人类心脏肌细胞模型中体温过低预科后心肌保护体外评估
October 27th, 2020
不同程度的体温过低对心肌保护的明显影响尚未得到彻底评估。本研究的目标是量化人类心肌细胞基模型中不同体温过低治疗后细胞死亡水平，为未来深入的分子研究奠定基础。
本研究的目的是量化在基于人心肌细胞的模型中进行不同低温治疗后的细胞死亡水平。该模型可用于研究低温心脏保护的分子机制，这可能对开发用于低温的补充疗法具有重要意义。为了培养 HCM 细胞，在 37 摄氏度的水浴中从液氮中解冻冻冻保存的细胞，并将它们保存在加湿器培养箱中，在含有 95% 空气和 5% 二氧化碳的气氛中。
一旦细胞达到 60% 至 70% 汇合度，从 6 孔板中吸出培养基，并用 PBS 轻轻洗涤细胞 3 次。向每个孔中加入 2 毫升新鲜无糖培养基，并在 37 摄氏度的 95% 氮气、5% 二氧化碳和 0.1% 氧气的混合物下，在三气体培养箱中恒温培养细胞。对于时间-温度方案，从 6 孔板中吸出培养基，并加入 2 毫升新鲜的无糖培养基。
将细胞在三气培养箱中培养 12 小时以建立缺氧。设置温度程序，从 10 小时的低温处理开始，然后是 2 小时的复温阶段和 24 小时的正常体温。在每个时间点取出三个培养皿进行分析。
低温处理后，从六孔板中吸出培养基，并用 PBS 洗涤 3 次。向每个孔中加入 2 毫升新鲜培养基，然后将细胞保持在 37 摄氏度，在含 95% 空气和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中。向板的每个孔中加入 8 μL CCK-8 溶液，并将板在培养箱中放置 1 小时。
孵育后，使用酶标仪测量 450 纳米处的吸光度。对于细胞凋亡分析，添加 5 微升 Annexin V-FITC 对细胞进行染色。然后在细胞悬液中加入 10 微升碘化丙啶。
轻轻混合细胞，并在室温下避光孵育 20 分钟。在流式细胞术软件中，打开两个点图窗口，并在 x 轴上选择前向散射光，在 y 轴上选择侧向散射光。选择 PE 检测通道和 FITC。
单击"记录"从空白样品管中的悬浮液中收集颗粒，然后在第一个点图中对细胞群进行门控以进行进一步分析。接下来，将单染色样品放在试管支撑臂上。单击"记录"从悬浮液中收集颗粒，并对细胞群进行门控以进行进一步分析。
对于线粒体评估，向含有胰蛋白酶化细胞的每根试管中加入 0.5 mL JC-1 工作溶液，并在 37 摄氏度的培养箱中孵育 20 分钟。孵育后，将细胞在 4 摄氏度下以 600 倍 g 离心 3 分钟，然后将 HCM 重悬于 1 毫升冰冷染色缓冲液中，溶于 1.5 毫升离心管中。通过选择 PE 和 FITC 检测通道来测量 JC-1 的荧光强度。
对于活性氧测定，用 10 微摩尔 DCFDA 对细胞和培养基进行染色，并将细胞密度调节至约 1 至 1000 万个细胞。将这些细胞在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，然后在流式细胞仪上对其进行分析。向酶标记板中加入 40 μL 缓冲溶液，然后加入 80 μL 样品。
然后加入 10 微升 2 毫摩尔乙酰 DEVDp-硝基苯胺，并在 37 摄氏度下孵育板 120 分钟。按照制造商的说明在酶标仪上测量 A405 值。时间-温度方案中的温度条件是使用三气培养箱创建和维护的，该培养箱允许在三个时间点进行精确的温度调节。
使用 CCK-8 测定确定氧和葡萄糖剥夺 （OGD） 对 HCMs 活力的影响。与对照组相比，细胞活力以时间依赖性方式显著降低。再灌注后 HCMs 的细胞凋亡率在 0 至 16 h 之间逐渐增加，然后在 16 h 时间点达到最大速率。
与 OGD 组相比，低温治疗的 3 组活细胞百分比较高。此外，深度低温组的细胞活力最高，比 OGD 组高 2.1 倍。流式细胞术结果证实，在 OGD 条件下，体温过低阻止了 HCMs 的凋亡。
低温治疗还降低了 HCMs 的细胞内 ROS 水平。JC-1 染色检测线粒体膜电位。OGD 处理后，红绿荧光比值降低。
体温过低显着抑制了这种 OGD 诱导的作用。此外，在低温处理的细胞中观察到 caspase-8 和 caspase-3 的降低。该模型的可靠性取决于严格的温度控制、可控的实验程序和稳定的实验结果。
该方法可用于进一步探讨低温治疗对细胞凋亡的具体机制，并研究低温心脏保护的分子机制。对低温辅助治疗的发展具有重要意义。
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概述
本研究通过人类心肌细胞模型，探讨不同程度的低温对心肌保护的影响。它旨在量化不同低温处理导致的细胞死亡水平，为未来的分子研究奠定基础。
关键研究组成部分
科学领域
- 心血管研究
- 细胞死亡机制
- 低温心脏保护
背景
- 低温可以在心脏事件期间提供心肌保护。
- 不同低温水平的具体影响尚未得到充分探索。
- 了解这些影响对于开发补充疗法至关重要。
- 人类心肌细胞模型对于研究这些机制至关重要。
研究目的
- 量化对各种低温处理的细胞死亡反应。
- 建立未来分子研究的模型。
- 探索低温在心脏保护中的潜在治疗应用。
所用方法
- 在37摄氏度的水浴中解冻冷冻保存的人类心肌细胞。
- 在具有特定气体浓度的加湿培养箱中维持细胞。
- 用PBS洗涤细胞并在无糖培养基中培养。
- 实施时间-温度协议以评估细胞死亡水平。
主要结果
- 不同的低温处理导致不同程度的细胞死亡。
- 人类心肌细胞模型有效地展示了这些效应。
- 研究结果表明对于开发低温相关疗法具有重要意义。
- 根据结果，进一步的分子研究是必要的。
结论
- 该研究提供了关于低温对心脏细胞保护作用的见解。
- 它为未来关于低温心脏保护的研究奠定了基础。
- 了解细胞死亡机制可以增强治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative in vitro assessment of hypothermia-preconditioning in human cardiac myocytes enables mechanistic de-risking of cardioprotective strategies at the earliest discovery stage. This model provides predictive confidence for evaluating apoptosis and molecular injury markers under clinically relevant ischemia/reperfusion conditions. Such reproducible systems support portfolio triage and translational continuity for myocardial protection programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of hypothermia-induced molecular pathways in human cardiomyocytes.
- Supports functional target validation by quantifying apoptosis and injury markers.
- Facilitates predictive confidence in cardioprotective hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, temperature-controlled in vitro system for compound evaluation.
- Delivers quantitative outputs via flow cytometry, ELISA, and viability assays.
- Standardizes assessment of apoptosis and mitochondrial function for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro injury models with clinical ischemia/reperfusion scenarios.
- Enables mechanistic studies of hypothermic cardioprotection relevant to translational biomarker development.
- Supports risk-adjusted advancement of cardioprotective strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery and preclinical validation by enabling hypothesis-driven testing of myocardial protection strategies under controlled ischemic conditions.
- Discovery Biology: Quantifies cell death, apoptosis, and molecular injury in response to hypothermia and OGD.
- Screening: Provides standardized, reproducible readouts for viability and apoptosis across temperature protocols.
- Analytics: Integrates flow cytometry, ELISA, and ROS assays for robust comparative analysis.
- Translational Research: Models clinically relevant injury and protection mechanisms for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for cardioprotective compound and pathway evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in myocardial protection research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable in vitro workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for cardioprotective assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of early-stage cardioprotective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human cardiac cell culture and hypoxia modeling.
- Demands precise temperature and gas control instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of apoptosis and viability assays.
- Adaptable to other ischemia-relevant cell models with protocol optimization.
- Dependent on strict procedural control for reproducibility and data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:34
Establishment of an Oxygen-Glucose Deprivation Model and Time-Temperature Protocol
2:30
CCK-8 Viability Assay and Analysis of Flow Cytometry for Apoptosis
3:59
Mitochondrial Depolarization Assessment and Reactive Oxygen Species Assay
5:11
Measurement of Caspase 3/ Caspase 8 Activity
5:51
Results: Evaluation of Cell Viability, Apoptosis, Mitochondrial Function, and Caspase Activity
7:40
Conclusion
