基于DNA/Ki67的流式细胞术检测法用于分析疫苗接种小鼠中抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期

本方案提供了一种实用的方法，利用小鼠脾脏和淋巴结来反映T细胞应答的动态变化，而不仅仅是提供稳态下的表型快照。该技术能够灵敏地检测正在参与应答过程的抗原特异性CD8 T细胞。在无需体内药物处理或细胞转移可能带来的干扰效应的情况下，即可对增殖中的CD8 T细胞进行测量。

我们的技术可在多种情况下揭示免疫动态的变化。例如，可用于研究对疫苗接种和感染的免疫应答、自身免疫性疾病以及癌症免疫治疗。通过将10x破膜洗涤缓冲液用蒸馏水稀释，配制新鲜的1x破膜洗涤缓冲液，并使用0.45微米滤器过滤以去除聚集体。

根据滴定实验结果，用1×透化洗涤缓冲液稀释单克隆抗体Ki67 FITC，每份样品最终体积为100微升。向每管细胞中加入3毫升1×透化洗涤缓冲液，并在室温下以400 ×g离心5分钟。弃去上清液。

再次加入1×破膜洗涤缓冲液，离心以沉淀细胞。然后弃去上清液。向沉淀中加入100 µL稀释的单克隆抗体Ki67 FITC，涡旋混匀后于避光条件下孵育30分钟。

孵育结束后，用 4 毫升 1× 透化缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤后离心并弃去上清液。对于直接在流式细胞仪上检测的样品，向细胞沉淀中加入 350 微升 PBS；对于需用 Hoechst 染色 DNA 的样品，向细胞沉淀中加入 250 微升 PBS。配制 Hoechst 与 PBS 溶液，并将其加入各样品中，使终浓度为 2 微克/毫升。

涡旋混匀样品，并在避光条件下孵育15分钟。然后将样品以5分钟离心，向细胞沉淀中加入350 µL PBS。打开软件，在工作区功能区点击“Create Group”，创建对应于待分析不同器官的各个组别。

通过双击组名称打开已修改的组窗口，并在“synchronized”功能前插入勾选标记，以同步新创建的组。将每个FCS文件拖动到其对应的组中，然后从a-LN组开始创建设门策略。通过双击完全染色的样本打开图形窗口，以在点图中显示该样本获取的未设门事件。

请注意，x轴和y轴的标签应与本手稿的流式细胞仪设置文件中表二所示的FCS文件中的标注一致。检查是否已显示足够数量的事件以实现适当的可视化效果。如有必要，单击工作区功能区中的心形图标打开首选项，选择“图形”，然后将“散点图”设为图形类型，并确认相应框中绘制的点数是否正确，或进行修改。

在图形窗口中以点图形式显示未设门的事件，横轴为DNA-A，纵轴为DNA-W，两轴均使用线性刻度。如有必要，可通过点击图形窗口中靠近各坐标轴的标有“T”的方框，将刻度从对数转换为线性。

在设门工具部分点击矩形，选择单个细胞群，然后在矩形门的中心双击，以在点图中显示单个细胞，其中横轴为FSC-A参数，纵轴为死细胞染料信号。点击多边形以选择活细胞群体，该群体对死细胞染料呈阴性。在多边形门的中心双击，以在点图中显示细胞，其中横轴为FSC-A参数，纵轴为SSC-A参数。

单击矩形区域，创建一个宽松门控以包含该图中所有单个活细胞。双击宽松门控的中心，将在点图中显示细胞，其中 x 轴为 CD3，y 轴为 CD8。在图形窗口中使用适当的刻度进行可视化显示。

如有需要，可单击靠近各坐标轴的标有 T 的框，选择“自定义访问功能”，根据需要调整负对数级（含底数）和正对数级的刻度范围。通过单击多边形选择 CD3+CD8+ 细胞。在 CD3+CD8+ 门控中心双击，即可在点图中显示细胞，其中 x 轴为 Tetr-gag，y 轴为 Pent-gag。

通过点击多边形来选择抗原特异性的 CD8 T 细胞。在 gag 特异性门控区域的中心双击，以在点图中显示细胞，其中 x 轴为 DNA-A，y 轴为 Ki67。在图形窗口的门控工具部分点击“Quad”，以选择处于不同细胞周期阶段的细胞。

将一个样本中创建的设门策略复制到相应组，以将门应用于该组的所有样本。然后按照文本稿件中的描述，复制b-脾脏组和CBM组的设门策略。验证这三个组中每个样本的设门是否均合适。

如有需要，按照文中的描述去同步化该细胞群并调整门控。在点图中显示宽松门控下的骨髓细胞，横轴为DNA-A，纵轴为Ki67。通过点击工作区功能区中的“布局编辑器”来可视化结果。

将样本窗格中设门策略的每个门拖动到布局编辑器中，并按照设门顺序放置各个图。如有需要，可通过在布局中双击相应图并在图形定义窗口中选择适当的类型来更改图形类型。单击分组，并利用布局功能区上的函数进行迭代，以可视化各器官中抗原特异性CD8 T细胞的实验结果，并比较不同样本。

观察代表阳性对照的骨髓细胞结果。此处展示了一个典型的骨髓细胞周期分析示例。该方案获得的G0至G1期以及G2至M期DNA峰的变异系数较低，表明DNA染色质量优良。

采用五步门控策略来鉴定抗原特异性的CD8细胞。使用两种多聚体以提高在免疫小鼠中检测gag特异性CD8 T细胞的灵敏度，同时不增加未处理小鼠中的染色背景。在加强免疫后第3天，引流淋巴结和脾脏中的gag特异性CD8 T细胞中有较高比例的细胞处于S-G2/M期。

此外，将处于 S-G2/M 期的 gag 特异性 CD8 T 细胞叠加到同一器官的全部 CD8 T 细胞时，其 FSC-A 和 SSC-A 值较高。偏移直方图显示，gag 特异性 CD8 T 细胞的 CD62L 表达水平较低，符合活化 T 细胞的预期特征，仅在淋巴结中少数处于 G0 期的细胞例外。该方法旨在使 T 细胞在进行细胞膜和 Ki67 染色的同时，获得高质量的 DNA 染色效果。

流式细胞术数据分析是关键环节。务必使用适当的对照来确定设门位置。利用该方法，我们发现了小鼠和人外周血中处于细胞周期S期至G2/M期的T细胞。

该技术在1型糖尿病、传染性单核细胞增多症和新冠肺炎的免疫监测研究中具有重要应用价值。