开发和测试针对物种的定量PCR检测环境DNA应用
2020年11月5日
环境DNA检测需要严格的设计、测试、优化和验证，才能开始收集现场数据。在这里，我们提出一个协议，让用户完成设计特定物种、基于探针的 qPCR 检测和量化环境样本中目标物种 DNA 的每一步。
经过充分优化的分析对于正确解释环境 DNA 数据至关重要。该协议描述了开发这种测定的必要设计和测试步骤。一般来说，环境 DNA 是一种检测特定物种或物种组的非侵入性方法。
与传统的调查方法相比，它可以降低成本并且更加敏感。这种方法可以通过检测感兴趣物种的 DNA 来帮助保护和野生动物管理，从而有可能推断出该物种存在于采样区域。由于定量 PCR 的灵敏度高，很容易发生污染，需要阴性对照来识别引入污染的步骤。
eDNA 是一个充斥着行话和速记术语的领域。对于那些没有分子生物学或 qPCR 实践的人，视觉演示可以帮助规划从概念化到数据生成的实验设计。演示该程序的是我们实验室的生物学家 Dannise Ruiz Ramos 和学生实验室助理 Trudi Frost。
首先，使用 NCBI 的核苷酸数据库从多个基因区域搜索和下载目标物种的序列。选择符合规范的所有序列，然后选择 Send To。选择 Complete Record、File、Download Format 作为 GenBank 或 FASTA，然后选择 Create File。这些序列现在已保存到计算机中。
对所有感兴趣的物种重复这些步骤。将每个基因区域的序列保存在单独的文件中，因为它们将被单独分析。要分别比对来自每个基因区域的序列，请将下载的序列文件导入序列比对程序，例如 Geneious Prime 软件。
为每个基因区域创建单独的文件夹，然后选择包含来自一个基因区域的序列的文件夹中的所有序列。使用 Multiple Alignment 工具创建核苷酸比对，例如所选序列的 Geneious 或 MUSCLE。通过比对序列数据的可视化，为检测设计选择有前途的区域。
选择一个区域，该区域具有大量可用于目标物种的序列数据，物种间差异很大，并且在物种变异中显示较低。接下来，设计检测引物和探针。使用 qPCR 检测设计软件设计五组 qPCR 检测。
将所选序列粘贴到 Sequence Entry 框中。如果对齐方式创建了空格，请从序列中删除这些空格。在 Choose Your Design（选择您的设计）选项中选择 qPCR 2 引物探针，然后下载推荐的检测试剂盒。
从第一次测定的正向引物中复制序列，并在先前创建的比对中搜索该引物序列。如果使用 Geneious Prime，请使用 Annotate Predict 工具将引物区域添加到比对中。对所有引物和探针组合执行此作。
检查比对的这些区域在目标物种内以及共现物种内的变化。通过 NCBI 的 Primer-BLAST 进行计算机模拟测试引物。将引物粘贴到 Primer Parameters 下的 Use my own primer box（使用我自己的引物框）。
在 Primer Pair Specificity Checking Parameters 选项中，选择 NR 作为 Database，然后在 Organism 框中键入目标生物体的分类顺序或家族。确保所选引物不太可能扩增非靶标物种。通过创建标准曲线并确定曲线的效率和线性范围，在体外测试测定效率。
测试至少 6 个包含目标序列的合成 DNA 标准品的 10 倍稀释液，每个反应大约 1 到 100 万个拷贝。使用 qPCR 软件在 Y 轴上绘制每个标准品的 CQ 值，在 X 轴上绘制每个反应每个反应的对数以 10 为底数。qPCR 软件应自动运行线性回归。
根据回归的斜率计算效率。目视检查标准曲线是否存在偏差或性能不佳，通过效率和 R 平方值衡量。使用内部阳性对照检测实际现场样品的 PCR 抑制，这可能导致灵敏度降低和假阴性。
确定每种分析的检测限和定量限。使用非靶标物种测试检测试剂盒以验证特异性，并确保检测试剂盒在多重 IPC 检测中表现良好。具有良好的灵敏度、特异性和效率的检测可以继续进行下一步。
要进行检测的原位检测，请获取多个水样并对其进行处理以进行 qPCR。运行定量 PCR 检测，并将 eDNA 浓度和检测频率与已知的发生率和丰度位点差异进行比较。通过测序确认所有检测。
下载并对齐 Clinch 河中所有 Unionidae 物种的可用序列。在设计多次检测后，将五组引物和探针添加到比对中以进行视觉评估。引物和探针组在计算机和体外进行了测试。
在实验室中，使用 27 种可用物种的 DNA 提取对所有检测进行了测试，以验证特异性。一项检测仅成功扩增了目标物种。此处显示了具有良好效率和 R 平方值的成功测定。
所选分析的 LOD 和 LOQ 均为每个反应 5 个拷贝。相比之下，产生效率较差的标准曲线的分析被丢弃。在质量 qPCR 中，标准稀释液以均匀间隔的循环定量值进行扩增，浓度每差 10 倍约 3.3 个循环。
在较差的 qPCR 中，标准品在稀释之间可能表现出不均匀的循环定量值变化。应将未知样品的 IPC 扩增与阴性模板对照 IPC 的结果进行比较。如果样品中不存在抑制剂，则所有 IPC 扩增在图中都应紧密分组，循环定量值与无模板对照几乎相同。
对于测定的原位测试，定位地点包括溪流中贻贝床的底部、靠近岸边的肌肉床底部、溪流中床下游 100 米、溪流床下游 500 米和靠近海岸的床下游 500 米。环境 DNA 的定量 PCR 检测有助于监测入侵和濒危物种，并提高我们对物种检测空间和时间变化的理解，而无需物理捕获单个生物体。
概述
本协议概述了用于检测环境DNA（eDNA）的物种特异性、探针基qPCR检测方法的设计和优化。它强调了严格的检测方法开发对确保准确数据解释的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 环境DNA分析
- 定量PCR（qPCR）
- 保护生物学
背景
- 环境DNA是一种用于物种检测的非侵入性方法。
- 它可能比传统调查方法更敏感和更具成本效益。
- 污染是一个重大问题，需要严格的控制。
- 视觉辅助可以帮助非专家理解检测方法设计。
研究目的
- 提供一个全面的qPCR检测方法开发协议。
- 促进从环境样品中检测目标物种DNA。
- 改善保护和野生动物管理实践。
使用的方法
- 从NCBI的核苷酸数据库获取序列。
- 使用Geneious Prime等软件进行序列比对。
- 基于比对序列设计qPCR引物和探针。
- 通过计算机模拟和体外方法测试检测方法的效率和特异性。
主要结果
- 成功高效地扩增了目标物种DNA。
- 建立了检测方法的检出限和定量限。
- 验证了检测方法对非目标物种的特异性。
- 在现场样品中展示了有效的eDNA检测。
结论
- 设计良好的qPCR检测方法对准确的eDNA分析至关重要。
- 检测方法必须经过严格测试以确保效率和特异性。
- 本协议为该领域的研究人员提供了宝贵的资源。
常见问题
Executive Industry Relevance
Species-specific qPCR assay development enables precise, non-invasive detection of target organisms from environmental samples, supporting early-stage biological hypothesis testing in conservation and toxicology contexts. Rigorous assay validation provides quantitative, reproducible data that improves predictive confidence in species presence/absence calls, reducing false positives and negatives in field monitoring. This approach strengthens translational continuity from discovery to application by delivering scalable, standardized tools for biodiversity assessment and ecological risk evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of species-specific genetic markers to clarify target presence in complex environmental matrices.
- Operational Value: Supports functional validation of ecological targets through sensitive, quantitative detection of low-abundance DNA.
- Predictive Value: Establishes confidence in biomarker-like signals for species occupancy, informing go/no-go decisions in environmental monitoring programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated primer-probe sets with defined limits of detection and quantification for reliable eDNA quantification.
- Operational Value: Ensures assay specificity through empirical testing against non-target species, minimizing cross-reactivity in multiplexed formats.
- Scalability: Standard curve generation enables normalization across batches and sites, supporting longitudinal and comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects molecular detection outputs to ecological outcomes, enabling correlation of eDNA levels with species abundance and distribution.
- Disease-Relevant System: Applicable to pathogen or invasive species surveillance in aquatic systems, supporting early-warning monitoring frameworks.
- Mechanistic De-risking: Reduces uncertainty in environmental sampling by linking DNA signal to biological origin through sequencing confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay development workflow fits within early discovery to translational validation, providing a standardized path from sequence data to field-deployable detection tools for species-specific monitoring.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing regarding species presence, distribution, and ecological interactions through targeted genetic interrogation.
- Screening: Delivers ready-to-use, optimized qPCR assays with defined dynamic range and sensitivity for high-throughput environmental sample analysis.
- Analytics: Generates quantitative Cq data convertible to DNA copy numbers, enabling statistical comparison across conditions and time points.
- Translational Research: Supports extrapolation from lab validation to field application via IPC controls and sequencing verification of positives.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable assay development pipeline applicable to multiple species or gene targets across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic confidence in species detection by linking qPCR signal to specific genetic targets.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows with built-in contamination controls and inhibition monitoring.
- Strategic Value: Improves decision-making in environmental programs by reducing uncertainty in species detection data.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of sampling sites or conservation actions based on validated eDNA signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, sequence alignment, and qPCR optimization.
- Dependent on access to qPCR instrumentation, bioinformatics tools, and synthetic DNA standards.
- Necessitates standardized SOPs for sample processing, DNA extraction, and negative control inclusion.
- Must account for environmental inhibitors through IPC multiplexing in field sample analysis.
- Limited by availability of reference sequences and potential for primer-dimer or off-target amplification in complex backgrounds.
