Name: 开发和测试针对物种的定量PCR检测环境DNA应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 了解如何设计和优化基于探针的定量PCR检测方法，用于从环境样本中检测目标物种的环境DNA。本方案涵盖序列比对、引物设计、体外效率测试及特异性验证等关键步骤，为准确解读eDNA数据提供可靠技术支持。

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感谢 Alvi Wadud 和 Trudi Frost 在引物开发与测试中提供的帮助。本研究中检测方法设计的资金由美国国防部战略环境研究与发展计划（RC19-1156）提供。所提及的任何贸易、产品或公司名称仅用于描述性目的，不表示美国政府的认可。本研究产生的数据可在美国地质调查局数据发布平台获取：https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5。

<ol><li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li>
<li>Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology. 10, 5(1992).</li>
<li>Mauvisseau, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+accuracy%2C+repeatability+and+detection+probability+in+the+reliability+of+species-specific+eDNA+based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches.</a> Scientific Reports. 9 (1), 580(2019).</li>
<li>Hernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((60+specific+eDNA+qPCR+assays+to+detect+invasive%2C+threatened%2C+and+exploited+freshwater+vertebrates+and+invertebrates+in+Eastern+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+DNA%22%5BJournal%5D)">60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada.</a> Environmental DNA. , (2020).</li>
<li>Klymus, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+the+limits+of+detection+and+quantification+for+environmental+DNA+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+DNA%22%5BJournal%5D)">Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays.</a> Environmental DNA. , (2019).</li>
<li>Thalinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validation+scale+to+determine+the+readiness+of+environmental+DNA+assays+for+routine+species+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Helbing, C. C., Hobbs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+Standardization+Needs+for+Fish+and+Wildlife+Population+Assessments+and+Monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22CSA+Group%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring.</a> CSA Group. , (2019).</li>
<li>Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Environmental+DNA+Methods+Ready+for+Aquatic+Invasive+Species+Management%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management.</a> Trends in Ecology & Evolution. , (2020).</li>
<li>Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+is+a+PCR+efficiency+estimate%3A+Recommendations+for+precise+and+robust+qPCR+efficiency+assessments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).</li>
<li>Wilcox, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+rare+species+using+environmental+DNA%3A+the+importance+of+primer+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity.</a> PLoS One. 8 (3), 59520(2013).</li>
<li>Prediger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+design+primers+and+probes+for+PCR+and+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22IDT%22%5BJournal%5D)">How to design primers and probes for PCR and qPCR.</a> IDT. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.idtdna.cco/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes">http://www.idtdna.cco/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes</a> (2020).</li>
<li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+%28qPCR%29+primer+design+using+free+online+software%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).</li>
<li>Owczarzy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDT+SciTools%3A+a+suite+for+analysis+and+design+of+nucleic+acid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers.</a> Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 163-169 (2008).</li>
<li>Kibbe, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OligoCalc%3A+an+online+oligonucleotide+properties+calculator%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.</a> Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 43-46 (2007).</li>
<li>Taylor, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ultimate+qPCR+Experiment%3A+Producing+Publication+Quality%2C+Reproducible+Data+the+First+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time.</a> Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (134), 11(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Local+Alignment+Search+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic Local Alignment Search Tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+Vol.+5279%22">Bio-Rad Vol. 5279</a>. , ed Bio-Rad (2020).</li>
<li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+Vol.+6894%22">Bio-Rad Vol. 6894</a>. , Bio-Rad (2020).</li>
<li>Eurogentec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eurogentec.+Vol.+0708-V2%22">Eurogentec. Vol. 0708-V2</a>. , ed Eurogentec (2020).</li>
<li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+primer+design+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li>
<li>Hoorfar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+in+design+of+internal+amplification+controls+for+diagnostic+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).</li>
<li>Goldberg, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+considerations+for+the+application+of+environmental+DNA+methods+to+detect+aquatic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).</li>
<li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+%28eDNA%29+Assays+for+Invasive+Populations+of+Black+Carp+in+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Fisheries+Society%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America.</a> Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).</li>
<li>Mosher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+molecular+detection+studies+require+clear+communication+among+diverse+research+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Ecology+and+the+Environment%22%5BJournal%5D)">Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners.</a> Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).</li>
<li>Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+DNA+barcoding%3A+low+species+coverage+and+numerous+unidentified+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cladistics%22%5BJournal%5D)">An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences.</a> Cladistics. 28, 6(2012).</li>
<li>Rees, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REVIEW%3A+The+detection+of+aquatic+animal+species+using+environmental+DNA+-+a+review+of+eDNA+as+a+survey+tool+in+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Ecology%22%5BJournal%5D)">REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology.</a> Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).</li>
<li>Evans, N. T., Lamberti, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshwater+fisheries+assessment+using+environmental+DNA%3A+A+primer+on+the+method%2C+its+potential%2C+and+shortcomings+as+a+conservation+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research%22%5BJournal%5D)">Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool.</a> Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).</li>
<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
<li>Sengupta, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+for+improved+detection+and+environmental+surveillance+of+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).</li>
<li>Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+eDNA+shedding+rates+from+invasive+bighead+carp+Hypophthalmichthys+nobilis+and+silver+carp+Hypophthalmichthys+molitrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Conservation%22%5BJournal%5D)">Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix.</a> Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定是否发表研究成果等方面均未发挥作用。

与任何研究一样，明确需要解决的科学问题是第一步，而环境DNA（eDNA）检测方法的设计取决于研究的范围26。例如，如果研究或调查的目标是检测一种或少数几种物种，则应优先选择基于特异性探针的靶向检测方法；然而，如果目标是评估更大范围的物种组合或群落结构，则高通量测序宏条形码检测方法更为合适。在确定采用何种策略后，建议开展预实验，包括检测方法的设计、测试与优化24。检测方法的设计始于物种列表的建立，如图1所述。该列表是评估检测方法在特异性以及适用地理范围方面性能的基础6,10。建议针对特定地理区域设计检测方法，这有助于设计者更好地测试该方法在该区域内与其他物种发生交叉反应的可能性，同时明确将该方法推广至其他存在目标物种的区域时可能面临的局限性24。列表完成后，可从公共遗传数据库中下载相应序列。由于这些数据库并不完整27，应尽可能在实验室内部对列表中的物种进行测序，以完善用于检测方法设计的本地参考序列数据库。应优先考虑与目标物种共存且亲缘关系较近的物种，因为这些物种最有可能作为非靶标被扩增。重点关注与目标物种同属或同科的所有物种是一个良好的起点。与近缘物种的序列比对有助于识别目标物种特有的序列区域，从而帮助判断该检测方法在其他生态系统或地理位置中的潜在表现。线粒体基因区域通常是检测方法开发的首选，原因在于“生命条形码”项目已积累了大量不同物种的线粒体基因序列信息，且线粒体DNA在细胞中的拷贝数远高于核DNA24,28,29。由于不同分类群在遗传数据库中的序列覆盖度存在差异，应评估多个基因区域以推进后续的检测方法开发。在构建完成本地参考序列数据库后，需结合手动比对可视化分析和计算机软件程序共同设计引物/探针检测体系。不应完全依赖软件来决定测试哪些检测方案。重要的是要通过比对图谱直观验证引物和探针在靶标与非靶标序列上的结合位置，以更准确地预测其在PCR反应中的行为。最终的检测方法筛选与优化包括三个层次：计算机模拟（in silico）、体外实验（in vitro）和实地验证（in situ）6,7,24,25。计算机模拟设计与测试对于筛选出成功率较高的候选检测方法至关重要，但经验性的体外实验测试对于最终选择实际性能最优的检测方法不可或缺。体外优化与测试包括评估反应效率，并确定检测方法的灵敏度与特异性。检测限（LOD）和定量限（LOQ）是检测方法开发中常被忽视但对数据解读至关重要的两个参数。通过为检测方法运行多重复的标准曲线，可轻松测定LOD和LOQ1,5,30。尽管少数研究在结果分析中考虑了检测方法的LOD或LOQ，Sengupta等人（2019）将其检测方法的LOD和LOQ整合进数据解读与图表展示中，从而更清晰地呈现了研究结果31。此外，应在设计的检测体系中加入多重内参阳性对照（IPC）。若未检测样本中的PCR抑制效应，可能导致假阴性结果24,32。我们建议将多重IPC检测与目标检测联合使用，作为最简便的PCR抑制检测方法23。最后，必须利用野外和实验室采集的样本对检测方法进行实地（in situ）验证，以确保目标片段能够在环境样本中成功扩增24。
在环境DNA（eDNA）样本中使用物种特异性的探针法qPCR检测存在一定的局限性。例如，由于序列数据的可获得性有限，可能难以设计多个用于测试的检测方法，因而不得不在检测性能的某些方面做出妥协。这些选择必须依据研究目标来确定，并应在结果报告中予以说明26。例如，如果研究目标是检测稀有物种且预期阳性样本较少，则即使检测方法的特异性不完美（即可能扩增非目标物种），只要所有检测结果都将通过测序验证，该方法仍可使用。如果目标是监测某物种的地理分布范围，且无需eDNA浓度数据，则可使用扩增效率不理想的检测方法，结果仅以检出率百分比形式报告。此外，除非在实验室中对所有可能的同属物种进行测试（这种情况很少可行），否则无法绝对确定某一检测方法的真实特异性。例如，本检测方法是在克林奇河（Clinch River）的多种淡水蚌类物种基础上设计并验证的。若要在其他河流系统中使用该检测方法，则需在新地点对该区域的一系列物种进行测试。在检测方法开发过程中未测试的物种或种群内部的遗传变异也可能影响其特异性。最后，即使某一检测方法已被证实具有良好的技术性能，但在野外工作时条件会发生变化。与检测方法本身无关的因素，如水流、pH值和动物行为，以及不同的eDNA采集和提取方案，均可能影响eDNA的可检出性。使用经过优化且描述详尽的检测方法，将有助于明确这些&#160;参数对&#160;eDNA检测&#160;的影响。
环境DNA（eDNA）领域正从探索性分析阶段逐步走向方法与技术的日益标准化。这些进展将增进我们对eDNA技术、能力及其局限性的理解。我们上述所概述的优化流程可提高检测方法的灵敏度、特异性和可重复性。对eDNA方法进行完善和标准化的最终目标，是提升研究人员基于eDNA数据做出推断的能力，同时增强最终用户和相关利益方对结果的信心。

研究人员和管理者对环境DNA检测技术在物种检测中的应用日益关注。在过去三十年中，定量PCR或实时PCR（qPCR/rtPCR）已被广泛应用于多个领域，用于核酸序列的特异性检测与定量1,2。在相对较新的环境DNA研究领域，使用标准曲线对每单位体积或质量的环境DNA样本中目标DNA拷贝数进行定量，现已成为常规操作。环境DNA检测通常以线粒体DNA序列为靶标，因为线粒体基因组在每个细胞中存在数千个拷贝，但针对核DNA或RNA序列的检测也是可行的。必须认识到，已发表的环境DNA检测方法在性能上并不总是等同的。由于检测方法在设计、筛选、优化和验证过程中的差异，其仅检测目标物种DNA的能力（即特异性）以及对低浓度目标DNA的检出能力（即灵敏度）可能存在显著差异。以往对检测性能的定量评估指标报告普遍不足，但近年来，旨在提高检测方法开发透明度的标准正在逐步建立3,4,5,6,7,8。
优化并报告检测方法的性能有助于设计研究并解读环境DNA（eDNA）调查结果。如果检测方法与非目标物种的DNA发生交叉反应，可能导致假阳性结果；而灵敏度较差的检测方法即使在样本中存在目标物种DNA时也可能无法检出（假阴性）。了解检测方法的灵敏度和选择性，有助于确定检测稀有物种所需的采样力度。由于eDNA存在多种天然变异来源，研究必须尽可能控制可调控的变异来源，包括对eDNA检测方法进行全面优化和表征3。
直接影响检测特异性或灵敏度的条件会改变检测的性能。这种情况可能在不同的实验室条件下发生（例如，不同的试剂、操作人员、仪器等）。因此，在新的条件下应用检测方法时，应重新评估本方案。即使文献中已有充分表征的检测方法，在被新实验室采用或使用不同试剂（例如，预混液）时，也应进行测试和优化5,9。当检测应用于不同地理区域时，其特异性可能发生变化，因为此时检测对象来自新的生物群落，其中可能包含该检测方法未曾验证过的非靶标物种，同时靶标物种本身也可能存在遗传变异。因此，在新地点使用检测方法时，应重新进行评估。野外条件与实验室条件不同，因为在野外样本中更可能含有PCR抑制物。PCR抑制物会直接影响扩增反应，从而影响检测性能。因此，在开发环境DNA（eDNA）检测方法时，必须设置内参阳性对照。
最后，野外环境条件可能通过DNA降解、迁移和滞留等过程影响目标物种的DNA分子及其捕获。此外，不同的DNA采集和提取方案在效率以及DNA保留能力方面也存在差异。然而需要指出的是，这些过程影响的是eDNA的可检出性，而非分子检测方法本身的性能。因此，野外样本中目标物种DNA的可检出性，取决于qPCR检测技术的性能以及野外环境条件、采样、保存和提取方案的综合作用。当使用经过充分验证且性能优良的检测方法时，使用者可充分信赖该方法的检测能力，从而将研究重点转向影响eDNA检出的外部因素（即环境变量、捕获或提取方案的差异）。
本文重点通过严谨的设计与优化，探讨检测技术的性能表现。我们以一种基于探针的检测方法为例进行说明，该方法用于从美国克林奇河（Clinch River）采集的水样中检测一种淡水贻贝——穆克特贻贝（Actinonaias ligamentina）。近期，Thalinger 等人（2020）提出了靶向环境DNA（eDNA）检测方法的验证指南。按照本方案进行检测方法的设计，可使该检测达到 Thalinger 等人所定义的第4级验证水平，并进一步向第5级验证迈进一步6。至此，该检测方法的技术性能将得到优化，具备在实验室和野外应用中常规使用的条件。随后，通过在实验室、中型生态系统（mesocosm）及野外实验中的进一步应用，可进一步探究eDNA的检出情况及其可检测性的影响因素，从而完成第5级验证的最终步骤6。

<table><tbody><tr><td>带盖可逆96孔板架</td><td>Globe Scientific</td><td>456355AST</td><td></td></tr><tr><td>洁净手套（例如乳胶、丁腈等）</td><td>Kimberly-Clark</td><td>43431, 55090</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch 实时荧光定量PCR检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 优质微量离心管：2.0 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>2681332</td><td></td></tr><tr><td>硬壳96孔PCR板，低矮型，薄壁，带裙边，白色/透明</td><td>Bio-Rad</td><td>#HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>IPC 正向与反向引物</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>定制产品</td></tr><tr><td>IPC PrimeTime qPCR 探针</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>定制产品</td></tr><tr><td>IPC Ultramer DNA 寡核苷酸合成模板</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>定制产品</td></tr><tr><td>Labnet MPS 1000 紧凑型PCR板迷你离心机</td><td>Labnet</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Various</td><td>-</td><td>任何可容纳1.5 mL和2.0 mL离心管的微量离心机通常均可使用。</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR板密封膜，带粘性，光学透明</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水（非DEPC处理）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 GP LTS 1000 &amp;micro;L F 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389272</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 GP LTS 20 &amp;micro;L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389274</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 GP LTS 200 &amp;micro;L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389276</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Rainin</td><td>Various</td><td>根据实验室偏好，可使用手动或电子移液器，最大量程可不同。</td></tr><tr><td>TaqMan 环境反应主混合液 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4396838</td><td></td></tr><tr><td>目标基因正向与反向引物</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>定制产品</td></tr><tr><td>目标基因 PrimeTime qPCR 探针</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>定制产品</td></tr><tr><td>目标基因合成gBlock片段</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>定制产品，用于qPCR标准品稀释系列</td></tr><tr><td>TE缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENIE 2 涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>50728002</td><td></td></tr></tbody></table>

环境dna应用中物种特异性定量pcr检测方法的开发与验证

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

目前，正在开发新的非侵入性方法以检测和监测物种的存在，从而辅助渔业和野生动物保护管理工作。利用环境DNA（eDNA）样本检测大型生物体是其中迅速普及并已被纳入国家管理计划的一类方法。本文重点介绍用于探针法定量PCR（qPCR）应用的物种特异性靶向检测方法的开发。相比仅使用引物的方法，探针法qPCR具有更高的特异性。此外，能够定量样本中DNA含量这一能力，有助于我们理解eDNA的生态学特征以及解读野外eDNA检测模式。在开发和测试此类检测方法时，必须审慎考虑，以确保从环境样本中检测目标物种时具备足够的灵敏度和特异性。本实验方案将详细说明设计和测试探针法检测方法所需的步骤，包括序列数据库的构建、检测方法的设计、筛选与优化、性能测试以及野外验证。遵循这些步骤有助于建立一种高效、灵敏且特异的检测方法，并可令人信服地加以应用。我们以针对美国克林奇河（Clinch River）分布的一种淡水蚌类——穆克特蚌（Actinonaias ligamentina）种群所设计的检测方法为例，展示该流程的具体实施过程。

在设计针对细褶蚌（mucket）的物种特异性qPCR检测方法时A. ligamentina），下载了克林奇河中所有蚌科（Unionidae）物种的可用序列。密切相关的物种，例如 Lampsilis siliquoidea 尽管这些物种并未在同一条河流中发现，但仍被纳入参考数据库。由于目标河流系统中的并非所有物种都能在GenBank中找到，因此额外对部分物种进行了内部测序。使用Geneious软件对序列进行比对，并利用Primer Quest（IDT）软件设计多个检测方法。在比对结果中加入了五组引物和探针，以便进行可视化评估图2随后使用Primer-Blast进行计算机模拟测试，之后订购引物用于体外进一步验证。. 在实验室中，使用27种可获得物种的DNA提取物对所有检测方法进行了特异性验证。其中一种检测方法（A.lig.1）仅成功扩增了目标物种表1; 表2）。该检测方法被推进至进一步测试其检测效率、检出限（LOD）和定量限（LOQ）。其扩增片段长度为121个碱基对。 表3 显示所使用的序列 A. ligamentina 合成DNA标准品 图3A&#160;和 图3B&#160;展示一次成功检测的结果，具有良好的效率和r2 值。 图3C&#160;和 图 3D&#160;显示一个标准曲线效率较差的检测，该检测已被弃用。根据 Klymus 等人所述的离散法，所选检测（A.lig.1）的检出限（LOD）和定量限（LOQ）均为 5.00 拷贝/反应。5. 与检测同时进行多重扩增的IPC（内参）表3-6）未影响 A. ligamentina 检测的标准曲线。我们使用的内参对照（IPC）是小鼠HemT转录本的一段片段。该检测由IDT预先设计用于其他应用，但我们对其进行了修改，使其成为本实验室环境DNA（eDNA）应用的内参对照。
一次成功的qPCR实验应在各项性能指标上均达到特定标准（即标准曲线扩增、基因组DNA阳性对照、无模板对照以及内参阳性对照）。目标检测的标准品应呈现指数扩增曲线，若循环次数足够，这些曲线应达到平台期。这表明反应过程中荧光探针已被完全消耗，荧光信号水平达到最大极限。扩增较晚的标准品可能在40个循环内无法达到平台期。阳性对照（基因组DNA和IPC）应呈现相同的扩增模式。待测样本可能扩增也可能不扩增，但若发生扩增，其扩增曲线也应呈指数增长并出现终点平台期（图5）。
在高质量的qPCR中，标准品稀释系列的扩增Cq值应均匀分布，浓度每稀释10倍，Cq值相差约3.3个循环。每个标准品稀释浓度的重复样本应高度聚集，Cq值几乎相同（由r表示）2 值）。所有标准品稀释液均应出现扩增（图 3A）。在较差的 qPCR 实验中，标准品可能呈现非指数型扩增曲线、不同稀释度之间的 Cq 值变异不均、无法达到平台期，或某些稀释度完全不发生扩增（图3D).
标准曲线的重要参数包括扩增效率、r2、斜率和y轴截距。扩增效率应在90%–110%之间，理想值接近100%；r2值应高于0.98，理想结果接近1.015,22。斜率值应在-3.2至-3.5之间，理想结果接近-3.322。y轴截距对应的Cq值应在34–41之间，理想结果为Cq 37.0。y轴截距表示含有1个拷贝目标序列的反应所预测的Cq值，这是单次qPCR可检测的最小单位。未知样本的Cq值若高于y轴截距，可能表明存在扩增抑制。在存在抑制或引物效率较低的情况下，可能需要运行超过40个PCR循环才能检测到目标序列，但此时无法进行定量分析；应同时运行额外的阴性对照（不含目标序列但含有与未知样本相似总量的DNA），以排除非特异性扩增的可能。
内参（IPC）扩增在&#160;未知样本应与阴性模板对照IPC的结果进行比较，因为此时不存在试剂竞争且无抑制物存在。若未知样本的IPC扩增曲线Cq值比NTC的平均Cq值大2个循环或以上，或未发生扩增，则应视为存在抑制作用。若样本中无抑制物存在，则所有IPC扩增在图中应呈现紧密聚集，且Cq值与NTC相近图6).
最后进行了现场检测。2019年9月25日至26日，从已知存在A. ligamentina的蚌类栖息地500米范围内采集了20份来自克林奇河的水样以及3份野外空白样品进行过滤。每个采样点大约过滤4份1 L水样。采样地点包括河流中蚌床底部、近岸处蚌床底部、蚌床下游100 m处的河床、蚌床下游500 m处的河床以及蚌床下游500 m处的近岸区域（图7）。回到实验室后，将每张滤膜切成两半，仅从其中一半提取DNA。每个样品剩余的滤膜半片保存于-80 °C冰箱中。随后使用A.lig.1检测法与内参质控（IPC）进行多重扩增。在23份样品中，有5份出现抑制现象。这些样品按1:10稀释后重新检测。20份野外样品中有19份在设计的检测体系中实现了扩增。在这19份样品中，有5份的扩增拷贝数高于该检测方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），即5拷贝/反应；这意味着大多数样品中均检测到了环境DNA（eDNA），但浓度较低，可能导致假阴性结果，且该检测方法无法对这14份样品的拷贝数进行可靠定量。尽管如此，在每个采样点的四个生物学位点重复样品中，75%至100%实现了扩增。三个野外空白样品中有两个为阴性，而另一个出现了扩增信号，这凸显了野外操作过程中保持清洁技术的重要性。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61825/61825fig01.jpg" /> 
图1：线粒体DNA序列数据库构建的工作流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61825/61825fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61825/61825fig02.jpg" /> 
图2：Clinch河蚌类物种的序列比对结果，显示用于&#160;Actinonaias&#160;ligamentina ND1检测的候选引物和探针。&#160;正向引物为深绿色，探针为红色，反向引物为浅绿色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61825/61825fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61825/61825fig3v2.jpg" /> 
图3：标准曲线与线性回归示例。&#160;A. 由六个标准品稀释浓度中每个浓度三个重复的扩增结果所获得的可接受标准曲线示例。标准品为10倍系列稀释，浓度最高者位于左侧，依次递减&#160;浓度向右移动。水平方向&#160;穿过所有扩增曲线的直线代表定量循环阈值（Cq）。每条曲线与该阈值相交的点即为Cq值的确定位置。 B由图3A的标准品重复孔绘制的线性回归曲线。标准品稀释液的重复孔以圆圈表示，未知样本（样品）以x表示。扩增效率为98.9%，r2 接近 1.0，斜率为 -3.349。 C. 由六个样本各三个复孔的扩增结果生成的不合格标准曲线示例&#160;标准稀释液 D. 示例3C中标准品重复扩增所绘制的标准曲线的线性回归。注意其较低的扩增效率和r2 数值。还需注意，6个标准品中仅有4个发生扩增。若重复运行后标准曲线仍未改善，则问题可能源于引物/探针组合不佳，未能按预期扩增目标DNA，此时不应采用该检测方法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61825/61825fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61825/61825fig04.jpg" /> 
图4：检测限（LOD）和定量限（LOQ）标准qPCR实验中微孔板设置示例。&#160;标准曲线中使用标准品以蓝色表示，标准品浓度由深蓝至浅蓝递减。DNA阳性对照以绿色表示，无模板对照（NTC）以黄色表示。实验用标准品浓度以灰色表示，每个标准稀释度包含24个重复。稀释系列分布在两块&#160;微孔板（A、B）上，每块板均包含一条标准曲线、一个阳性对照和一个NTC。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61825/61825fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61825/61825fig05.jpg" /> 
图5：qPCR实验的孔板设置及扩增曲线&#160;A. 板孔设置，标准品以蓝色表示，颜色越深表示标准品浓度越高。DNA阳性对照以绿色表示，无&#160;黄色为模板对照（NTC），灰色为样本目标。 B. qPCR 扩增曲线图。标准品以蓝色表示，DNA 阳性对照以绿色表示，无模板对照在&#160;黄色为模板对照，红色为未知样本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61825/61825fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61825/61825fig06.jpg" /> 
图6：内参阳性对照（IPC）的扩增曲线。&#160;所有未知样本的IPC扩增曲线以洋红色显示，无模板对照（NTC）中的IPC以橙色带三角形标记显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61825/61825fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61825/61825fig07.jpg" /> 
图7：显示位于弗吉尼亚州与田纳西州边界沿线的克林奇河一处贻贝床环境DNA采样点的地图。&#160;样品采集点位于贻贝床底部的华伦斯弯（Wallens Bend），以及贻贝床下游100米和500米处。采样点位置均在河道中央（河道内）或距岸边约1–2米处（岸边）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61825/61825fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>名称</td>
			<td colspan="2">序列 5’ – 3’</td>
			<td>荧光标记</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正向引物</td>
			<td>A.lig.1-f</td>
			<td colspan="2">CCCTCATCACGTACCTCTTAATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反向引物</td>
			<td>A.lig.1-r</td>
			<td colspan="2">GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>探针</td>
			<td>A.lig.1 probe</td>
			<td colspan="2">TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：设计的Actinonaias&#160;ligamentina qPCR检测（A.lig.1），包含正向引物、反向引物和探针的序列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物种</td>
			<td>已扩增</td>
			<td>在克林奇河中</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. Actinonaias ligamentina</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Actinonaias pectorosa</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Amblema plicata</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Corbicula spp.</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Cumberlandia monodonta</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Cyclonaias tuberculata</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. Cyprogenia stegaria</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8. Elliptio dilatata</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9. Epioblasma brevidens</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10. Epioblasma capsaeformis</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11. Epioblasma florentina aureola</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12. Epioblasma triquetra</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13. Fusconaia cor</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14. Fusconaia subrotunda</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15. Lampsilis ovata</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16. Lampsilis siliquoidea</td>
			<td>否</td>
			<td>否</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17. Lasmigona costata</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18. Lemiox rimosus</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19. Lexingtonia dolabelloides</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20. Medionidus conradicus</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21. Plethobasus cyphyus</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22. Pleurobema plenum</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23. Ptychobranchus fasciolaris</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24. Ptychobranchus subtentus</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25. Quadrula pustulosa</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26. Strophitus undulatus</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27. Villosa iris</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：用于A.lig.1检测方法体外特异性测试的物种列表。 该检测方法可扩增目标物种（Actinonaias&#160;ligamentina）的基因组DNA，但未扩增任何非目标物种的DNA。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td colspan="5">序列 5’-3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="10">Actinonaias ligementina 标准品</td>
			<td colspan="5">CCCTCATCACGTACCTCTTAATCCTATTAGGTGTCGCATTTTTCACTCTTCTTGAACGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">AAGCCCTCGGGTACTTTCAAATCCGAAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">CCCAACCATTAGCAGATGCTCTAAAGCTCTTCGTAAAAGAATGAGTAACACCAACCTCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">CAAACTACCTACCCTTCATCTTAACCCCAACCACTATGTTAATTTTAGCACTTAGACTTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">GACAATTATTTCCATCCTTTATANTATCATCCCAAATANTTTTTGGTATGCTCCTATTCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">TGTGTATCTCCTCCCTAGCTGTTTATACAACACTTATAACAGGCTGAGCCTCAAACTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">AATATGCCCTTTTAGGAGCTATTCGAGCCATAGCCCAAACCATTTCTTATGAGGTTACAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">TAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">内参模板 (Hem-T)</td>
			<td colspan="5">CTACATAAGTAACACCTTCTCATGTCCAAAGCTCTCTGAGTGTCCCTCGAATCTCAGACGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">GTATGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCGGCTGCTCTATGTTCTCAAGGACTGCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：本实验所用的Actinonaias ligamentina标准品及内源性对照模板（Hem-T）的序列（5’-3’）。 正向和反向引物的序列以粗体和斜体标出，探针序列则加下划线。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>名称</td>
			<td colspan="2">序列 5’ – 3’</td>
			<td>荧光标记</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正向引物</td>
			<td>HemT-F</td>
			<td colspan="2">TCTGAGTGTCCCTCGAATCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反向引物</td>
			<td>HemT-R</td>
			<td colspan="2">GCAGTCCTTGAGAACATAGAGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>探针</td>
			<td>HemT-P</td>
			<td colspan="2">TGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCG</td>
			<td>Cy5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：内参阳性对照（IPC）检测，包含正向引物、反向引物和探针的序列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>每样本体积（µL）</td>
			<td>组分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Environmental Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>20uM A. lig.1 F/R mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>2.5uM A. lig.1 probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>5uM IPC 引物混合物（HemT-F/R）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75</td>
			<td>2.5uM IPC 探针（HemT-P）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5</td>
			<td>IPC 模板的 1 × 103 浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.75</td>
			<td>H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>样本</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>总体积</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：用于A.lig.1检测与IPC检测多重扩增的PCR反应体系。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td></td>
			<td>温度 (°C )</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>初始变性</td>
			<td>95</td>
			<td>10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>变性</td>
			<td>95</td>
			<td>15 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>退火</td>
			<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>返回步骤 2，重复 39 次</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表6：A.lig.1 检测的反应条件。

环境DNA检测在开始野外数据采集之前，必须经过严格的设计、测试、优化和验证。本文提供了一套实验方案，指导用户完成针对目标物种DNA的特异性探针法qPCR检测与定量分析的每一步设计流程。

环境DNA应用中物种特异性定量PCR检测方法的开发与验证

新的非侵入性方法正在被开发，用于检测和监测物种的存在，以协助渔业和野生动物保护管理工作。

经过良好优化的检测方法对于正确解读环境DNA数据至关重要。本方案描述了开发此类检测方法所需的设计和测试步骤。通常，环境DNA是一种用于检测特定物种或一组物种的非侵入性方法。与传统调查方法相比，该方法可能降低成本且具有更高的灵敏度。通过检测目标物种的DNA，该方法有助于保护工作和野生动物管理，从而可推断该物种在采样区域的存在。由于定量PCR具有极高的灵敏度，容易发生污染，因此需要设置阴性对照，以识别污染引入的步骤。eDNA 是一个充满专业术语和缩写词的领域。对于不熟悉分子生物学或定量 PCR 的研究人员而言，通过可视化演示有助于从概念构思到数据生成的实验设计规划。本次实验操作将由本实验室的生物学家 Dannise Ruiz Ramos 和学生实验助手 Trudi Frost 进行示范。首先，使用 NCBI 核苷酸数据库搜索并下载目标物种多个基因区域的序列。选择所有符合要求的序列，然后点击“发送至”。选择“完整记录”，目标为“文件”，下载格式选择 GenBank 或 FASTA，然后点击“创建文件”。这些序列现已保存至计算机中。对所有目标物种重复上述步骤。将每个基因区域的序列保存在单独的文件中，因为它们将被分别分析。为了分别比对每个基因区域的序列，请将下载的序列文件导入序列比对软件，例如 Geneious Prime 软件。为每个基因区域创建单独的文件夹，然后选择包含一个基因区域序列的文件夹中的所有序列。使用多序列比对工具（如 Geneious 或 MUSCLE）对选定的序列进行核苷酸序列比对。通过可视化比对后的序列数据，筛选出适合引物探针设计的候选区域。选择一个针对目标物种具有大量序列数据可用、在不同物种间高度分化且种内变异较低的区域。接下来，设计检测的引物和探针。使用 qPCR 检测设计软件设计五组 qPCR 检测体系。将选定的序列粘贴到“序列输入”框中。如果比对产生了空格，请从序列中删除这些空格。在“选择您的设计”选项中选择qPCR 2引物探针，然后下载推荐的引物探针组合。复制第一个检测的正向引物序列，并在先前创建的比对结果中搜索该引物序列。如果使用 Geneious Prime，可使用“Annotate Predict”工具将引物区域添加到比对结果中。对所有引物和探针组合均执行此操作。检查目标物种以及共存物种在比对中的这些区域是否存在变异。通过 NCBI 的 Primer-BLAST 对引物进行计算机模拟测试。将引物粘贴至“引物参数”下的“使用我自己的引物”框中。在引物对特异性检测参数选项中，选择 NR 作为数据库，并在“生物体”框中输入目标生物的分类目或科。确保所选引物不太可能扩增非靶标物种。通过生成标准曲线，在体外检测检测方法的扩增效率，并确定该曲线的效率和线性范围。使用含有目标序列的合成DNA标准品，至少检测六个十倍稀释梯度，每个反应中的拷贝数约为1至100万拷贝。利用qPCR软件将每个标准品的CQ值绘制在Y轴上，将每反应拷贝数的初始标准浓度的以10为底的对数绘制在X轴上。qPCR软件应自动进行线性回归分析。根据回归曲线的斜率计算扩增效率。通过扩增效率和R²值评估标准曲线是否存在偏差或性能不佳的情况，并进行目视检查。使用内部阳性对照检测实际田间样本是否存在PCR抑制，因为PCR抑制可能导致检测灵敏度降低和假阴性结果。确定每种检测方法的检出限和定量限。使用非靶标物种测试检测方法以验证其特异性，并确保检测方法在与内参质控（IPC）进行多重检测时表现良好。具有高灵敏度、特异性和扩增效率的检测方法可进入后续步骤。为了进行该检测方法的原位测试，需采集多个水样并进行qPCR处理。运行定量PCR检测，将eDNA浓度和检出频率与已知物种分布和丰度的位点差异进行比较。通过测序确认所有检出结果。下载并比对了Clinch河中所有蚌科（Unionidae）物种的可获得序列。在设计了多条引物后，将五组引物和探针添加至比对结果中进行可视化评估。这些引物和探针组合在计算机模拟（in silico）和体外实验（in vitro）中进行了测试。在实验室中，使用27种可获得物种的DNA提取物对所有检测方法进行了测试，以验证其特异性。其中一种检测方法仅成功扩增了目标物种。此处展示了一种具有高效扩增能力和良好R平方值的成功检测方法。所选检测方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）均为每反应5个拷贝。相比之下，标准曲线扩增效率较差的检测方法则被舍弃。在高质量的qPCR中，标准品系列稀释样本的扩增应在每个浓度十倍差异时，其循环定量值（Cq）间隔约3.3个循环，呈均匀分布。在较差的 qPCR 实验中，标准品在不同稀释度之间的循环定量值可能出现不均匀的变异。未知样品的内参扩增结果应与阴性模板对照的内参扩增结果进行比较。如果样品中不存在抑制物，则所有内参扩增在图中应呈现紧密聚集的趋势，其循环定量值应与无模板对照几乎相同。为进行现场检测，采样点包括溪流中贻贝群落的底部、近岸处贻贝群落的底部、群落下游100米处的溪流底部、群落下游500米处的溪流底部，以及群落下游500米处的近岸区域。环境DNA的定量PCR检测技术有助于监测入侵物种和濒危物种，同时能够在无需实际捕获个体生物的情况下，增进我们对物种检出在空间和时间上变化规律的理解。

development-testing-species-specific-quantitative-pcr-assays-for

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

开发和测试针对物种的定量PCR检测环境DNA应用

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基于管中芯片的数字PCR用于单核苷酸变异的定量分析

本论文描述了一种双重数字PCR检测方法，可用于同时定量Enterococcus...

一种用于同时定量水中粪肠球菌属（Enterococcus spp.）和人源粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法

本文提供了一种通过实时PCR定量沿海沉积物中细菌16S rRNA基因及其转录本的实验方案。该方法包括DNA和RNA的共提取、无DNA污染的RNA制备，以及通过反转录定量PCR（RT-q-PCR）对16S...

从沿海沉积物中同步提取DNA和RNA以及通过实时PCR定量16S rRNA基因与转录本

本方案提供了从DNA提取到数字液滴PCR（ddPCR）实验建立的完整步骤，包括在gRNA引导的Cas9切割及DNA修复后，对靶位点处非同源末端连接（NHEJ）事件进行鉴定与定量的分析方法。该方法的其他应用还包括多态性检测和基因编辑变异体验证等。...

利用数字液滴PCR检测基因改造按蚊群体中的插入缺失突变

本文介绍一种通过提高低分子量细胞外DNA比例来评估环境抗菌素耐药性（AMR）的简便技术。预先使用20%-30%聚乙二醇（PEG）和1.2 M...

从废水中增强提取低分子量DNA以全面评估抗菌素耐药性

可靠且准确的现场可部署DNA分析方法对许多行业至关重要。本文提供了两种用于野外环境微生物分析的方法：1）利用生物提取野外试剂盒从环境样本中分离微生物DNA；2）通过野外qPCR仪进行DNA分析。...

使用生物提取野外试剂盒和野外qPCR仪进行现场微生物DNA分析

本方案描述了一种从观鲸船只上采集鲸类环境DNA（eDNA）样本的标准化工作流程。该流程优先考虑研究人员和受过培训的公民科学家的可行性，同时其实际应用范围受限于环境条件、过滤时间、水体浊度以及船上的后勤条件。...

利用观鲸船只进行环境DNA采样以监测鲸类动物

本文介绍了一种用于确认杂草种群除草剂抗性的可靠且灵活的方法。该方案可通过少量调整，推断除草剂抗性水平，并适用于多种杂草物种和除草剂。...

不同杂草物种中抗除草剂性检测的可靠方案

了解如何设计和优化基于探针的定量PCR检测方法，用于从环境样本中检测目标物种的环境DNA。本方案涵盖序列比对、引物设计、体外效率测试及特异性验证等关键步骤，为准确解读eDNA数据提供可靠技术支持。

环境DNA应用中物种特异性定量PCR检测方法的开发与验证

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