Name: 人类心脏肌细胞模型中体温过低预科后心肌保护体外评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解利用人类心肌细胞模型评估不同体温过低处理对心肌保护效果的体外实验方法。该研究通过量化细胞死亡水平，为探索低温心脏保护的分子机制及开发辅助疗法奠定基础。

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本工作部分由国家自然科学基金（81970265，81900281，81700288）、中国博士后科学基金（2019M651904）以及国家重点研发计划（2016YFC1101001，2017YFC1308105）资助。

有关商用试剂和仪器的信息列在材料表中。
AC16 人源心肌细胞系由成人左心室心肌组织的原代细胞与SV40转化的人成纤维细胞融合而成17，其中成纤维细胞购自BLUEFBIO公司（中国上海）。该细胞系具有心肌细胞典型的多种生物化学和形态学特征。此外，该细胞系被广泛用于体外评估心肌损伤和心肌功能18,19。
1. 细胞培养
注意：基础培养基由无血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、10% 胎牛血清（FBS）、1% 心肌细胞生长补充剂和 1% 青霉素/链霉素溶液组成。将培养基储存在 4 °C，使用前预热至 37 °C。
<ol>
	<li>从液氮中取出冷冻保存的人心肌细胞（HCM），并在37 °C水浴中解冻。</li>
	<li>轻轻摇动冻存管（&#60;1分钟），置于37 °C水浴中，直至管内仅剩一小块冰。</li>
	<li>将冻存管转移至无菌超净工作台中，用浸有70%酒精的棉球擦拭管外壁。</li>
	<li>将4 mL预热的完全培养基逐滴加入含有解冻细胞的离心管中。</li>
	<li>将细胞悬液在200 × g 条件下离心10分钟。离心后弃去上清液，并将沉淀重悬于5 mL完全培养基中。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润化培养箱中培养。 
	注意：在收获细胞用于实验前，需让细胞生长至约60–70%融合度。</li>
</ol>
2. 建立氧糖剥夺（OGD）模型
注意：在实验周期开始前2小时，将生长培养基更换为无血清培养基，并将细胞置于含5% CO2的湿润培养箱中，于37 °C继续孵育2小时。
<ol>
	<li>从6孔板中吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞3次。</li>
	<li>每孔加入2 mL新鲜的无糖DMEM培养基。</li>
	<li>将细胞置于三气培养箱中，在95% N2、5% CO2 和0.1% O2 的气体环境、37 °C条件下恒温培养1、2、4、8、12或16小时。</li>
	<li>缺氧处理后，从6孔板中吸除培养基，并用PBS（pH 7.4）洗涤细胞3次。</li>
	<li>每孔加入2 mL完全DMEM培养基。</li>
	<li>将细胞在37 °C、含95%空气和5% CO2 的湿润培养箱中继续培养。</li>
</ol>
3. 时间-温度程序
注意：心脏手术期间采用标准的时温方案，如先前其他研究者所述20,21。按照以下方案处理HCMs（图1）：时间点1（T1）表示诱导结束，时间点2（T2）表示维持结束，时间点3（T3）表示复温结束。分析在持续常温条件（37 °C）下维持的对照细胞。温度条件使用三气培养箱创建，该设备可实现精确的温度调控。
<ol>
	<li>实验前两小时，吸去6孔板中的培养基，每孔加入2 mL新鲜的无血清DMEM培养基。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中重新孵育2小时。</li>
	<li>2小时后，吸去6孔板中的培养基，用PBS（pH 7.4）洗涤细胞三次。</li>
	<li>每孔加入2 mL新鲜的无血清DMEM培养基。</li>
	<li>将细胞重新放入三气培养箱中孵育。 
	注意：更换培养基以去除未贴壁的细胞和碎片。</li>
	<li>立即通过将培养皿转移至三气培养箱来改变温度。</li>
	<li>降温1&#8201;小时后，迅速吸去6孔板中的培养基，每孔加入2 mL新鲜的无糖DMEM培养基。</li>
	<li>在37 °C、含95% N2、5% CO2和0.1% O2的气体环境中，于三气培养箱中培养细胞12小时，以建立缺氧条件。</li>
	<li>按照下述方法设置温度。 
	注意：本方案起始为10小时的低温处理，随后进行2小时的复温至37 °C，再维持24小时的常温（37 °C）。在每个时间点，取出三个培养皿用于分析。</li>
	<li>低温处理结束后，吸去6孔板中的培养基，并用PBS（pH 7.4）洗涤三次。</li>
	<li>每孔加入2 mL完全DMEM培养基。</li>
	<li>将细胞维持在37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润培养箱中培养。</li>
</ol>
4. CCK-8 细胞活力检测
<ol>
	<li>使用前将 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液和 PBS 预热至 37 °C。</li>
	<li>吸除培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞，然后沿孔壁加入 0.5 mL 0.25% 胰蛋白酶。在 37 °C 培养至几乎所有人心肌细胞（HCMs）脱落（约 1 分钟）。</li>
	<li>向孔中加入 1 mL 完全 DMEM 培养基以中和胰蛋白酶。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，于 500 × g 离心 3 分钟，沉淀 HCMs。吸除上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>将细胞悬液以每孔 100 µL（5000 个细胞/孔）分装至 96 孔板中。在湿润培养箱中（37 °C）预培养 24 小时。</li>
	<li>使用 96 孔板中培养的细胞建立不同的处理组。</li>
	<li>将 96 孔板在培养箱中孵育适当时间（16 小时）。</li>
	<li>向每孔加入 10 µL CCK-8 溶液。</li>
	<li>将 96 孔板在培养箱中孵育 1 小时。</li>
	<li>使用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度。 
	注意：加样时避免产生气泡，以免干扰 OD 读数。</li>
</ol>
5. 凋亡分析的流式细胞术
<ol>
	<li>按照步骤 4.2-4.4 进行胰蛋白酶消化和离心操作。 
	注意：使用不含 EDTA 的胰蛋白酶收集细胞。为评估细胞凋亡，需同时收集悬浮细胞和贴壁细胞。</li>
	<li>以 1000 × g 离心 5&#8201;分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。用移液器将 100 µL 经台盼蓝处理的细胞悬液转移至血细胞计数板。使用手动计数器，计数一组 16 个方格中的活细胞（未染色细胞），然后用 PBS 制备浓度为 1×107 个细胞/mL 的细胞悬液。</li>
	<li>取 200 µL 细胞悬液（含 5 × 105 -1 × 106 个细胞）。</li>
	<li>以 1000 × g 离心 5&#8201;分钟，将沉淀重悬于 Annexin V-FITC 结合缓冲液中。</li>
	<li>加入 5 µL Annexin V-FITC 对细胞进行染色。</li>
	<li>向细胞悬液中加入 10 µL 碘化丙啶（propidium iodide）。</li>
	<li>轻轻混匀细胞，并在室温避光条件下孵育 20 分钟。 
	注意：孵育期间应将细胞重悬 2-3 次，以提高染色效果。</li>
	<li>启动流式细胞仪，并确保软件正常运行。</li>
	<li>在流式细胞术软件中打开两个点图窗口。</li>
	<li>在 X 轴选择前向散射光（FSC），在 Y 轴选择侧向散射光（SSC），分别根据细胞大小和颗粒度排除细胞碎片和/或细胞团块。</li>
	<li>选择 PE（590 nm）检测通道和 FITC（530 nm）检测通道，用于测量细胞的荧光强度。</li>
	<li>将未染色的空白样本（HCMs）试管置于流式细胞仪上。</li>
	<li>点击 Record 以采集空白样本管悬液中的颗粒，并在第一个点图中圈选细胞群，用于进一步分析。</li>
	<li>将单染样本试管置于进样臂上。点击 Record 以采集悬液中的颗粒，并在第一个点图中圈选细胞群，用于进一步分析。</li>
	<li>采集其他样本管中的 HCMs，并通过调节荧光通道电压优化检测参数。 
	注意：实验中使用未染色和单染样本作为补偿对照。</li>
	<li>显示各样本管的统计结果，并计算各样本的细胞凋亡率。</li>
</ol>
6. 线粒体去极化评估
<ol>
	<li>按照步骤 4.2–4.4 进行胰蛋白酶消化和离心。</li>
	<li>将细胞重悬于 500 µL 完全培养基中，然后调整细胞密度至 1 × 105 - 6 × 106 个细胞</li>
	<li>向每根试管中加入 0.5 mL JC-1 工作液。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C 细胞培养箱中孵育 20 分钟。 
	注意：孵育期间，将 1 mL 5× JC-1 染色缓冲液加入 4 mL 蒸馏水中，以配制 JC-1 染色缓冲液。</li>
	<li>孵育结束后，在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 mL JC-1 染色缓冲液中。</li>
	<li>重复步骤 6.5 至 6.6 三次。</li>
	<li>将人原代心肌细胞（HCMs）重悬于 1.5 mL 离心管中的 1 mL 冰冷染色缓冲液中，并在 30 分钟内用于分析。</li>
	<li>选择 PE（590 nm）检测通道和 FITC（530 nm）检测通道，以检测细胞中 JC-1 染料的荧光强度。 
	注意：按照步骤 5.10–5.17 设置流式细胞仪。</li>
</ol>
7. 活性氧检测实验
<ol>
	<li>按照步骤 4.2-4.4 进行胰蛋白酶消化和离心。</li>
	<li>在培养基中用 10 µM DCFDA 对细胞进行染色，并将细胞密度调整至 1 × 106 - 1 × 107 个细胞。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>每 3-5 分钟轻轻吹打细胞上下混合。</li>
	<li>孵育结束后，用无血清细胞培养基洗涤细胞三次。</li>
	<li>按照步骤 5.10-5.17 在流式细胞仪上分析细胞。 
	注意：DCF 在 488 nm 处被激发，发射光强度在 530 nm 处测定。</li>
</ol>
8. Caspase 3/Caspase 8 活性测定
<ol>
	<li>按照步骤 4.2–4.4 进行胰蛋白酶消化。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 600 × g 离心 5 分钟收集细胞。</li>
	<li>每 2 × 106 个细胞加入 100 µL 裂解缓冲液。</li>
	<li>将细胞在冰上裂解 15 分钟。</li>
	<li>冰浴孵育 15 分钟后，在 4 °C 条件下以 1.6 × 104 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至预冷的离心管中备用。 
	注意：样品中的蛋白浓度应至少为 1–3 mg/mL。</li>
	<li>取出 Ac-DEVD-pNA（2 mM），置于冰浴中备用。</li>
	<li>准确向酶标板中加入 40 µL 缓冲液，再加入 80 µL 样品，最后加入 10 µL Ac-DEVD-pNA（2 mM）。</li>
	<li>在 37 °C 孵育 120 分钟。</li>
	<li>按照仪器制造商的说明，使用微孔板读板仪测定 A405 值。 
	注意：caspase-3/caspase-8 产生的 pNA 所引起的吸光度，通过样品 A405 值减去空白对照的 A405 值计算得出。</li>
</ol>

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<li>Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinued+stimulation+of+cardiomyocytes+provides+protection+against+hypothermia-rewarming-induced+disruption+of+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22EXPERIMENTAL+PHYSIOLOGY%22%5BJournal%5D)">Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling.</a> EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).</li>
<li>Yarbrough, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibition+attenuates+contractile+dysfunction+following+cardioplegic+arrest+and+rewarming+in+the+setting+of+left+ventricular+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cardiovascular+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).</li>
<li>Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermia-induced+spatially+discordant+action+potential+duration+alternans+and+arrhythmogenesis+in+nonhibernating+versus+hibernating+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22AMERICAN+JOURNAL+OF+PHYSIOLOGY-HEART+AND+CIRCULATORY+PHYSIOLOGY%22%5BJournal%5D)">Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals.</a> AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).</li>
<li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+Hypothermia+Modifies+Coronary+Hemodynamics+and+Endothelium-Dependent+Vasodilation+in+a+Porcine+Model+of+Temperature+Management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035(2020).</li>
<li>Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ECG-biomarker+for+cardiac+arrest+during+hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Trauma+Resuscitation+%26+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation & Emergency Medicine. 28 (1), 27(2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

完整动物的复杂性，包括不同类型细胞之间的相互作用，常常阻碍对缺血/再灌注（I/R）损伤特定组分的深入研究。因此，有必要建立一种能够准确反映体内缺血后分子变化的体外细胞模型。关于氧糖剥夺（OGD）模型的研究已有先前报道13,22，并已建立多种精密的方法23,24。OGD模型的制备过程包括两个关键步骤：缺氧和缺糖。在本研究中，通过在无糖培养基中培养细胞实现缺糖，通过氮气置换实现缺氧，这是目前制备OGD模型的一种成熟方法25,26。然而，根据细胞类型的不同，必须考虑两个因素：1）细胞接种密度和2）OGD暴露时间。贴壁细胞数量越多，对OGD应激的抵抗力越强，因此OGD前的接种时间至关重要。HCMs（2 × 105 个细胞/孔）在6孔板中接种后培养30–34小时，此时细胞融合度...

缺血/再灌注所致的心肌功能障碍是心脏手术后患者常见的临床情况1,2。在非搏动性低流量灌注及完全循环停止期间，各类心肌细胞仍会发生损伤。特别是心肌细胞对缺血性损伤的敏感性高于其他细胞群体。目前，治疗性低温（TH）可在接受心脏手术的患者中对预期的缺血性损伤提供显著保护作用3,4。TH定义为机体核心温度在14–34 °C之间，但关于心脏手术期间低温的定义尚无共识5,6,7。2013年，一个国际专家小组提出了一种标准化报告系统，用于对全身性低温循环停止的不同温度范围进行分类8。根据脑电图和脑代谢研究，他们将低温分为四个等级：深低温（≤ 14 °C）、深中度低温（14.1–20 °C）、中度低温（20.1–28 °C）和轻度低温（28.1–34 °C）。该专家共识提供了清晰且统一的分类标准，使不同研究之间更具可比性，并能提供更具临床相关性的结果。TH的保护作用基于其降低细胞代谢活性的能力，从而进一步限制高能磷酸化合物的消耗速率9,10。然而，TH在心肌保护中的作用仍存在争议，其效应可能因低温程度不同而具有多种表现。
心肌缺血/再灌注（I/R）损伤众所周知会伴随细胞凋亡增加11。近期研究发现，在心脏直视手术期间，程序性心肌细胞死亡增加，并可能与坏死同时发生，从而导致死亡心肌细胞数量上升12。因此，在临床实践中，减少心肌细胞凋亡是一种有效的治疗策略。在小鼠心房HL-1心肌细胞模型中，治疗性低温被证明可减少再灌注期间线粒体释放细胞色素c和凋亡诱导因子（AIF）13。然而，温度对凋亡调控的作用仍存在争议，其效应似乎取决于低温的程度。Cooper及其同事观察到，与常温体外循环对照组相比，深低温停循环猪的心肌组织凋亡率升高14。此外，一些研究结果提示，深低温可能激活凋亡通路，而较温和的低温则似乎抑制该通路12,15,16。出现这一结果的原因可能与缺血性损伤的混杂效应以及对温度影响心肌组织机制的认识不足有关。因此，应准确定义促进或抑制凋亡的温度界限。
为了更好地理解低温疗效的相关机制，并为其在人类中的应用提供合理的依据，必须确定一种与体内条件相似的培养环境，能够在可重复的条件下产生类似于临床状况所观察到的损伤。实现这一目标的关键步骤是建立诱导心肌细胞凋亡的最佳条件。因此，在本研究中，我们探讨了细胞培养中氧糖剥夺实验的方法学细节，该模型是一种简便的体外缺血-再灌注模型。此外，我们评估了不同缺氧-缺血时间对心肌细胞凋亡的影响，并验证了关于不同温度条件对体外细胞凋亡影响的假设。

<table><tbody><tr><td>Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒</td><td>Bio-Technology,中国</td><td>C1062M</td><td></td></tr><tr><td>心肌细胞生长添加剂</td><td>Sciencell,美国</td><td>6252</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 3活性检测试剂盒</td><td>Bio-Technology,中国</td><td>C1115</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 8活性检测试剂盒</td><td>Bio-Technology,中国</td><td>C1151</td><td></td></tr><tr><td>无葡萄糖DMEM培养基</td><td>Gibco,美国</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Gibco,美国</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco,美国</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>CytoFLEX,美国</td><td>B49007AF</td><td></td></tr><tr><td>人源心肌细胞</td><td>BLUEFBIO,中国</td><td>BFN60808678</td><td></td></tr><tr><td>JC-1线粒体膜电位检测试剂盒</td><td>Bio-Technology,中国</td><td>C2006</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>Gibco,美国</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>活性氧检测试剂盒</td><td>Bio-Technology,中国</td><td>S0033S</td><td></td></tr><tr><td>三气培养箱</td><td>Memmert,德国</td><td>ICO50</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Gibco,美国</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

体外评估低温预处理对人心肌细胞模型的心肌保护作用

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

缺血/再灌注所致的心肌功能障碍是心脏手术后患者常见的临床情况。特别是心肌细胞对缺血性损伤的敏感性高于其他细胞群体。目前，低温可在一定程度上保护心肌，以应对预期的缺血性损伤。然而，关于低温诱导的复杂分子变化的研究仍然有限。因此，有必要建立一种类似于体内条件的培养环境，能够以可重复的方式诱导出与临床状况相似的心肌损伤。为了在体外模拟缺血样条件，本模型中的细胞接受了氧糖剥夺（OGD）处理。此外，我们采用了心脏手术期间常用的标准时间-温度方案。同时，我们提出了一种简单而全面的定量分析心肌损伤的方法。通过流式细胞术和ELISA试剂盒检测了细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达水平。在本模型中，我们验证了不同温度条件对心肌细胞体外凋亡影响的假设。该模型的可靠性依赖于严格的温度控制、可调控的实验流程以及稳定的实验结果。此外，该模型可用于研究低温心脏保护作用的分子机制，这可能对开发与低温联合使用的辅助治疗策略具有重要意义。

通过CCK-8法检测OGD暴露对HCM细胞活力的影响。与对照组相比，细胞活力随时间呈显著的时间依赖性下降（图2A）。再灌注后不同时间点HCM细胞的凋亡率呈现特定趋势：从0至16 h，凋亡率逐渐升高，并在16 h时间点达到峰值（图2B）。由于12 h的OGD处理使细胞活性降低约50%，因此在后续实验中采用12 h OGD诱导细胞损伤。
随后我们考察了温度对细胞凋亡过程的影响。与OGD组相比，接受低温处理的三个组中活细胞比例更高（图3B）。此外，深度低温组细胞的存活率最高（>92%），是OGD组的2.1倍。同时，流式细胞术结果表明，低温处理可防止OGD条件下HCMs的细胞凋亡（图3A&amp;3C）。由于线粒体功能障碍与细胞凋亡相关，我们进一步获取了数据以评估线粒体功能紊乱情况。采用DCFH-DA法测定细胞内ROS水...

不同深度低温对心肌保护作用的差异尚未得到充分评估。本研究旨在利用基于人源心肌细胞的模型，定量分析不同低温处理后细胞死亡水平，为后续深入的分子机制研究奠定基础。

由缺血/再灌注引起的心肌功能障碍是心脏手术后患者常见的临床情况。特别是……

本研究的目的是在基于人源心肌细胞的模型中，量化不同低温处理后的细胞死亡水平。该模型可用于研究低温心脏保护作用的分子机制，这可能对开发与低温治疗联合使用的辅助疗法具有重要意义。培养HCM细胞时，将液氮中保存的冷冻细胞在37摄氏度水浴中解冻，并在加湿的培养箱中、95%空气和5%二氧化碳的气体环境下进行培养。当细胞融合度达到60%至70%时，吸去六孔板中的培养基，用PBS轻轻洗涤细胞三次。每孔加入2毫升新鲜无糖培养基，在37摄氏度、含95%氮气、5%二氧化碳和0.1%氧气的三气培养箱中恒温培养细胞。对于时间-温度实验方案，吸去六孔板中的培养基，每孔加入2毫升新鲜无糖培养基。将细胞置于三气培养箱中培养12小时以建立缺氧环境。设置温度程序：首先进行10小时低温处理，随后进行2小时复温，最后维持24小时常温。在每个时间点取出三个培养皿用于分析。低温处理后，从六孔板中吸除培养基，用 PBS 洗涤三次。每孔加入 2 毫升新鲜培养基，然后将细胞置于含 95% 空气和 5% 二氧化碳的湿润化培养箱中，于 37 摄氏度下继续培养。每孔加入 8 微升 CCK-8 溶液，将培养板放入培养箱中孵育 1 小时。孵育结束后，使用酶标仪在450纳米处测定吸光度。进行细胞凋亡分析时，加入5微升Annexin V-FITC对细胞进行染色，然后向细胞悬液中加入10微升碘化丙啶。轻轻混匀细胞，在室温避光条件下孵育20分钟。在流式细胞仪软件中，打开两个散点图窗口，分别选择前向散射光作为x轴，侧向散射光作为y轴。选择PE检测通道和FITC通道。单击“记录”以从空白样品管中的悬液收集颗粒，然后在第一个点图中圈选细胞群以进行进一步分析。接着，将单染样品放置在试管支撑臂上。单击“记录”以从悬液中收集颗粒，并圈选细胞群以进行进一步分析。进行线粒体评估时，向每管含有胰蛋白酶消化细胞的样品中加入 0.5 毫升 JC-1 工作液，在 37°C 培养箱中孵育 20 分钟。孵育结束后，在 4°C 条件下以 600 × g 离心 3 分钟，将细胞沉淀重悬于 1.5 毫升离心管中的 1 毫升预冷染色缓冲液中。通过选择 PE 和 FITC 检测通道，测定 JC-1 的荧光强度。对于活性氧检测，使用10微摩尔的DCFDA对细胞和培养基进行染色，并将细胞密度调整至约一百万到一千万个细胞。在37摄氏度下孵育这些细胞30分钟，然后在流式细胞仪上进行分析。向酶标板中加入40微升缓冲液，然后加入80微升样品。然后加入10 µL的2 mmol/L乙酰化DEVD对硝基苯胺，将培养板在37 °C下孵育120分钟。按照制造商说明，使用酶标仪测定A405值。时间-温度实验方案中的温度条件由三气培养箱建立并维持，该培养箱可在三个时间点实现精确的温度调控。采用CCK-8法检测氧糖剥夺（OGD）对HCM细胞活力的影响。与对照组相比，细胞活力随时间延长而显

in-vitro-assessment-myocardial-protection-following-hypothermia

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

人类心脏肌细胞模型中体温过低预科后心肌保护体外评估

手术创伤会诱发炎症反应。已知细胞因子和内源性配体可调节缺血再灌注后的心肌梗死面积。本文介绍一种改良的闭胸小鼠缺血再灌注模型，通过悬挂重物的方式减少开胸手术的影响。...

一种小鼠闭胸式心肌缺血与再灌注模型

本方案旨在评估啮齿类动物在缺血性心脏停搏后的心肌顿抑情况。...

与心脏停搏相关的鼠类离体心脏心肌顿抑模型

离体大鼠心脏是研究缺血再灌注损伤的经典模型。本文描述了通过以下步骤从大鼠体内获取跳动心脏的过程 原位...

离体灌注大鼠心脏中缺血-再灌注损伤的诱导与评估

本文介绍一种在大鼠中建立无需输血或使用正性肌力药物的简易复苏体外循环模型的实验方案。该模型可用于研究体外循环后长期的多器官后遗症。...

一种无需输血和正性肌力药物的大鼠复苏体外循环模型

本方案展示了一种简单且灵活的方法，用于评估新的预处理药物或策略，以提高心脏在循环死亡后捐献的可行性。...

循环死亡后心脏捐献的临床前模型

本文展示了一种用于研究小鼠心肌冷冻损伤后心脏重塑的模型。...

小鼠心肌梗死的冷冻损伤模型研究

本方案旨在逐步描述利用去膜心肌细胞提取和评估心脏功能的技术。该方法可利用从小块冷冻活检样本中获取的材料，对肌丝功能进行测量和急性调节，这些样本可从不同心脏部位获取，适用于从小鼠到人类的多种物种。...

利用去膜心肌细胞进行心脏功能的体外评估

本文介绍了一种从振动切片机切割的心肌薄片中分离人和动物心室心肌细胞的实验方案。仅需少量组织（&lt;50...

从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

利用干细胞衍生的心肌细胞生物工程构建的三维心脏组织已成为研究健康与疾病状态下人类心肌的有前景模型 体外...

设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

本文介绍了一种在冷保存后利用离体心脏灌注系统可靠定量供体心脏左右心室功能的实验方案 离体 灌注系统...

评估 离体 Langendorff 模型中的小鼠双心室功能

了解利用人类心肌细胞模型评估不同体温过低处理对心肌保护效果的体外实验方法。该研究通过量化细胞死亡水平，为探索低温心脏保护的分子机制及开发辅助疗法奠定基础。

体外评估低温预处理对人心肌细胞模型的心肌保护作用

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