实验性自身免疫性葡萄膜炎：一种眼内炎症的小鼠模型

该模型可用于研究涉及免疫介导的人类后葡萄膜炎发病机制的细胞机制。该技术的应用可延伸至人类葡萄膜炎的转化研究，用于监测新药疗效以及揭示化学物质诱导疾病进展的机制。使用该模型的主要优势在于疾病诱导的可靠性，以及采用非侵入性内镜技术，使我们能够监测疾病进展。

本文介绍了如何诱导疾病，并通过多种检测方法评估病理变化。制备IRBP 1-20肽段与完全弗氏佐剂（CFA）混合物时，首先将计算量的肽段溶于最小体积的100% DMSO中。待粉末完全溶解后，逐次加入少量PBS至达到根据待注射小鼠数量计算出的最终PBS体积，并轻轻振荡混匀。完成完全弗氏佐剂的配制后，将DMSO-PBS-肽段溶液以1:1的比例逐滴加入佐剂悬浮液中，同时频繁轻柔吹打，使溶液形成黏稠且分布均匀的乳剂。

为使溶液充气，使用设定为700微升的1000微升移液器反复吹打溶液，直至形成浓稠、乳脂状的乳剂。在注射肽悬浮液之前，将每只待注射的小鼠分别放入单独的笼子中，并使用配备23号针头的1毫升注射器，向每只动物腹腔注射含1%小鼠血清的RPMI 1640培养基100微升，其中包含1.5微克百日咳毒素。注射百日咳毒素溶液后，应抓住小鼠颈部皮肤使其呈抓握状，并捏起皮肤在颈背部形成帐篷样结构。

将针头刺入手指与拇指之间的皮肤隆起处，向皮下注射200 µL IRBP乳剂，注射后保持压力，并旋转针头头部以闭合皮肤，再撤出针头。在注射后第21天评估临床疾病评分时，需先确认经麻醉的肽段注射小鼠对瞳孔光反射无反应，然后固定小鼠颈背部皮肤以约束动物。每次注射后应立即在每只眼睛的角膜上局部应用1%托吡卡胺和2%去氧肾上腺素。

当瞳孔完全散大后，将小鼠放置于专用的显微镜载物台上。调整显微镜位置，以便充分接触视网膜。在整个成像过程中，根据需要调节目镜，以观察视盘和视网膜，并获取覆盖整个视网膜区域的图像，确保调整并涵盖周边所有角落。

为测量血管渗漏，需在小鼠颈部背部皮下注射100微升2%荧光素，然后调整小鼠位置，使视网膜位于实时图像中央。在荧光素注射后1.5分钟和7分钟时，将眼底镜设置为465至490纳米的蓝光激发滤光片，随后采集每只小鼠的图像。所有图像采集完成后，通过腹腔注射给予抗麻醉剂以促进恢复，并将小鼠置于配备预热垫的笼中，提供湿化饲料，并持续监测直至小鼠恢复意识。

对于图像的临床疾病评分，应根据视盘炎症、视网膜血管套袖样改变、视网膜组织浸润及结构损伤的严重程度进行临床评估。每个参数按1至5分进行评分。各项参数得分的总和代表整个眼球的临床疾病程度，每只眼最高得分为20分。

在完成研究的最终临床终点——眼底成像后，处死小鼠。进行组织学分析时，先分开眼睑以暴露整个眼球，然后将弯镊置于眼球后方，夹住眶内结缔组织和视神经，将眼球摘除。将摘除的眼球置于1至5毫升的4%戊二醛溶液中固定，时间不少于15分钟，随后转移至1至5毫升的10%甲醛溶液中，继续固定至少24小时。

根据标准方案进行组织学染色后，按照免疫细胞浸润程度和视网膜损伤程度，对组织样本按0至3分的等级进行评分。在疾病进展过程中，眼底镜检查所见的改变被归类为炎症性改变，包括视网膜组织、血管及视盘的炎症，以及视网膜结构损伤，同时结合组织学上免疫细胞浸润和结构损害的表现。这些临床和组织病理学改变可通过分级和评分来评估疾病进展程度，并用于评价治疗干预的效果。

血管渗漏也是该模型以及人类葡萄膜炎的病理特征之一。如本分析所示，可以使用荧光素来观察血管渗漏，作为该模型的另一项检测指标。研究人员必须确保乳剂正确配制，溶液之间无分层现象。

应充分混合，最终产物应质地均匀。该步骤可与其他给药方法联合使用，并可结合流式细胞术对浸润性视网膜免疫细胞群体进行表型分析。