Name: 在大鼠中准备去细胞化肾脏脚手架 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 学习使用Triton X-100和SDS对大鼠肾脏进行去细胞化处理，保留细胞外基质超微结构并去除细胞核。该技术为组织工程和移植医学中的血管化支架制备提供了可靠方法。

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本研究由釜山国立大学医院生物医学研究所基金资助。

本研究经釜山国立大学医学院管理部门批准，并遵循动物使用与护理的伦理指南进行（证书编号：2017-119）。在开展任何动物实验之前，应获得机构审批。 
注意：成功进行腹部器官手术展示和成像所需的所有外科及麻醉器械/设备和试剂详见表1。
1. 大鼠肾脏采集的制备步骤
<ol>
	<li>手术准备阶段，将8周龄的Sprague-Dawley大鼠（体重200–250 g）置于加热垫上，并将直肠温度探头插入直肠以监测核心体温。</li>
	<li>使用5%异氟烷气体进行麻醉（诱导浓度：5%，维持浓度：3%）。</li>
	<li>麻醉给药后，将大鼠仰卧位固定于手术台上，并用胶带固定四肢以开始手术。</li>
	<li>使用杀菌皂剃净并清洁供体大鼠的腹部皮肤；涂抹2%碘伏至少1–2分钟，再用70%乙醇溶液擦拭，重复该过程三次。</li>
	<li>用无菌带孔洞巾覆盖手术区域。</li>
	<li>作垂直腹壁切口，暴露左侧肾脏、输尿管、腹主动脉和下腔静脉。</li>
	<li>在切断肾蒂之前，辨认并游离左侧肾脏、输尿管、腹主动脉和下腔静脉。</li>
</ol>
2. 经心灌注
<ol>
	<li>手术前，准备灌注液。
	<ol>
		<li>每只大鼠准备 50 mL 灌注液。</li>
		<li>将 1× PBS 与约 10 U/mL 肝素混合（1 瓶 25 kU 肝素可配制 2.5 L PBS+Hep）。</li>
		<li>将等体积的 8% 多聚甲醛与 1× PBS 混合，配制成 4% PFA/1×PBS 溶液。 
		注意：以水配制的 8% 多聚甲醛可在 4 °C 下保存长达 2 个月。然而，用 PBS 稀释后的 4% 多聚甲醛在 4 °C 下仅可稳定保存 1 周。请现用现配。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将腹部正中切口向头侧延伸。剪开时务必使剪刀尖端远离器官，以避免损伤内脏器官。</li>
	<li>继续切开肋骨区域，然后通过提起胸骨剪开膈肌。</li>
	<li>将松动的皮瓣用针固定至一侧，用镊子撕开周围结缔组织以暴露心脏。 
	警告：切勿使用剪刀分离心脏，否则可能导致不必要的出血。</li>
	<li>打开磷酸盐缓冲盐水（PBS）管路，并在将针头插入左心室前确认液体流通。用钝头镊子轻轻夹持心脏，使用止血钳控制针头。针头插入深度不应超过 1/4 英寸。 
	注意：若插入深度超过 1/4 英寸，可能导致组织对侧穿孔。</li>
	<li>在用针头和止血钳固定心脏的同时，定位右心房，并用虹膜剪将其剪开。将止血钳置于大鼠体表，确保针头仍位于心脏内部。 
	注意：若切口充分，随着 PBS 流入大鼠体内压力释放，体腔内应可见血液流出。</li>
	<li>小心取下前肢和皮肤瓣的固定针。</li>
	<li>继续灌注 PBS 4 分钟，或根据肾脏和肝脏中是否仍有可见血液决定延长灌注时间。</li>
</ol>
3. 肾脏获取与脱细胞
<ol>
	<li>取左侧肾脏，连同腹主动脉和下腔静脉。</li>
	<li>结扎输尿管、胸主动脉、上腔静脉以及腹主动脉的分支。</li>
	<li>将器官置于10 cm培养皿中的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中以保持湿润。</li>
	<li>使用23号导管插管腹主动脉和下腔静脉。为清除残留血液，将导管连接至蠕动泵，在37 °C条件下以5 rpm流速用DPBS（500 mL）和16 U/mL肝素灌注90分钟。</li>
	<li>为对肾脏进行脱细胞处理，先以1% Triton X-100溶液（1 L）灌注3小时，随后在恒定压力40 mmHg下用0.75%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（2 L）灌注6小时。 
	注意：肾脏在8小时后将变为透明。</li>
	<li>为去除残留的SDS，先用含1%青霉素的蒸馏水（6 L）灌注18小时（过夜），再用无菌DPBS（500 mL）和16 U/mL肝素灌注90分钟。</li>
</ol>

<ol><li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li>
<li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li>
<li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li>
<li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+amniotic+membrane+%28AM%29+denuding+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li>
<li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933(2019).</li>
<li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle%3B+implications+for+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+definition+of+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li>
<li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+decellularization+of+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li>
<li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

已采用多种方案对器官及其他组织进行脱细胞处理。理想的脱细胞方案应能保留细胞外基质（ECM）的三维结构。通常，此类方案包括通过物理处理或离子溶液裂解细胞膜，通过酶处理或去垢剂将细胞质和细胞核从ECM中解离，随后清除组织中的细胞碎片3。物理处理方法包括刮除、溶液震荡、压力梯度、速冻、非热永久性电穿孔以及超临界流体2。位于组织或器官外表面的细胞（如皮肤或小肠）可通过机械处理联合酶法高效去除4。离子型或非离子型去垢剂可溶解DNA/蛋白质相互作用、脂质和脂蛋白，但可能损伤ECM结构5。酶法可去除解离的细胞质和核物质，但可能使这些物质残留在ECM中，从而引发免疫反应6。脱细胞所需的最佳试剂取决于组织的厚度、密度或脱细胞组织的临床用途。
在脱细胞过程中，我们联合使用了非离子型和离子型去垢剂：Triton X-100 和 SDS。Triton X-100 作为非...

细胞培养技术可用于再生功能性组织和器官，以替代病变或受损的器官。目前，同种异体器官移植是治疗不可逆器官损伤最常用的方法；然而，该方法需要使用免疫抑制剂来防止移植器官被排斥。此外，尽管移植免疫学已取得进展，但在移植后5年内，约20%的移植受者可能出现急性排斥反应，而在移植后10年内，约40%的受者可能失去移植器官或死亡1。
组织工程技术的进步催生了一种新的器官移植范式，即利用分化后的干细胞实现无免疫排斥的器官移植。干细胞分化后，需要一种称为合成细胞外基质的支架，以促进三维器官的形成，并使新生组织在受体体内得以存活和生长。来源于脱细胞天然器官的支架具有优势，包括为细胞定植提供更有效的微环境，并促进干细胞增殖，尽管这些机制尚未完全阐明2。特别是肾脏，因其具有丰富的血液循环和适合干细胞定植的微环境，是制备支架的理想器官。此外，由于肾脏结构复杂，人工再生用于器官移植的肾脏仍面临巨大挑战。
本报告中，我们介绍了一种利用大鼠模型中的脱细胞器官构建血管化支架的方法，以促进未来用于组织工程研究的动物实验。

<table><tbody><tr><td>1 cc 注射器（用于注入探针和载体溶液）</td><td>Becton Dickinson</td><td>305217</td><td></td></tr><tr><td>10-0 Ethilon 缝线（用于血管吻合）</td><td>Ethicon</td><td>9032G</td><td></td></tr><tr><td>25 号导引针（用于血管导管）</td><td>Becton Dickinson</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>3-0 PDS 缝线（大鼠切口缝合）</td><td>Ethicon</td><td>Z316H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Prolene 缝线（大鼠切口缝合）</td><td>Ethicon</td><td>8832H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 丝线卷（大鼠血管通路/结扎用）</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 110</td><td></td></tr><tr><td>4-0 PDS 缝线（小鼠切口缝合）</td><td>Ethicon</td><td>Z773D</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Prolene 缝线（小鼠切口缝合）</td><td>Ethicon</td><td>8831H</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线卷（小鼠血管通路/结扎用）</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 106</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀（用于剪开筋膜/结缔组织）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Halsey 持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Kelly 止血钳（用于大鼠：肌肉夹闭以减少切割时出血）</td><td>Fine Science Tools</td><td>13018-14</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯 50 号导管，导管管路，100 英尺长</td><td>Braintree Scientific</td><td>.023&quot; &amp;times; .038&amp;rdquo;</td><td></td></tr><tr><td>Schwartz 微型精细血管夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-01 (直型)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>18052-03 (弯型)</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀（用于剪开皮肤）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen 弹簧剪刀（用于动脉切开）</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠脱细胞肾脏支架的制备

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

组织工程是生物医学领域的一门前沿学科。细胞培养技术可用于再生功能性组织和器官，以替代病变或受损的器官。在体内利用分化干细胞构建三维器官或组织时，需要支架材料来提供支持。本研究中，我们描述了一种利用去细胞化大鼠肾脏开发血管化支架的新方法。实验选用8周龄的Sprague-Dawley大鼠，向心脏注射肝素以促进其流入肾血管，使肝素灌注至肾血管系统。打开腹腔后，采集左肾。采集的肾脏使用Triton X-100和十二烷基硫酸钠等去污剂灌注处理9小时，以实现组织去细胞化。随后，用1%青霉素/链霉素溶液和肝素轻柔冲洗去细胞化肾脏支架，以清除细胞碎片和化学残留物。将干细胞移植至去细胞化血管支架有望促进新器官的形成。因此，这种血管化支架未来可能为器官移植物的组织工程提供重要基础。

大鼠肾脏的大体形态呈深红色（图1A）。脱细胞处理后，肾脏变为浅色且半透明（图1D）。根据试剂盒制造商的说明，使用商用试剂盒检测脱细胞肾脏支架中的残留基因组DNA，并与天然肾脏（对照组）进行比较。定量分析证实，脱细胞处理后组织中的基因组DNA几乎被完全去除。在14个样本中，对照组的平均DNA含量为115.05 ng/µL，脱细胞支架的平均DNA含量为1.96 ng/µL。总体而言，98.3%的DNA被清除（图2），同时三维结构得以保持，皮质实质内的无细胞肾小球结构也被保留（图3）。
<img alt="组织脱细胞过程，肾脏样本在化学处理阶段的序列，生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61856/61856fig01.jpg" ...

本方案介绍了一种利用去细胞化大鼠肾脏制备支架的方法。该方案包括去细胞化和再细胞化过程，以验证其生物可利用性。去细胞化过程使用Triton X-100和十二烷基硫酸钠进行。

组织工程是生物医学领域的前沿学科。细胞培养技术可用于功能性组织和器官的再生……

本方案可利用大鼠模型中的肾脏制备具有血管化的支架。肾脏是用于分化干细胞支架的最合适器官。该方案在肾脏去细胞化方面具有很高的成功率。该方法能有效去除细胞核，同时最大程度地减少对细胞外基质超微结构的破坏。此技术可应用于移植医学和组织工程领域。本实验操作将由本实验室整形外科医学博士兼副教授 Kim Joo Hyoung 演示。首先，将一只八周龄的Sprague Dawley大鼠置于加热垫上，并将直肠温度计探头插入直肠以监测核心体温。麻醉大鼠后，将其仰卧位固定于手术台上，用胶带将四肢固定。使用杀菌皂剃除腹部毛发并进行清洁。使用2%聚维酮碘涂抹至少一到两分钟，然后用70%乙醇溶液擦拭。重复此步骤三次。用无菌带孔洞巾覆盖手术区域。做腹部正中纵切口，暴露左肾、输尿管、腹主动脉和下腔静脉。在切断肾蒂前分离周围组织。通过将PBS与肝素混合，为每只大鼠配制50毫升灌注液，肝素终浓度约为每毫升10单位。将8% PFA与PBS等体积混合，配制4% PFA溶液。将腹部正中切口向上延伸至颅侧，剪开时务必使剪刀尖端远离器官，以免损伤。继续沿肋骨切开，然后抬起胸骨，剪开膈肌。使用艾利斯钳将松动的皮肤瓣拉向一旁，然后用镊子撕开任何结缔组织以游离心脏。打开 PBS 管路，并在将针头插入左心室之前确保液体正在流动。用钝头镊子轻轻夹住心脏，并使用止血钳控制针头。进针深度不应超过四分之一英寸。用针和止血钳支撑心脏，找到右心房，用虹膜剪将其剪开。将止血钳放置在大鼠体表，确保针头仍位于心脏内部。如果肾脏和肝脏中仍可见血液，则继续灌注 PBS 四分钟或更长时间。取下左侧肾脏以及腹主动脉和下腔静脉。结扎输尿管、胸主动脉、上腔静脉及腹主动脉的分支。将器官置于含有 DPBS 的 10 厘米培养皿中以保持湿润。使用 23 号导管插管腹主动脉和下腔静脉。为清除残留血液，将导管连接至蠕动泵，并在 37 摄氏度、5 rpm 条件下，用含 16 单位/毫升肝素的 500 毫升 DPBS 灌流器官 90 分钟。为了对肾脏进行脱细胞处理，先以40毫米汞柱的恒定压力用1% Triton X-100灌注3小时，随后用0.75% SDS溶液灌注6小时。为去除残留的SDS，先用含1%青霉素的蒸馏水灌注样本18小时，再用无菌DPBS和每毫升16单位肝素灌注90分钟。大鼠肾脏的大体形态呈深红色。脱细胞后，肾脏变得苍白且半透明。对脱细胞肾脏支架中的残留基因组DNA进行定量，并与天然肾脏中的含量进行比较，证实脱细胞后组织中的基因组DNA几乎被完全去除。在14个样本中，对照组的平均DNA含量为115.05 纳克/微升，脱细胞支架的平均DNA含量为1.96 纳克/微升。总共去除了 98.3% 的 DNA。三维结构得以保持，无细胞肾小球保留在皮质实质中。将针头插入左心室时，插入深度不应超过四分之一英寸。任何进一步的插入都可能从另一侧穿出。我们相信，该技术将为组织工程领域开辟新的前景。

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在大鼠中准备去细胞化肾脏脚手架

本视频介绍了大鼠肾脏脱细胞的制备过程。所获得的无细胞血管支架可作为器官移植物组织工程的一个有前景的平台。...

大鼠肾脏脱细胞制备：一种由收获的大鼠肾脏生成无细胞血管化全器官支架的方案

关键词：脱细胞，器官支架，大鼠肾脏，血管化，组织工程，再生医学

采用我们专有设备进行大鼠肝脏收获、插管和灌注的技术，可实现复杂的灌注系统，从而改进肝脏脱细胞和再细胞化实验。...

振荡压力灌注装置中大鼠肝脏脱细胞操作步骤

本方案描述了通过血管顺行灌注去污剂对 Sprague Dawley...

上皮细胞重植及啮齿类动物肾脏组织发育用细胞外基质支架的制备

组织工程化肾脏结构为解决器官短缺及透析带来的有害影响提供了一种方案。本文描述了一种从小鼠肾脏中显微解剖分离皮质-髓质节段的实验方案。这些节段被植入无支架的细胞结构中，形成肾脏类器官。...

原发性肾组织节段的显微解剖及其与新型无支架构建技术的整合

本文介绍了一种利用肾脏皮质细胞外基质制备水凝胶的方案，以保留天然肾脏细胞外基质（ECM）的结构和生化组成。文中描述了该水凝胶的制备过程及其应用。最后，探讨了利用该水凝胶支持肾脏特异性细胞与组织再生及生物工程构建的前景。...

制备肾皮质细胞外基质来源水凝胶

本方案描述了一种通过使用肺泡上皮II型细胞、成纤维细胞和内皮细胞重新接种脱细胞化精密切割肺组织切片，以生成可重复且小规模工程化肺组织的方法。...

由脱细胞肺切片制备的工程化肺组织

我们描述了大鼠后肢复合体的手术技术及脱细胞处理过程。脱细胞采用低浓度十二烷基硫酸钠通过灌注进行 离体 机器灌注系统...

大鼠后肢的获取与脱细胞化方法 离体 基于灌注的生物反应器用于带血管复合组织异体移植

本研究优化了一种脱细胞化方案，以获得胎鼠骨骼肌的脱细胞基质。C2C12成肌细胞能够定植于这些基质中，并进行增殖和分化。 体外...

从小鼠胎儿骨骼肌制备用于细胞培养的三维脱细胞基质

在本研究中，我们详细描述了脱细胞化、物理表征、成像以及 体内...

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脱细胞脾基质（DSM）在肝组织工程领域具有广阔的应用前景。本方案概述了制备大鼠DSM的操作流程，包括获取大鼠脾脏、通过灌注法进行脱细胞处理，以及对所得DSM进行评估以确认其特性。...

大鼠来源脱细胞脾脏基质的制备

用于移植的鼠肾常温机械灌注

学习使用Triton X-100和SDS对大鼠肾脏进行去细胞化处理，保留细胞外基质超微结构并去除细胞核。该技术为组织工程和移植医学中的血管化支架制备提供了可靠方法。

大鼠脱细胞肾脏支架的制备

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