Name: 使用CRISPR/Cas9的人类B细胞基因组工程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学习使用CRISPR/Cas9技术对原代人B细胞进行基因敲除和敲入的高效方法。该方案通过电穿孔递送基因编辑工具，为研究B细胞生物学和开发细胞治疗提供可靠平台。

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本工作由儿童癌症研究基金（CCRF）和美国国立卫生研究院（NIH）R01 AI146009 项目资助，资助对象为 B.S.M.。

健康供者的白细胞单采样本取自当地血库。本研究所描述的所有实验均经明尼苏达大学机构审查委员会（IRB）判定为豁免研究，并经机构生物安全委员会（IBC）批准。
注意：所有实验均按照血液传播病原体的通用预防措施进行，采用无菌/无菌技术以及适当的生物安全二级设备。
1. 准备用于B细胞扩增培养基的补充剂
<ol>
	<li>将CpG寡核苷酸重悬至浓度为1 mg/mL。</li>
	<li>将CD40配体（CD40L）重悬至浓度为100 μg/mL。</li>
	<li>将重组人IL-10（rhIL-10）重悬至浓度为50 μg/mL。</li>
	<li>将重组人IL-15（rhIL-15）重悬至浓度为10 μg/mL。 
	注意：每种添加剂应分装成小份，于-20 °C至-80 °C保存，可保存长达6个月。</li>
</ol>
2. 准备基础培养基
<ol>
	<li>将B细胞基础培养基与5%（v/v）的体外免疫细胞扩增培养基添加剂（例如CTS Immune Cell SR）以及1%（v/v）的青霉素和链霉素混合。</li>
	<li>使用0.22 µm滤器接头将基础培养基过滤除菌至无菌瓶中。</li>
	<li>将基础培养基在4 °C保存，最长可保存1个月。</li>
</ol>
3. 准备B细胞扩增培养基
<ol>
	<li>将所需量的基础培养基转移至无菌容器中，用于以 5 × 105 个细胞/mL 的密度培养 B 细胞。</li>
	<li>在基础培养基中添加 1 μg/mL CpG、100 ng/mL CD40L、50 ng/mL rhIL-10 和 10 ng/mL rhIL-15。</li>
	<li>使用 0.22 µm 滤器过滤 B 细胞扩增培养基。</li>
	<li>将 B 细胞扩增培养基置于组织培养孵箱中，在 37 °C、5% CO2 及湿度条件下平衡至少 30 分钟后使用。 
	注意：B 细胞扩增培养基需现配现用，仅限当日使用。不可配制后用于多日。该培养基配方可促进记忆 B 细胞及活化的人原代 B 细胞的增殖。</li>
</ol>
4. 人B细胞的纯化与扩增
注意：根据制造商的说明，将99–100%的异丙醇加入温度可控的冷冻容器中，并在开始步骤4.1之前将冷冻容器预冷至4 °C。
<ol>
	<li>从白细胞单采术样本中分离外周血单个核细胞
	<ol>
		<li>将一份白细胞单采术样本（约8–10 mL）转移至无菌的50 mL锥形管中。</li>
		<li>用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）定容至35 mL。</li>
		<li>将35 mL的白细胞分离样本小心地叠加在15 mL密度梯度介质上。</li>
		<li>500 × g 离心 g 25分钟内不刹车离心，小心移除血浆层，避免扰动白膜层（PBMC层），从界面处收集PBMCs，并转移至新的无菌50 mL离心管中。</li>
		<li>用1×PBS将PBMCs调整至50 mL。</li>
		<li>500 × g 离心 g 5 分钟，无需刹车。移除上清液时注意不要扰动 PBMC 沉淀，该沉淀可能呈红色。</li>
		<li>加入7 mL氯化铵-氯化钾裂解缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀3次，室温孵育3分钟。</li>
		<li>用1×PBS定容至50 mL。</li>
		<li>400 × g 离心 g 用低阻力刹车离心5分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。沉淀物应呈粉红色或白色。 
		注意：为了持续培养新分离的B细胞，在开始B细胞分离之前（步骤4.2），请预先准备好B细胞扩增培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用人原代B细胞阴性分离试剂盒从外周血单个核细胞中分离B细胞
	<ol>
		<li>用分离缓冲液重悬PBMCs，使其浓度为5 × 107 cells/mL 
		注意：如果PBMCs总数少于5 × 107 细胞，缩小分离缓冲液体积以维持 5 × 107 细胞/mL。细胞悬液的最小和最大体积分别为0.25 mL和8 mL。</li>
		<li>转移最多 8 mL（5 × 107 细胞/mL）加入无菌聚丙烯圆底带盖离心管中。</li>
		<li>向 PBMCs 中加入 50 μL/mL 的 Cocktail Enhancer。</li>
		<li>向PBMCs中加入50 μL/mL分离混合液，盖紧管盖，倒置混匀2–3次。</li>
		<li>室温孵育 5 分钟；在第 4 分钟时th 孵育1分钟后，涡旋振荡磁珠至少30秒。</li>
		<li>每1 mL PBMCs中加入50 μL磁性微珠，盖紧管盖，倒置混匀2–3次。</li>
		<li>用分离缓冲液定容至10 mL，轻轻吹打混匀2–3次。</li>
		<li>将试管置于磁力架上，室温孵育3分钟。</li>
		<li>将磁铁和离心管一同握住，一次性同时翻转磁铁和离心管，将细胞悬液倒入新管中。弃去旧管。</li>
		<li>重复步骤4.2.8（将孵育时间缩短至2分钟），并将B细胞悬液倒入洁净的锥形管中。</li>
		<li>富集的B细胞已准备好使用。若需立即使用细胞，请继续进行第4.3节（人B细胞扩增）。可通过流式细胞术检测分离B细胞的纯度（可选步骤）。若需在使用前冻存细胞，请继续进行步骤4.2.12。</li>
		<li>为冻存B细胞，于400 × g离心 g 5 分钟后，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
		<li>用冻存液重悬细胞，密度为 107 细胞/mL，每支冻存管分装1 mL。</li>
		<li>将冻存管放入预冷的冻存盒中，于 -80 °C 保存过夜；随后将冻存管转移至液氮罐中；冻存细胞可保存长达1年。 
		注：分离获得的B细胞预期产量为总PBMC的2%–8%，细胞活力为95%–99%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人B细胞扩增 
	注意：若使用 freshly isolated 的 B 细胞，可跳过步骤 4.3.1–4.3.5。计数细胞后，将所需数量的细胞转移至无菌锥形管中，随后继续进行步骤 4.3.6。
	<ol>
		<li>预先将胎牛血清（FBS）在水浴中预热，然后再解冻B细胞。准备20 mL B细胞扩增培养基，转移至T25培养瓶中，并在组织培养孵箱（37 °C，5% CO₂）中预平衡培养基。2，使用前至少在湿度条件下平衡15分钟。</li>
		<li>将B细胞置于37 °C水浴中解冻。等待期间，将2 mL预热的FBS转移至无菌的15 mL锥形管中。</li>
		<li>B细胞完全解冻后，立即将1 mL预热的胎牛血清逐滴加入样品中，室温孵育1分钟。</li>
		<li>轻轻吹打以重悬样品，并将全部体积逐滴转移至含有2 mL预热胎牛血清（FBS）的锥形管中。</li>
		<li>用无菌1×PBS将体积调至15 mL，盖紧管盖，轻轻倒置试管2–3次。</li>
		<li>400 × g 离心 g 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，用1 mL预平衡的B细胞扩增培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。总细胞数应约为107 细胞</li>
		<li>将细胞转移至含有20 mL预平衡B细胞扩增培养基的培养瓶中。细胞的终浓度应约为5 x 105 cells/mL</li>
		<li>将培养瓶垂直放入组织培养箱中孵育。</li>
		<li>每2天完全更换一次扩增培养基，将B细胞的全部培养液体转移至无菌锥形管中，并重复步骤4.3.6–4.3.9。 
		注意：T25 培养瓶可容纳 10–20 mL 培养基；T75 培养瓶可容纳 20–60 mL 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 原代人B细胞的基因工程操作
<ol>
	<li>在扩增/活化后 48 ± 2 小时对 B 细胞进行基因编辑，以获得最佳效果。准备 B 细胞扩增培养基，将 1 mL 培养基分装至 48 孔组织培养板中，并在使用前于组织培养箱中预平衡至少 15 分钟。 
	注意：设计目标基因的 CRISPR/Cas9 sgRNA 时，请遵循以下步骤。 
	- 使用在线工具设计 sgRNA11。 
	- 在编码所有蛋白异构体共有的外显子上设计 sgRNA。 
	- 从信誉良好的公司订购化学修饰的 sgRNA。 
	- sgRNA 通常以冻干形式提供；用无菌无 DNase/RNase 的 Tris-EDTA (TE) 缓冲液重悬 sgRNA，配制成 1 μg/μL 的浓度。</li>
	<li>每转染反应中，将 1 μL（1 μg/μL）化学修饰的 sgRNA 与 1.5 μL（1 μg/μL）化学修饰的 Streptococcus pyogenes Cas9 (S.p. Cas9) 核酸酶混合，制备 CRISPR/Cas9 转染底物。作为对照，使用 1 μL TE 缓冲液代替 sgRNA。 
	注意：若在基因敲除实验中使用 CD19 sgRNA，请参见 图 2 的结果。若在基因敲入实验中使用 AAVS1 sgRNA，请参见 图 5 的结果。
	<ul>
		<li>所有组分均需置于冰上。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>轻轻混匀，并将每反应 2.5 μL 的 CRISPR/Cas9 转染底物转移至 0.2 mL 8 孔排管中的一个管内；置于室温备用。</li>
	<li>开启核转染仪（电穿孔仪），并按 表 1 所示准备转染试剂。 
	注意：如有需要，可将所有试剂置于冰上暂停操作；恢复实验时再从冰上取出。当使用 S.p. Cas9 蛋白时，研究者必须在使用前将 1 μg sgRNA 与 5 μg S.p. Cas9 蛋白混合，预先形成 CRISPR/Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物，避免产生气泡，并在室温孵育至少 20 分钟，以获得最佳效果。</li>
	<li>计数后，将每转染反应 106 个 B 细胞转移至无菌锥形管中。</li>
	<li>用无菌 1× PBS 将体积补至 15 mL，于 400 × g 离心 5 分钟。等待期间，准备原代细胞转染试剂（表 2），并置于室温备用。</li>
	<li>弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>用 10 mL 无菌 1× PBS 重悬细胞沉淀，并于 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>完全弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>每 106 个 B 细胞向细胞沉淀中加入 0.5 μg 化学修饰的 GFP mRNA（作为转染报告基因）（可选步骤）。</li>
	<li>每 106 个 B 细胞用 20 μL 原代细胞转染试剂重悬细胞沉淀；通过移液枪轻柔吹打 5–6 次混匀。将每转染反应 20.5 μL 混合液转移至含有 2.5 μL CRISPR/Cas9 转染底物的 0.2 mL 8 孔排管管中。</li>
	<li>上下吹打一次以混匀，并将全部体积（23 μL）转移至电穿孔杯中。盖上杯盖，轻敲电穿孔杯底部，确保液体均匀覆盖杯底。</li>
	<li>在核转染仪上使用人原代 B 细胞程序进行转染。 
	注意：核转染仪（电穿孔仪）可置于组织培养超净台外使用。盖上电穿孔杯盖以确保无菌。</li>
	<li>将电穿孔后的细胞在电穿孔杯中于室温静置 15 分钟。</li>
	<li>从组织培养板中取出 80 μL 预平衡的 B 细胞扩增培养基，加入电穿孔杯中的转染反应体系。将电穿孔杯放入组织培养箱中孵育 30 分钟。</li>
	<li>轻柔吹打数次混匀，然后将电穿孔杯中全部样品转移至含有 1 mL B 细胞扩增培养基的 48 孔组织培养板的相应孔中。最终细胞浓度应为 106 个细胞/mL。</li>
	<li>若进行基因敲入实验，在电穿孔后约 45 分钟，向相应孔中加入感染复数为 500,000 的 rAAV6 载体。rAAV6 载体构建示例见 图 4A。 
	注意：例如：对照样本不使用 CRISPR/Cas9 或 rAAV6 载体进行电穿孔；仅载体对照样本使用 rAAV6 载体进行转导但不进行 CRISPR/Cas9 电穿孔；敲入样本则同时进行 CRISPR/Cas9 电穿孔和 rAAV6 转导。rAAV6 载体必须在目标双链断裂位点上下游包含同源臂，以支持同源定向修复（HDR）。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 及湿度饱和的组织培养箱中培养。</li>
	<li>在基因编辑后第 1 天计数细胞并记录细胞活力。</li>
	<li>每 2 天更换一次 B 细胞扩增培养基：先计数细胞，然后将全部细胞转移至洁净的 1.5 mL 微量离心管中。于 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。用 100 µL 新鲜 B 细胞扩增培养基重悬细胞，转移至 24 孔组织培养板的相应孔中，并补充培养基至最终细胞浓度为 5 × 105 个细胞/mL。 
	注意：48 孔板每孔最多可容纳 1 mL 培养基；24 孔板每孔最多可容纳 2 mL 培养基；12 孔板每孔最多可容纳 4 mL 培养基；6 孔板每孔最多可容纳 8 mL 培养基。</li>
	<li>在进行流式细胞术分析、TIDE 分析和连接 PCR 等下游分析前，让基因编辑后的细胞至少扩增 5 天。</li>
</ol>

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<li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li>
</ol>

一项关于制造和使用基因组编辑B细胞的方法的专利已提交，发明人为 M.J.J、K.L. 和 B.S.M。B.S.M 担任 Immusoft 公司的顾问，并持有该公司股票。Immusoft 公司曾资助 B.S.M 实验室的研究工作。

直到最近，对原代人B细胞进行精确的基因组编辑仍然具有挑战性9,10。我们此前已发表过利用CRISPR/Cas9技术对原代人B细胞进行基因工程改造的实验方案9。本文中，我们概述了改进后的B细胞分离、扩增和基因工程操作流程，可实现CD19的高效敲除或EGFP基因的敲入。
在此，我们证明了本扩增方案可在体外实现B细胞的快速扩增，在7天内最高可达44倍的扩增效果（图1）。本方案的扩增速度优于Johnson等人9和Hung等人10所报道的结果。确保原代B细胞健康且快速扩增的关键步骤包括：每隔两天用新鲜的激活因子补充培养基，并确保培养物中总B细胞数量不超过2 × 106 个细胞/mL。
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B细胞是一类来源于造血干细胞的淋巴细胞亚群。它们通过在免疫应答中产生大量抗体，在适应性体液免疫系统中发挥关键作用1。B细胞同时也是记忆B细胞和终末分化的长寿浆细胞的前体，从而提供持久的体液免疫2。特别是浆细胞，在免疫细胞中具有独特性，能够持续产生大量特异性抗体，并存活数年甚至数十年3。此外，由于B细胞系易于从外周血中分离，因此成为新型细胞治疗的理想候选者4。
此前，已有研究采用随机整合方法（例如使用慢病毒载体或Sleeping Beauty转座子）对B细胞进行基因工程改造，以实现外源基因的递送与表达5,6,7,8。然而，这些方法具有非特异性的特点，难以在B细胞中研究特定基因的生物学功能，并且在治疗应用中存在插入突变的固有风险，以及外源基因表达水平不一或发生沉默等问题。
CRISPR/Cas9 系统是一种强大的基因组编辑工具，可使研究人员精确地编辑多种物种中各类细胞的基因组。最近，包括我们实验室在内的两个研究团队已成功开发出在体外扩增并靶向编辑原代人B细胞基因组的方法9,10。本文将介绍从白细胞分离样本中纯化原代人B细胞的流程。随后，我们将描述我们更新后的B细胞扩增及分离B细胞活化方案。接下来，我们将介绍通过电穿孔将CRISPR/Cas9 mRNA与CD19单导向RNA（sgRNA）共同导入活化的B细胞，以敲除分化簇19（CD19）——一种特异性B细胞受体及B细胞标志性分子——的实验步骤。
Cas9 mRNA 被翻译后与 CD19 sgRNA 结合，形成 CRISPR/Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物（RNP）。随后，该复合物中的 sgRNA 引导 Cas9 在基因第2个外显子的目标序列上产生双链断裂（DSB）。细胞将通过“非同源末端连接”方式修复该 DSB，插入或删除核苷酸，从而导致移码突变，使基因被敲除。随后，我们将通过流式细胞术检测 CD19 的表达缺失，并通过分解追踪插入缺失（TIDE）分析来评估插入缺失（indel）的形成情况。
接下来，我们将描述使用CRISPR/Cas9系统联合重组AAV6载体（rAAV6，作为同源定向修复（HDR）的供体模板）在腺相关病毒整合位点1（AAVS1）基因处介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的位点特异性插入。AAVS1基因是人类基因组中一个具有活性但无已知生物学功能的基因座，同时也是腺相关病毒的天然整合位点，因此被视为基因组编辑的“安全港”。本文报道，B细胞的扩增与活化可在7天培养期内实现最高达44倍的扩增（图1）。电穿孔处理后的B细胞在转染后24小时表现出整体细胞活力的轻微下降（图2A）。对CD19标志物的散点图分析显示，在基因编辑后的细胞中，CD19表达最高降低了83%（图2B和图2C）。
对色谱图的TIDE分析（图3A）显示，插入缺失（% indels）比例与流式细胞术检测的蛋白表达缺失比例（% protein loss）相似（图3B）。对敲入（KI）实验的流式细胞术分析表明，接受AAV载体（图4）与RNP共同转导的细胞中，EGFP阳性细胞比例最高达64%（图5A），后续通过连接片段聚合酶链式反应（junction PCR）证实了成功整合（图5B）。细胞计数结果显示，所有样本在基因编辑后3天内迅速恢复（图5C）。

<table><tbody><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3 蛋白，500 μg</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>也可提供较小尺寸</td></tr><tr><td>Amaxa P3 原代细胞 4D-电转染 X 试剂盒 S（32 次反应）</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液</td><td>高质量生物学</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap 化学修饰的 Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnology</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006（ODN 7909）5 mg</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>提供多种规格</td></tr><tr><td>Cryostor CS10，100 mL</td><td>STEMCELL 技术</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS免疫细胞SR</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人B细胞分离试剂盒</td><td>STEMCELL 技术</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 可固定活力染料 eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>无异源B细胞快速增殖培养基</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>CCM031</td><td>B细胞基础培养基</td></tr><tr><td>Falcon 14 mL 聚丙烯圆底管</td><td>康宁</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>S11550</td><td>仅用于B细胞解冻</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&amp;reg; 8联排0.2 mL PCR管，带独立铰链盖</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0.0067M PBS（无 Ca，无 Mg）或 1x PBS</td><td>GE 医疗生命科学</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector 核心装置</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector X 电转染仪</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Mega CD40配体</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>弗罗斯特先生</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td>用于细胞冻存</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP 抗人 CD19 克隆 HIB19</td><td>biolegend</td><td>302228</td><td>也可提供较小尺寸</td></tr><tr><td>rAAV6 SA-GFP 包装（使用我们的 SA-GFP 表达盒，见图4）</td><td>维真生物科学</td><td>N/A</td><td>大规模包装，1e13 GC/mL，500 mL</td></tr><tr><td>重组人 IL-10 蛋白 250 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>提供多种规格</td></tr><tr><td>重组人 IL-15 蛋白 25 μg</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>提供多种规格</td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep 磁力架</td><td>STEMCELL 技术</td><td>18001</td><td>提供多种规格</td></tr><tr><td>Tris-EDTA（TE）缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 crispr/cas9 对原代人 b 细胞进行基因组编辑

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B细胞是由造血干细胞衍生而来的淋巴细胞，是适应性免疫系统体液免疫分支的关键组成部分。由于B细胞易于从外周血中分离、可在体外扩增，并且在体内具有较长的存续时间，因此成为细胞治疗的理想候选细胞。此外，B细胞正常的生物学功能——大量产生抗体——可被利用来高效表达大量治疗性蛋白，例如用于抗感染的重组抗体，或用于治疗酶缺陷病的酶。本文提供了从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离原代人B细胞以及在体外激活和扩增分离B细胞的详细方法。随后，我们展示了利用CRISPR/Cas9系统在B细胞中实现内源基因位点特异性敲除（KO）的操作步骤。该方法可高效敲除多种基因，可用于研究目的基因的生物学功能。接着，我们演示了将CRISPR/Cas9系统与重组腺相关病毒（rAAV）载体联合使用，以实现外源基因表达盒在B细胞中高效、位点特异性整合的操作流程。综上所述，本实验方案提供了一个逐步操作的工程化平台，可用于原代人B细胞中基因生物学功能的研究，以及B细胞治疗药物的开发。

更新后的扩增与活化方案可在7天内实现B细胞最高达44倍的快速扩增（图1；n = 3 名供体）。在敲除实验中，通过台盼蓝染色检测B细胞数量，结果显示，在电穿孔后24小时，对照组和CD19基因敲除样本中存活细胞均超过80%，但细胞回收率略有下降图 2A；p ≥ 0.05，n = 3 名供体）。该结果表明电穿孔对B细胞整体健康状况影响较小。转染后第5天收集B细胞，用于流式细胞术和TIDE分析。对照组和基因敲除样本的代表性散点图分别显示14%和95%的CD19阴性细胞（图 2B). 流式图谱的定量分析显示，与对照组相比，基因敲除样本中CD19表达显著降低图2B；p ≤ 0.0001，n = 3 名供体）。基因组测序色谱图（引物序列见 表3)在CD19基因敲除的B细胞中显示出双峰，表明经CRISPR/Cas9介导的双链断裂后发生了核苷酸的插入/缺失，而对照组中仅观察到单峰，表明...

本文提供了一种基于CRISPR/Cas9的原代人B细胞基因组编辑的详细分步实验方案，用于基因敲除（KO）和敲入（KI），以研究基因在B细胞中的生物学功能以及B细胞治疗药物的开发。

使用 CRISPR/Cas9 对原代人 B 细胞进行基因组编辑

B细胞是由造血干细胞衍生而来的淋巴细胞，是适应性免疫系统体液免疫分支的关键组成部分。它们能够产生……

该方案允许研究人员精确敲除B细胞中的某个基因，以研究该基因的功能缺失效应，或插入外源基因以实现稳定的外源基因表达，可用于科研或治疗目的。该方法的主要优势在于提供了一个通用平台，能够以高效率、简便且精确地对B细胞进行基因工程改造。该方法可用于改造B细胞，使其表达重组抗体或酶，随后将这些B细胞回输体内，用于治疗感染性疾病或酶缺乏症。首先，在37摄氏度水浴中解冻B细胞。等待过程中，将两毫升预热的胎牛血清（FBS）转移至无菌的15毫升锥形管中。当B细胞完全解冻后，立即将一毫升预热的FBS逐滴加入样品中。室温孵育1分钟。轻轻吹打重悬样品，并将全部体积逐滴转移至含有2毫升预热胎牛血清（FBS）的锥形管中。用无菌PBS补至15毫升，盖紧管盖后轻轻倒置混匀2到3次。将样品在400 × g条件下离心5分钟，然后弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用1毫升预平衡的B细胞扩增培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。总细胞数应约为10的7次方个细胞。将细胞转移至含有20毫升预平衡B细胞扩增培养基的培养瓶中。细胞终浓度应约为每毫升5 × 10⁵个细胞。将培养瓶垂直放入组织培养箱中孵育。通过将每转染反应一微克化学修饰的sgRNA与1.5微克化学修饰的酿脓链球菌Cas9核mRNA混合，制备CRISPR/Cas9转染底物。作为对照，在八联管条的0.2毫升离心管中加入一微升TE缓冲液以替代sgRNA。开启电穿孔仪，并准备核转染试剂。将每转染反应100万个B细胞计数后转移至无菌锥形管中。用无菌PBS调节体积至15毫升，于400 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液。用10毫升无菌PBS重悬细胞，在400 × g离心5分钟，然后彻底弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。向细胞沉淀中加入每100万B细胞0.5微克的化学修饰GFP mRNA。每100万B细胞用20微升原代细胞转染试剂重悬沉淀，轻轻吹打5至6次以混匀。将每转染反应20.5 µL转移至含有CRISPR/Cas9试剂的0.2 mL离心管中。用移液器轻轻吹打混匀一次，然后将全部液体转移至电转杯中。盖上杯盖，轻轻敲击实验台面，使液体均匀覆盖电转杯底部。使用电穿孔仪上的人原代B细胞程序进行转染。将电穿孔后的细胞在室温下静置15分钟。然后将80微升预平衡的B细胞扩增培养基加入电穿孔反应的比色杯中。将比色皿放入组织培养孵育箱中孵育30分钟。轻轻吹打数次以混匀，然后将比色皿中全部样品转移至含有1毫升B细胞扩增培养基的48孔组织培养板的适当孔中。细胞的终浓度应为每毫升100万个细胞。进行基因敲入实验时，将重组腺相关病毒6型载体以500,000感染复数加入含有电穿孔细胞的适当孔中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳及湿度适宜的组织培养孵育箱中。在基因敲除实验中，B细胞计数显示，在电穿孔后24小时，对照组和CD19基因敲除样本的细胞活力均超过80%，但细胞回收率略有下降。转染后第五天收集B细胞，用于流式细胞术和滴度分析。对照组和基因敲除样本的代表性散点图分别显示CD19阴性细胞占14%和95%，表明在基因敲除样本中CD19表达显著降低。基因组测序的色谱图显示，CD19基因敲除B细胞中出现双峰，提示在CRISPR/Cas9介导的双链断裂后发生了核苷酸的插入或缺失。对敲除样本的色谱图进行插入缺失（indel）分析，结果显示CD19位点的indel形成比例较高，这与流式细胞术检测到的CD19蛋白丢失百分比一致。敲入实验的B细胞在工程化后第12天收集。散点图显示，在接受重组腺相关病毒六型载体与RNP共同处理的样本中，EGFP阳性细胞占64%，而在对照组及仅使用载体的样本中，EGFP阳性细胞则无或极少。连接PCR扩增结果显示，在敲入样本中观察到1.5千碱基对的扩增产物，而在对照样本或仅含载体的样本中均未检测到PCR产物。细胞计数表明，与对照样本或仅含载体的样本相比，基因编辑过程对敲入样本的细胞回收率影响更大。然而，所有样本在基因编辑后三天内均迅速恢复。该操作还可用于引入碱基编辑工具，以改变B细胞基因组中的单个碱基对，从而诱导或纠正单点突变。此外，也可用于引入提前终止密码子或改变剪接位点，实现多个基因的敲除，同时避免染色体易位的风险。在该技术出现之前，对人类B细胞进行基因改造需要依赖其他更具挑战性的基因工程方法。该技术是一种更简便、成本更低且更快捷的替代方法。它还可能用于合成用于临床的细胞治疗产品。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用CRISPR/Cas9的人类B细胞基因组工程

本视频演示了使用 CRISPR-Cas9 技术在人 T 细胞中进行基因编辑的实验方法。将原代 CD4+ 和 CD8+ T 细胞与靶向特定基因以实现基因敲除的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物混合。通过电穿孔后，sgRNA 引导 Cas9 至目标 DNA...

一种用于T细胞基因编辑的CRISPR-Cas9技术

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

在此，我们介绍一种利用基因修饰技术改造原代或扩增的人自然杀伤（NK）细胞的实验方案 Cas9 核糖核蛋白复合物 (Cas9/RNPs)。通过使用本方案，我们获得了人类自然杀伤细胞中特定基因缺陷的 转化生长因子-β受体2 （TGFBR2）和 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1...

利用Cas9核糖核蛋白生成敲除型原代及扩增人自然杀伤细胞

CRISPR-Cas 是一种用于编辑动植物复杂基因组的强大技术。本文详细介绍了一种利用不同 Cas...

使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

为了更深入地研究造血干细胞生物学及血液系统恶性肿瘤，有必要建立能够真实模拟造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的新型策略。本文介绍了一种结合使用CRISPR/Cas9与双rAAV供体转导技术，在HSPCs中模拟杂合功能获得性突变的实验方案。...

在人类造血干细胞和祖细胞中构建致癌性杂合功能获得突变

我们提出了一种利用CRISPR/Cas9和重组腺相关病毒6型对恒河猴原代B细胞进行培养和基因编辑的方法，用于B细胞治疗的研究。...

食蟹猴原代B细胞的基因编辑

本方案描述了利用组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物对小鼠骨髓来源巨噬细胞进行基因组编辑的操作步骤 体外...

利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

提供了一种详细的方案，用于利用CRISPR/Cas9技术在原代人T细胞中实现大片段、多顺反子结构的高效靶向敲入。 通过...

非病毒法改造人原代T细胞 通过 同源介导的末端连接靶向整合大型DNA模板

学习使用CRISPR/Cas9技术对原代人B细胞进行基因敲除和敲入的高效方法。该方案通过电穿孔递送基因编辑工具，为研究B细胞生物学和开发细胞治疗提供可靠平台。

使用 CRISPR/Cas9 对原代人 B 细胞进行基因组编辑

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