使用 CRISPR/Cas9 对原代人 B 细胞进行基因组编辑

该方案允许研究人员精确敲除B细胞中的某个基因，以研究该基因的功能缺失效应，或插入外源基因以实现稳定的外源基因表达，可用于科研或治疗目的。该方法的主要优势在于提供了一个通用平台，能够以高效率、简便且精确地对B细胞进行基因工程改造。该方法可用于改造B细胞，使其表达重组抗体或酶，随后将这些B细胞回输体内，用于治疗感染性疾病或酶缺乏症。

首先，在37摄氏度水浴中解冻B细胞。等待过程中，将两毫升预热的胎牛血清（FBS）转移至无菌的15毫升锥形管中。当B细胞完全解冻后，立即将一毫升预热的FBS逐滴加入样品中。

室温孵育1分钟。轻轻吹打重悬样品，并将全部体积逐滴转移至含有2毫升预热胎牛血清（FBS）的锥形管中。用无菌PBS补至15毫升，盖紧管盖后轻轻倒置混匀2到3次。

将样品在400 × g条件下离心5分钟，然后弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用1毫升预平衡的B细胞扩增培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。总细胞数应约为10的7次方个细胞。

将细胞转移至含有20毫升预平衡B细胞扩增培养基的培养瓶中。细胞终浓度应约为每毫升5 × 10⁵个细胞。将培养瓶垂直放入组织培养箱中孵育。

通过将每转染反应一微克化学修饰的sgRNA与1.5微克化学修饰的酿脓链球菌Cas9核mRNA混合，制备CRISPR/Cas9转染底物。作为对照，在八联管条的0.2毫升离心管中加入一微升TE缓冲液以替代sgRNA。开启电穿孔仪，并准备核转染试剂。

将每转染反应100万个B细胞计数后转移至无菌锥形管中。用无菌PBS调节体积至15毫升，于400 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液。

用10毫升无菌PBS重悬细胞，在400 × g离心5分钟，然后彻底弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。向细胞沉淀中加入每100万B细胞0.5微克的化学修饰GFP mRNA。每100万B细胞用20微升原代细胞转染试剂重悬沉淀，轻轻吹打5至6次以混匀。

将每转染反应20.5 µL转移至含有CRISPR/Cas9试剂的0.2 mL离心管中。用移液器轻轻吹打混匀一次，然后将全部液体转移至电转杯中。盖上杯盖，轻轻敲击实验台面，使液体均匀覆盖电转杯底部。

使用电穿孔仪上的人原代B细胞程序进行转染。将电穿孔后的细胞在室温下静置15分钟。然后将80微升预平衡的B细胞扩增培养基加入电穿孔反应的比色杯中。

将比色皿放入组织培养孵育箱中孵育30分钟。轻轻吹打数次以混匀，然后将比色皿中全部样品转移至含有1毫升B细胞扩增培养基的48孔组织培养板的适当孔中。细胞的终浓度应为每毫升100万个细胞。

进行基因敲入实验时，将重组腺相关病毒6型载体以500,000感染复数加入含有电穿孔细胞的适当孔中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳及湿度适宜的组织培养孵育箱中。在基因敲除实验中，B细胞计数显示，在电穿孔后24小时，对照组和CD19基因敲除样本的细胞活力均超过80%，但细胞回收率略有下降。

转染后第五天收集B细胞，用于流式细胞术和滴度分析。对照组和基因敲除样本的代表性散点图分别显示CD19阴性细胞占14%和95%，表明在基因敲除样本中CD19表达显著降低。基因组测序的色谱图显示，CD19基因敲除B细胞中出现双峰，提示在CRISPR/Cas9介导的双链断裂后发生了核苷酸的插入或缺失。

对敲除样本的色谱图进行插入缺失（indel）分析，结果显示CD19位点的indel形成比例较高，这与流式细胞术检测到的CD19蛋白丢失百分比一致。敲入实验的B细胞在工程化后第12天收集。散点图显示，在接受重组腺相关病毒六型载体与RNP共同处理的样本中，EGFP阳性细胞占64%，而在对照组及仅使用载体的样本中，EGFP阳性细胞则无或极少。

连接PCR扩增结果显示，在敲入样本中观察到1.5千碱基对的扩增产物，而在对照样本或仅含载体的样本中均未检测到PCR产物。细胞计数表明，与对照样本或仅含载体的样本相比，基因编辑过程对敲入样本的细胞回收率影响更大。然而，所有样本在基因编辑后三天内均迅速恢复。

该操作还可用于引入碱基编辑工具，以改变B细胞基因组中的单个碱基对，从而诱导或纠正单点突变。此外，也可用于引入提前终止密码子或改变剪接位点，实现多个基因的敲除，同时避免染色体易位的风险。在该技术出现之前，对人类B细胞进行基因改造需要依赖其他更具挑战性的基因工程方法。

该技术是一种更简便、成本更低且更快捷的替代方法。它还可能用于合成用于临床的细胞治疗产品。