和检测结果的可重复性。
- 可根据实验需求灵活应用于多种刺激因素、基因沉默或化合物测试，具体取决于本方案所支持的条件。
- 局限性包括模型的复杂性以及需谨慎操作以维持组织完整性的要求。
