Name: 实验性自身免疫性葡萄膜炎:眼内炎症小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 了解实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠模型的建立方法，通过IRBP 1-20 CFA乳剂诱导眼内炎症，并利用非侵入性内镜技术监测疾病进展。该模型为研究人类葡萄膜炎发病机制和评估新药疗效提供了可靠的转化研究工具。

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JG 获得了伦敦大学学院（UCL）影响力奖学金和 Rosetrees 信托基金的资助，用于支持 CB。VC 收到了来自 Akari Therapeutics 公司的研究合作资助。我们谨此感谢伦敦大学学院眼科研究所生物服务部门，特别是 Alison O'Hara 女士及其团队提供的技术支持。

所有实验均按照英国1986年《动物（科学程序）法案》以及机构动物福利与伦理审查委员会（AWERB）的指南进行。
1. C57BL/6J 小鼠的饲养
<ol>
	<li>在特定病原体阴性环境中饲养的实验小鼠，采用12小时光照-黑暗循环，自由摄食和饮水 随意.</li>
	<li>在成年雌性C57BL/6J小鼠上进行所有实验（优先选择雌性，因为葡萄膜炎患者中女性与男性发病率之比为1.4比1）。根据体重和年龄将6至8周龄的雌性C57BL/6J小鼠进行随机分组。饲养小鼠&#160;在独立通气笼具（IVC）中，每笼5-6只小鼠分组饲养。</li>
</ol>
2. C57BL/6小鼠的免疫
<ol>
	<li>IRBP1-20 - CFA 乳剂制备 
	注意：乳剂制备对于疾病发生率和实验可重复性至关重要；因此，必须在整个制备过程及不同实验之间尽可能保持一致性。在制备乳剂时，应预先计算所有试剂的损耗量。损耗量约为原体积的1.5倍（即额外准备50%的体积），具体取决于计划免疫的小鼠数量。请参考以下示例：若需免疫10只小鼠，则应按15只小鼠的量进行准备，即400 µg（每20 g小鼠所需肽量）× 15只 = 6 mg。每只小鼠免疫剂量为200 µL（共需3 mL）。最终体积由肽溶液与CFA按1:1体积比组成，因此需要1.5 mL肽溶液和1.5 mL CFA。
	<ol>
		<li>在超净工作台中使用无菌技术配制所有无菌溶液。</li>
		<li>称取所需量的人源IRBP1-20（LAQGAYRTAVDLESLASQLT）冻干肽（每20 g小鼠400 µg）。用100% DMSO溶解肽粉。将储备液以冻干形式保存于-20 °C。 
		注意：为确保粉末完全溶解，每一片都必须首先与DMSO接触，并无任何残留固体可见。分次加入少量PBS以达到最终体积。不要使用涡旋振荡器混匀，而应使用移液枪轻轻吹打。DMSO的最终浓度不得超过肽溶液总体积的1%。建议在底部呈锥形的20 mL塑料管中制备乳剂，以便DMSO更好地接触冻干粉末。</li>
		<li>将DMSO-PBS肽溶液按1:1（v/v）加入已添加1.5 mg/mL灭活Mycobacterium tuberculosis的CFA中，使终浓度为2.5 mg/mL。逐滴加入，并频繁轻柔吹打，形成黏稠且均匀分布的乳剂。</li>
		<li>使用1000 µL移液枪（设定为700 µL以减少损耗）反复吸取并吹打肽溶液与CFA，直至形成奶油状浓稠乳剂。该技术需反复上下吹打直至达到理想黏稠度。&#160;为获得最佳效果，确保抗原溶液与佐剂在注射前充分混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>百日咳毒素腹腔注射
	<ol>
		<li>将1.5 µg Bordetella pertussis毒素悬浮于100 µL RPMI 1640培养基中，培养基中添加1%小鼠血清11。</li>
		<li>使用无菌注射器和23G针头进行腹腔注射。 
		注意：为避免干扰注射部位，必须在注射抗原前给予百日咳毒素。</li>
		<li>将每只小鼠暂时转移至单独的笼子，接受一次100 µL的Bordetella pertussis毒素腹腔注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>IRBP乳剂皮下注射
	<ol>
		<li>随后，将IRBP乳剂进行皮下注射。此操作需两名符合健康与安全规范着装的动物操作人员共同完成。</li>
		<li>由一名训练有素的操作者将小鼠轻柔固定在笼盖上，抓握其颈部皮肤使其呈“抓颈”姿势，腹部朝下；另一名训练有素的操作者捏起背部颈部皮肤，形成帐篷状结构，以便将针头插入手指与拇指之间的皮下间隙。 
		警告：存在针刺伤风险。</li>
		<li>针头定位后，注入200 µL IRBP乳剂。拔针时，旋转针头以闭合皮肤，随后对注射部位施加压力，防止乳剂反流。 
		警告：乳剂不得接触小鼠皮肤或毛发，否则可能引起刺激，严重时可导致皮肤损伤。一旦发生，应立即用70%乙醇彻底擦拭污染区域，然后擦干。 
		&#8203;注意：若研究结束时需取引流淋巴结进行检测，则注射部位应有所不同。此时应在两侧腹股沟区皮下各注射100 µL。此方法可在引流腹股沟淋巴结中引发更强的免疫反应，便于在取材时切除。然而，若实验目的仅为建立实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型，则优选在颈部背部单次注射200 µL，以避免多点注射带来的不适。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 临床评估 - 小鼠眼底检查
注意：临床疾病评分应通过检眼镜和用于可视化观察的 Discover 软件进行活体明场成像的眼底检查来完成。
<ol>
	<li>在疾病发作期（第12-14天），使用氯胺酮（Ketamine，50 mg/mL）和多米特（Domitor，Medetomidine；1 mg/mL）的混合物对小鼠实施全身麻醉。将1份Domitor、1.5份Ketamine和2.5份无菌注射用水混合稀释，然后按每30 g体重注射100 µL的剂量进行腹腔注射。上述麻醉剂组合应使用1 mL无菌注射器和23G针头。</li>
	<li>随后，监测小鼠以确保其所有反射消失，并对刺激无反应。</li>
	<li>腹腔注射后立即在小鼠仍被提住颈背部皮肤时，将1%托吡卡胺（tropicamide）和2.5%去氧肾上腺素（phenylephrine）滴于每只眼睛表面，以实现瞳孔扩张。应确保两种扩瞳液完全覆盖角膜。瞳孔完全扩张可能需要数分钟时间。</li>
	<li>之后，在眼睛表面充分涂抹维他泪（viscotears）眼膏，并在整个成像过程中持续使用，以保持眼球充分润滑和湿润。</li>
	<li>同时，打开成像软件（例如Discover），并将眼底镜（例如Micron）设置为明场模式进行图像采集。为每只小鼠单独建立文件夹，并根据所拍摄的眼睛在图像上标注R（右眼）或L（左眼）。</li>
	<li>将小鼠固定在专用的活体成像平台上，并调整显微镜位置，以便充分观察视网膜。</li>
	<li>为准确反映疾病状态，需拍摄整个视网膜区域的图像，包括视盘及周边所有区域。为此，需在成像过程中不断调整目镜。在整个成像过程中，必须始终保持眼球充分润滑；应定期补充眼膏以确保润滑效果。</li>
	<li>此时请参考下文第4节，进行荧光素血管造影操作。</li>
	<li>完成所有成像后，将麻醉拮抗剂（抗镇静剂Antisedan，5 mg/mL）用注射用水稀释，并按0.1 mg/kg剂量进行腹腔注射。将小鼠放回笼中，置于预热垫上，并提供湿化的饲料直至其恢复。完全恢复的标志是小鼠能够全身活动并在笼内稳定行走，通常需要数小时。</li>
	<li>在预定的实验终点（例如第21-23天），重复步骤4.1-4.5，再次拍摄整个视网膜区域的照片，覆盖视盘及周边所有区域，以准确记录疾病进展情况。</li>
</ol>
4. 荧光素眼底血管造影
<ol>
	<li>在动物麻醉状态下，为每只小鼠颈背部皮下注射2%荧光素，以检测血管渗漏，并调整位置使视网膜位于实时图像中央。</li>
	<li>将眼底镜的激发光滤光片设置为465-490 nm的蓝光，激发后采集的荧光素发射光波长范围为520-530 nm。</li>
	<li>荧光素注射后1.5分钟拍摄每只眼的视网膜照片，并在7分钟时再次拍摄。 
	&#8203;注意：上述时间点至关重要，若无法完成两次成像，至少应获取单眼图像。</li>
</ol>
5. 临床疾病评分
<ol>
	<li>根据以下标准的严重程度进行临床评估：视盘炎症、视网膜血管套袖样改变、视网膜组织浸润及结构损伤。</li>
	<li>对每个参数按0到5的评分标准打分，总分代表整个眼睛的临床疾病程度，每只眼睛最高得分为20分。表1可作为评分标准的参考依据。</li>
</ol>
6. 组织学与组织学评分
<ol>
	<li>安乐死后&#160;通过颈椎脱位处死小鼠，用器械撑开眼睑以充分暴露眼球，摘除眼睛。</li>
	<li>接下来，将弯钳置于眼球后方，以夹住眶内结缔组织和视神经。注意避免挤压眼球。</li>
	<li>固定时，将眼球置于4%戊二醛中至少15分钟，以最小化视网膜脱离，随后转移至10%甲醛中固定至少24小时。1-2 mL固定液足以覆盖两只眼球。</li>
	<li>按照标准方案进行石蜡包埋、切片机切片和染色。建议任何染色类型的切片厚度为 3-4 µm。</li>
	<li>使用苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色的标准方案对眼睛进行组织学检查&amp;#38;E) 染色。</li>
	<li>根据EAU评分标准，按照视网膜和脉络膜中免疫细胞浸润程度、视网膜层状结构破坏情况、肉芽肿形成程度以及视网膜脱离范围，对视网膜损伤情况进行0-4分的评分，具体标准如前所述（Agarwal 2013）并总结于 表211.</li>
</ol>

<ol><li>Lyu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMP778%2C+a+selective+inhibitor+of+RORgammat%2C+suppresses+experimental+autoimmune+uveitis+development%2C+but+affects+both+Th17+and+Th1+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations.</a> The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).</li>
<li>Klaska, I. P., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Mouse models of autoimmune uveitis.</a> Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).</li>
<li>Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+Bromodomain+Proteins+Suppresses+Retinal+Inflammatory+Disease+and+Downregulates+Retinal+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells.</a> The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).</li>
<li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+and+clinical+study+of+FK506+in+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis.</a> Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).</li>
<li>Nguyen, Q. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+Sirolimus+for+the+Treatment+of+Noninfectious+Uveitis%3A+Evolution+through+Preclinical+and+Clinical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies.</a> Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).</li>
<li>Leal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-TNF+Drugs+for+Chronic+Uveitis+in+Adults-A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104(2019).</li>
<li>Chen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinct+IFN-%3F%2B+IL-17A%2B+Th+cells+in+experimental+autoimmune+uveitis%3A+T-cell+heterogeneity%2C+migration%2C+and+steroid+response%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response.</a> European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+grading+system+for+retinal+inflammation+in+the+chronic+model+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+using+digital+fundus+images%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images.</a> Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).</li>
<li>Copland, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+time-course+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+using+topical+endoscopic+fundal+imaging+with+histologic+and+cellular+infiltrate+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).</li>
<li>Dick, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doyne+lecture+2016%3A+intraocular+health+and+the+many+faces+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation.</a> Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).</li>
<li>Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+experimental+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rodent models of experimental autoimmune uveitis.</a> Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).</li>
<li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+look+at+autoimmunity+and+inflammation+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clininical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A look at autoimmunity and inflammation in the eye.</a> Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).</li>
<li>Caspi, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+experimental+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of experimental autoimmune uveitis.</a> Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+chronic+experimental+autoimmune+uveitis+%28EAU%29+of+the+C57BL%2F6+mouse+induced+by+adoptive+transfer+of+IRBP1-20-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells.</a> Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).</li>
<li>Horai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota-Dependent+Activation+of+an+Autoreactive+T+Cell+Receptor+Provokes+Autoimmunity+in+an+Immunologically+Privileged+Site%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site.</a> Immunity. 43, 343-353 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+induced+vs.+spontaneous+models+of+autoimmune+uveitis+targeting+the+interphotoreceptor+retinoid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein.</a> PLoS One. 8, 72161(2013).</li>
<li>Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+coherence+tomography+and+electroretinography+to+evaluate+retinal+pathology+in+a+mouse+model+of+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis.</a> PLoS One. 8, 63904(2013).</li>
<li>Harry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+autoimmune+retinal+disease+by+lovastatin+does+not+require+Th2+cytokine+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction.</a> Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).</li>
</ol>

作者声明本研究无任何利益冲突。

实验动物模型是研究疾病发病机制和新型治疗方案临床前测试的必要工具。在本方案中，我们介绍了一种诱导、监测和评分实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的方法，该模型为眼内炎症性葡萄膜炎的实验模型。当所有操作均严格按照本方案所述步骤进行时，该EAU模型的疾病发生率超过95%，并可形成慢性单相型EAU。为达到此发生率，我们特别强调抗原制备及乳剂注射的重要性，上述步骤已在前文详细说明。动物EAU的主要特征包括视网膜和/或脉络膜炎症、视网膜血管炎、光感受器破坏以及视力丧失，这些均代表了人类后部葡萄膜炎诸多关键的临床病理特征。12对葡萄膜炎中基本细胞与分子机制的许多认识均源于本文所述的实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型。EAU可在小鼠中诱导产生13 和大鼠11 通过用淋巴细胞可识别的视网膜抗原进行主动免疫。这些视网膜抗原具有多种形式；小鼠使用IRBP，大鼠使用视网膜可溶性抗原（S-Ag）。在C57BL/6J遗传背景下诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU），可产生更慢性的疾病形式，病理高峰出现在免疫后三周。相比...

本方案将演示如何通过皮下注射含有视网膜抗原的乳化佐剂，单次注射诱导C57BL/6J小鼠产生实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）。文中将详细说明通过检眼镜成像和组织学检查监测及评估疾病进展的方法，并列出了相应的测量参数。此外，还将讨论荧光素血管造影技术，该技术用于观察视网膜血管结构及通透性。
该实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型在临床病理特征以及驱动疾病发生的基本细胞和分子机制方面，重现了人类非感染性后葡萄膜炎的核心特征。EAU由自身反应性CD4+T淋巴细胞中的Th1和/或Th17亚群介导，这一点已在过继转移实验及IFNγ缺陷小鼠模型中得到证实1。目前关于这些细胞在葡萄膜炎中潜在作用的许多认识，均来源于对EAU模型的研究2，在该模型的视网膜组织中可检测到Th1和Th17细胞的存在3。EAU常被用作临床前模型，以评估新型治疗方法在缓解疾病方面的有效性。在EAU模型中成功调控疾病的治疗策略，部分已在临床应用中显示出疗效，并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。例如，一些免疫调节药物，包括靶向T细胞的环孢素、FK-506和雷帕霉素4,5,6。近年来，该模型也被用于探索靶向新通路的干预措施，以研究其作用机制及对疾病结局的影响。这些干预包括通过溴结构域额外末端（BET）蛋白和P-TEFb抑制剂调控转录调控过程3。此外，一些较传统的策略，如VLA-4抑制剂，近期也被证明可通过调节效应性CD4+T细胞显著抑制EAU7。另外，使用TMP778（一种RORγt反向激动剂）靶向Th17细胞也被发现可显著抑制EAU8。此外，该模型还为研究视网膜中慢性自身免疫性炎症及其相关机制（如淋巴细胞致敏过程）提供了重要机会。
EAU 前临床研究的主要检测指标是通过视网膜眼底成像进行临床评估，较少情况下则通过光学相干断层扫描（OCT）评估视网膜完整性。在实验终点，进一步开展视网膜组织病理学评价，并通过流式细胞术对视网膜细胞进行免疫表型分析。眼底检查是一种易于使用的活体成像系统，可对整个视网膜进行快速且可重复的临床评估。对于免疫组织化学评估，相关技术基于制备视网膜切片，使我们能够研究组织结构中的炎症程度和结构损伤9。本方案将详细说明所有所用技术的评估标准和常规评分系统。通过眼底成像记录的损伤程度通常与组织学变化密切相关。这种对疾病严重程度进行监测和评估的双重方法可提供更高的敏感性和更可靠的测量结果。
EAU 是一种成熟且常用的临床前模型，用于免疫介导性眼病的研究与测试。该模型具有高度可靠性和可重复性，疾病发生率超过&#62;95%，能够产生全面的数据，可用于验证或否定针对眼内炎症性疾病的新疗法。眼内炎症性疾病是全球工作年龄人群失明的主要原因之一10。

<table><tbody><tr><td>抗sedan</td><td>美国硕腾公司</td><td></td><td>用于唤醒</td></tr><tr><td>完全弗氏佐剂&amp;rsquo;佐剂；完全弗氏佐剂</td><td>英国 Sigma</td><td>F5881</td><td>用于免疫&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>多米托</td><td>Orion Pharma，芬兰</td><td></td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>荧光素</td><td>英国 Sigma</td><td>F2456</td><td>用于血管造影</td></tr><tr><td>IRBP&lt;sub&gt;1-20&lt;/sub&gt;</td><td>Chamberidge 肽，英国</td><td></td><td>肽；抗原&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Orion Pharma，芬兰</td><td></td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research，美国</td><td></td><td>用于检眼镜检查</td></tr><tr><td>小鼠血清</td><td>英国 Sigma</td><td>M5905</td><td>用于免疫&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>英国 Sigma</td><td>344289</td><td>用于免疫&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>英国 Sigma</td><td>P2980</td><td>用于免疫&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盐酸去氧肾上腺素 2.5%&amp;nbsp;</td><td>Bausch &amp;安普&隆布英国公司&amp;nbsp;</td><td>PHEN25</td><td>用于扩张&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1% 托吡卡胺</td><td>SANDOZ</td><td></td><td>用于扩瞳&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>维赛泪</td><td>WELDRICKS 药房，英国</td><td>2082642</td><td>用于眼部润滑</td></tr></tbody></table>

实验性自身免疫性葡萄膜炎：一种眼内炎症的小鼠模型

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）由免疫细胞对自身抗原的反应所驱动。这一非感染性眼内炎症疾病模型的多种特征可重现人类后葡萄膜炎的临床表型。EAU已被可靠地用于研究新型抗炎治疗药物的疗效、作用机制，并进一步探究眼内疾病进展背后的病理机制。本文提供了在C57BL/6J小鼠中诱导EAU的详细方案——这是最广泛使用的、对该疾病具有易感性的模式生物。将通过检眼镜检查、组织学分析和荧光素血管造影术来演示对疾病严重程度和进展的临床评估。诱导过程包括在皮下&#160;注射一种乳剂，该乳剂含有来自眼内蛋白视网膜间感光细胞类视黄醇结合蛋白（也称为视黄醇结合蛋白3）的肽段（IRBP1-20）、完全弗氏佐剂（CFA），并添加灭活的Mycobacterium tuberculosis。在颈背部注射该黏稠乳剂后，再进行一次腹腔注射百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）毒素。在症状出现时（第12–14天），于全身麻醉下采集眼底图像，通过临床检查评估疾病进展。这些数据可与后期时间点及疾病高峰期（第20–22天）的数据直接比较，并进行差异分析。同时，本方案允许研究者利用荧光素血管造影术评估血管通透性和损伤的潜在差异。EAU也可在其他小鼠品系中诱导，包括野生型或基因修饰小鼠，并可与新型疗法联合使用，为研究药物疗效和/或疾病机制提供了灵活性。

在本实验方案中，我们描述了一种通过使用源自IRBP的致葡萄膜炎视网膜肽免疫小鼠，以诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型的逐步操作方法。文中涵盖了广泛使用且易于获取的疾病评估方法，尽管这些方法并非唯一，可根据需要补充或部分替换为其他成像技术。在C57BL/6J小鼠中，EAU的最早体征可在免疫后两周被检测到，并在三周内达到疾病高峰，如图1所示。在疾病进展过程中，眼底镜检查所见的改变被分为炎症性改变，包括视网膜组织、血管及视盘的炎症，以及视网膜结构损伤（图2），此外还包括基于免疫细胞浸润和结构损伤的组织病理学改变。这些临床及组织病理学改变可在免疫后持续检测至85天，通过分级与评分用于评估疾病进展。为避免定性视觉评分中的无意偏倚，图像应由多位专家独立评估，且评分者需对处理分组设盲。
本文展示了临床评分系统和组织学评分系统（表1 和 表2）如何指导科研人员量化实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的严重程...

在本报告中，我们介绍了一种可使研究人员建立小鼠眼内葡萄膜炎模型的实验方案。该模型通常被称为实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU），是一种成熟的模型，能够模拟人类疾病的多个方面。本文将描述如何通过多种检测指标来诱导并监测疾病进展。

实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）由免疫细胞对自身抗原的应答所驱动。该非感染性、眼内……

该模型可用于研究涉及免疫介导的人类后葡萄膜炎发病机制的细胞机制。该技术的应用可延伸至人类葡萄膜炎的转化研究，用于监测新药疗效以及揭示化学物质诱导疾病进展的机制。使用该模型的主要优势在于疾病诱导的可靠性，以及采用非侵入性内镜技术，使我们能够监测疾病进展。本文介绍了如何诱导疾病，并通过多种检测方法评估病理变化。制备IRBP 1-20肽段与完全弗氏佐剂（CFA）混合物时，首先将计算量的肽段溶于最小体积的100% DMSO中。待粉末完全溶解后，逐次加入少量PBS至达到根据待注射小鼠数量计算出的最终PBS体积，并轻轻振荡混匀。完成完全弗氏佐剂的配制后，将DMSO-PBS-肽段溶液以1:1的比例逐滴加入佐剂悬浮液中，同时频繁轻柔吹打，使溶液形成黏稠且分布均匀的乳剂。为使溶液充气，使用设定为700微升的1000微升移液器反复吹打溶液，直至形成浓稠、乳脂状的乳剂。在注射肽悬浮液之前，将每只待注射的小鼠分别放入单独的笼子中，并使用配备23号针头的1毫升注射器，向每只动物腹腔注射含1%小鼠血清的RPMI 1640培养基100微升，其中包含1.5微克百日咳毒素。注射百日咳毒素溶液后，应抓住小鼠颈部皮肤使其呈抓握状，并捏起皮肤在颈背部形成帐篷样结构。将针头刺入手指与拇指之间的皮肤隆起处，向皮下注射200 µL IRBP乳剂，注射后保持压力，并旋转针头头部以闭合皮肤，再撤出针头。在注射后第21天评估临床疾病评分时，需先确认经麻醉的肽段注射小鼠对瞳孔光反射无反应，然后固定小鼠颈背部皮肤以约束动物。每次注射后应立即在每只眼睛的角膜上局部应用1%托吡卡胺和2%去氧肾上腺素。当瞳孔完全散大后，将小鼠放置于专用的显微镜载物台上。调整显微镜位置，以便充分接触视网膜。在整个成像过程中，根据需要调节目镜，以观察视盘和视网膜，并获取覆盖整个视网膜区域的图像，确保调整并涵盖周边所有角落。为测量血管渗漏，需在小鼠颈部背部皮下注射100微升2%荧光素，然后调整小鼠位置，使视网膜位于实时图像中央。在荧光素注射后1.5分钟和7分钟时，将眼底镜设置为465至490纳米的蓝光激发滤光片，随后采集每只小鼠的图像。所有图像采集完成后，通过腹腔注射给予抗麻醉剂以促进恢复，并将小鼠置于配备预热垫的笼中，提供湿化饲料，并持续监测直至小鼠恢复意识。对于图像的临床疾病评分，应根据视盘炎症、视网膜血管套袖样改变、视网膜组织浸润及结构损伤的严重程度进行临床评估。每个参数按1至5分进行评分。各项参数得分的总和代表整个眼球的临床疾病程度，每只眼最高得分为20分。在完成研究的最终临床终点——眼底成像后，处死小鼠。进行组织学分析时，先分开眼睑以暴露整个眼球，然后将弯镊置于眼球后方，夹住眶内结缔组织和视神经，将眼球摘除。将摘除的眼球置于1至5毫升的4%戊二醛溶液中固定，时间不少于15分钟，随后转移至1至5毫升的10%甲醛溶液中，继续固定至少24小时。根据标准方案进行组织学染色后，按照免疫细胞浸润程度和视网膜损伤程度，对组织样本按0至3分的等级进行评分。在疾病进展过程中，眼底镜检查所见的改变被归类为炎症性改变，包括视网膜组织、血管及视盘的炎症，以及视网膜结构损伤，同时结合组织学上免疫细胞浸润和结构损害的表现。这些临床和组织病理学改变可通过分级和评分来评估疾病进展程度，并用于评价治疗干预的效果。血管渗漏也是该模型以及人类葡萄膜炎的病理特征之一。如本分析所示，可以使用荧光素来观察血管渗漏，作为该模型的另一项检测指标。研究人员必须确保乳剂正确配制，溶液之间无分层现象。应充分混合，最终产物应质地均匀。该步骤可与其他给药方法联合使用，并可结合流式细胞术对浸润性视网膜免疫细胞群体进行表型分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

实验性自身免疫性葡萄膜炎:眼内炎症小鼠模型

本视频介绍了一种通过将细菌悬液注射到小鼠眼内玻璃体腔中，建立模拟细菌性眼内炎的小鼠模型的方法。细菌性眼内炎是一种由细菌侵入眼内玻璃体腔引起的内部感染。该小鼠模型有助于研究疾病的发病机制并评估潜在的治疗方法。...

细菌性眼内炎小鼠模型：通过玻璃体内注射细菌悬液建立小鼠细菌性眼内炎的方法

关键词：细菌性眼内炎，小鼠模型，玻璃体内注射，细菌悬液，眼感染，实验性眼病

本视频展示了一种在小鼠模型中诱导眼表炎症和睑板腺功能障碍的方法。通过使用免疫原刺激小鼠免疫系统，并在后期用相同免疫原再次刺激，可促进眼表炎症的发生，导致中性粒细胞产生的aggNETs堵塞睑板腺分泌物，进而引发干眼症。...

一种在小鼠模型中诱导眼表炎症的方法

本视频展示了在麻醉小鼠中诱导全身性炎症的过程。注射分枝杆菌抗原-佐剂储库可触发细胞因子释放并引发局部炎症。淋巴管开放，使免疫细胞进入淋巴结并激活T细胞，T细胞释放促炎性细胞因子，导致广泛的炎症反应。...

皮下注射细菌抗原以在小鼠模型中诱导全身性炎症

本视频展示了一种用于研究感染后葡萄膜炎的致敏型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）小鼠模型的建立方法。通过在先前用相同免疫原致敏的小鼠中进行玻璃体内注射热灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

一种用于研究感染后葡萄膜炎的经致敏的分枝杆菌性葡萄膜炎小鼠模型

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本视频展示了一种用于检测和量化感染后葡萄膜炎小鼠模型中眼部炎症的体内成像技术。该技术称为光学相干断层扫描（OCT），可生成眼部的高分辨率横断面图像，用于评估疾病进展。...

用于评估小鼠模型中葡萄膜炎的光学相干断层扫描成像

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

采用激光光凝法对小鼠眼睛的房水引流系统进行处理，以诱导慢性高眼压。激光处理后，眼内压（IOP）可升高并持续数月。通过视觉运动反应测试监测实验动物的视力和对比敏感度下降情况。...

一种表征视觉缺陷的激光诱导小鼠慢性眼压升高模型

本报告描述了一种通过免疫诱导Lewis大鼠产生慢性实验性自身免疫性干眼症的方法：首先使用大鼠泪腺提取物、卵清蛋白和完全弗氏佐剂的乳剂进行免疫，六周后再次向结膜穹隆下和泪腺内注射泪腺提取物和卵清蛋白。...

一种眼组织中效应记忆T细胞增加的慢性自身免疫性干眼大鼠模型

本文介绍了一种用于细菌性眼内炎小鼠模型的玻璃体内注射方法及后续细菌定量技术。该方案可进一步扩展用于检测宿主免疫反应以及细菌和宿主基因的表达。...

小鼠细菌性眼内炎模型中的玻璃体内注射及感染参数定量分析

本方案概述了在小鼠中诱导 预激活型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）的步骤。该方法详细说明了在小鼠模型系统中产生可靠且显著的眼部炎症的操作流程。通过使用本方案，我们从单只动物中获得了葡萄膜炎眼及未发炎的对侧眼，可用于后续的免疫学、转录组学和蛋白质组学分析。...

作为感染后葡萄膜炎模型的启动型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）

了解实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠模型的建立方法，通过IRBP 1-20 CFA乳剂诱导眼内炎症，并利用非侵入性内镜技术监测疾病进展。该模型为研究人类葡萄膜炎发病机制和评估新药疗效提供了可靠的转化研究工具。

实验性自身免疫性葡萄膜炎：一种眼内炎症的小鼠模型

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