一种简易的干切法获取整粒种子大小的树脂切片及其应用

籽粒中细胞、淀粉粒和蛋白体的形态学特征及其质量决定了种子的重量和品质。本研究采用LR White树脂包埋完整籽粒，建立了一种简单的整粒干燥吸附方法。我们选择LR White树脂作为包埋介质主要基于两个原因。

首先，它具有低黏度和强渗透性，因此在制备大体积、高淀粉含量的谷物成熟籽粒等坚硬种子切片时表现出良好的适用性。其次，包埋于LR White树脂中的样品可轻易使用多种化学染料进行染色，从而在荧光显微镜下清晰地显示样品的形态结构。制备的切片可进行特异性染色，清晰呈现整粒籽粒中细胞、淀粉粒和蛋白体的分布，同时可对形态学参数进行定量分析。

该方法包含多个研究步骤。此处，我们以体积较大、高淀粉含量的成熟玉米籽粒为样品，逐步展示操作流程。首先，将籽粒剪入一个简单的瓶子中。

加入约10毫米的2.5%磷酸盐缓冲戊二醛，调节pH至7.2，置于4摄氏度环境中固定48小时。随后取出这些样品，将其纵向或横向切成2至3毫米厚的切片。

需要使用锋利的双面刀片。然后将样品再固定 48 小时。接下来，用约 10 毫米即 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤样品三次，每次 30 分钟。

为逐步水合样品，首先将样品浸入约10毫米的30%乙醇水溶液中30分钟，随后依次浸入10毫米的50%、70%、90%乙醇溶液各一次，再浸入100%乙醇溶液三次。为逐步渗透样品，需在4摄氏度条件下，每次用12小时，依次用10毫米的LR White树脂溶液与乙醇按25%、50%、75%浓度稀释的溶液各处理一次，再用100% LR White树脂溶液处理两次。包埋前，我们需要为样品制备底座。

向2毫升离心管中加入250微升纯LR White树脂，并在6摄氏度下聚合48小时。接着，依次加入500微升纯LR White树脂，并将带有底座的样品浸入离心管中。用解剖针将样品摆正后，将树脂置于6摄氏度的烘箱中反应48小时。

从离心管中取出包埋的样品块，使用锋利的刀片切除样品周围的多余树脂。将树脂块放入切片机的样品夹中，用刀片削去样品表面及周围的过量树脂。最后使用玻璃刀对样品表面进行精细修整，直至能够形成完整的切片。

现在开始准备切取厚度为两微米的优质切片。切片前，在刀刃上方约两毫米处放置一根细小的铜丝，以防止切片卷曲。当切片逐渐延长时，在切片下方插入铜丝以提供支撑。

接下来，将100微升水滴加到未凸起的载玻片上，并用镊子小心地将完整且无破损的切片转移至水中。在50摄氏度下加热并干燥，以展平皱褶的切片。最后，需要注意两个重要提示。

首先，如果切片出现碎裂或撕裂，请延长样本的每次树脂浸透时间。其次，如果切片上出现与刀刃平行的条纹，请将样本块夹紧；如果切片上出现与刀刃垂直的条纹，请更换新刀片。

为了观察细胞、淀粉粒和蛋白质体的形态，我们可以分别使用荧光增白剂28、碘液和考马斯亮蓝R250对切片进行染色。对于其他特定染色方法，应根据研究方案确定。此处以碘液染色淀粉粒为例。

加入 40 微升碘溶液以浸没切片，将切片置于染色缸中一分钟，然后用盖玻片覆盖样品。

并用吸水纸吸去其周围多余的试剂溶液。立即在配备CCTV摄像头的光学显微镜下观察并拍摄样品。我们可以利用形态学分析软件对拍摄的图像进行处理和定量分析，测定籽粒不同区域的细胞、淀粉粒和蛋白体的面积、长轴或短轴以及圆度等参数。

我们建立了一种简单的干法切片技术，用于在LR White树脂中保留完整籽粒大小的切片。该方法可制备整个籽粒的横切面和纵切面，厚度为两微米。例如，可对成熟油菜籽的完整种子进行横切和纵切。

体积较大的成熟玉米完整籽粒的切片也可成功制备。此外，发育中的籽粒、煮熟的籽粒以及萌发的籽粒也可利用该方法进行研究。制备好的完整籽粒切片具有以下应用。

首先，可以利用完整籽粒的切片来观察种子的组织结构。例如，用藏红染色的油菜胚整体切片可以清晰地显示其胚根、子叶、内层和外层结构。完整籽粒的切片还可用于观察和分析细胞形态。例如，用荧光增白剂28染色的油菜胚横切片可特异性地显示细胞中的油脂。

整个胚胎任意区域细胞的显微形态均可在高倍镜下显示。利用形态学分析软件可对薄壁细胞的形态参数进行定量分析，并揭示胚胎不同区域之间存在的某些差异。经荧光增白剂28染色的玉米全胚乳横切面也可呈现细胞形态，且在胚乳不同区域，细胞的形态参数亦存在差异。

可用碘液对完整籽粒进行染色，以显示其淀粉粒的形态。例如，经碘液染色的玉米籽粒横切面和纵切面均可清晰展示淀粉粒的形态。在胚乳细胞的不同区域中，淀粉粒在形态、大小和数量上均表现出显著差异。因此，对淀粉粒形态参数的定量分析表明，胚乳不同区域间的淀粉粒存在显著差异。

这些切片可用于观察和分析蛋白质体的形态。例如，淀粉蛋白可使用考马斯亮蓝R250染成蓝色。在低倍镜下可以观察到油菜胚整体中淀粉蛋白的空间分布，而在高倍镜下则可清晰展示其显微结构。

此外，还可对所选区域内蛋白体的数量误差指数和形态参数进行定量分析。该技术首次实现了对发育中和成熟种子完整籽粒树脂切片的简便制备。通过该方法可对完整籽粒的组织结构进行切片观察，进而研究完整籽粒不同区域的细胞、淀粉粒以及蛋白体的形态特征。

所获得的图像可进行定量分析，以展示细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态参数，并进一步比较整粒种子不同区域之间的差异。