沙飞（木薯）胚胎微注射为CRISPR/Cas9穆塔赫内西
2020年11月17日
该协议详细介绍了CRISPR/Cas9在沙蝇中靶向诱变的步骤:胚胎采集、注射、昆虫饲养和识别，以及兴趣突变的选择。
靶向诱变直到最近才适应白蛉，是了解目标基因在这些媒介昆虫中的作用和功能的关键技术。胚胎显微注射是昆虫基因组编辑中非常重要的步骤，但它需要适应您正在研究的物种，在我们的例子中是白蛉。与其他昆虫物种相比，沙蝇的胚胎非常小。
需要很长时间才能形成，并且对湿度水平特别敏感。注射前 5 天，血液喂养雌性白蛉作为常规菌落维护。喂食后一天，将采血的雌性捕获在带有侧端口的石膏荚中，以 100 至 150 只为一组，并用 30% 蔗糖溶液喂养果蝇。
在采血后第 5 天，将一张白色湿滤纸放入产蛋室中。并使用口腔吸气器收集大约 10 只雌性鲸鱼并将其从石膏舱转移到产卵室。30 到 60 分钟后，从打蛋室中取出培养皿和滤纸。
注意这一点，滤纸保持湿润，并在此期间继续收集新的雌性和胚胎群。收集完所有胚胎后，使用立体显微镜和非常细的油漆刷小心地将大约 50 个胚胎转移到单块潮湿的黑色滤纸上，放在显微镜载玻片上，每张载玻片顶部放一个盖玻片。向每张滤纸中加入足够的水，以保持胚胎湿润，而不会漂浮或被吸到盖玻片下，并将胚胎衬在盖玻片上。
鸡蛋收集开始后两到三个小时，将载玻片放在解剖显微镜下，并使用画笔小心地向滤纸的后端加水。将 0.5 至 1 微升负载注射混合物倒装到微型注射针中，然后将针头安装到气动注射控制器中，在显微镜下设置为每平方英寸 30 磅的压力。按下扳机以排出针尖中的任何空气。
当空气释放后，慢慢增加保持压力。当注射材料开始流动时，降低保持压力，直到它刚好低于从针头流出的注射混合物的点，然后将针头插入第一个胚胎的侧面。使用胚胎后面的盖玻片作为后挡块，在轻轻取下针头之前，将少量注射混合物注入胚胎中。
取出针头后，立即按下注射器以去除针尖上任何回填的材料，然后继续下一个胚胎。注射完所有胚胎后，计算注射的胚胎数量以保持连续计数，并向滤纸中加水，使盖玻片漂浮。然后使用探针将滤纸固定到位，同时将盖玻片从胚胎中拉出。
他用滤纸吸去滑梯上多余的水。将滤纸转移到新培养皿中的一堆潮湿滤纸上，然后手动将每个胚胎转移到湿润的小尺寸石膏荚上，而不会拥挤。然后用筛网盖住豆荚，并将豆荚存放在 26 度湿度、70% 湿度的培养箱中。
与大多数成功的显微注射方案一样，适合被注射胚胎的优质显微注射针头很重要。良好的锋利针头可以很容易地穿透胚胎，而不会让材料在注射后逸出。拉出的针的锥度不应太长。
否则，针头的管腔在锥度的大部分中会变得非常狭窄，从而很难获得足够高的注射压力以迫使材料通过针头。应保留注射后饲养的健康胚胎，而受损的真菌污染、干燥或变形的胚胎应丢弃。通过对预期切割部位周围区域的 PCR 分析，可以在注射后饲养的个体中鉴定潜在的突变等位基因。
使用注射的胚胎建立突变系后，基因分型 PCR 可以识别纯合突变兄弟姐妹杂交。必须有一根好的针头，这样才能轻柔地作和注射胚胎。并确保胚胎在整个过程中都保持水分。
一些果蝇的基因组编辑才刚刚开始。这项技术实际上是第一步，应该遵循更复杂的基因组修饰策略。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本协议详细说明了在沙蝇中进行CRISPR/Cas9靶向诱变的步骤，包括胚胎收集、注射、昆虫养殖以及突变的鉴定。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因工程
- 昆虫生物学
- 媒介控制
背景
- 靶向诱变对于理解沙蝇中的基因功能至关重要。
- 胚胎微注射是基因组编辑的关键步骤。
- 沙蝇胚胎很小且对湿度敏感。
- 正确的沙蝇喂养和维护对于实验的成功至关重要。
研究目的
- 适应CRISPR/Cas9技术用于沙蝇。
- 调查特定基因在媒介昆虫中的作用。
- 改进昆虫基因组编辑方法。
使用的方法
- 从沙蝇中收集胚胎。
- 微注射CRISPR/Cas9组件。
- 养殖注射过的昆虫。
- 鉴定和选择突变。
主要结果
- 成功适应CRISPR/Cas9用于沙蝇。
- 建立了有效的胚胎微注射协议。
- 在目标基因中鉴定感兴趣的突变。
- 对媒介生物学中的基因功能有所见解。
结论
- CRISPR/Cas9是沙蝇基因研究的可行工具。
- 不同昆虫物种需要方法上的适应。
- 本研究增强了我们对媒介基因学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
CRISPR/Cas9-mediated embryo microinjection in Phlebotomus papatasi enables precise, heritable gene editing in a key disease vector, addressing a longstanding bottleneck in vector biology. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for genes influencing vector competence and pathogen transmission. The method positions sand fly genetics for integration into early discovery and translational research pipelines relevant to infectious disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of genes implicated in vector competence and immune response.
- Supports biological de-risking by generating stable, heritable loss-of-function alleles.
- Facilitates predictive confidence in target selection for vector-borne disease interventions.
Screening & Assay Development
- Provides genetically defined sand fly lines for downstream phenotypic screening of vector-pathogen interactions.
- Standardizes genetic backgrounds, improving reproducibility and assay comparability.
- Enables quantitative assessment of gene function through PCR-based genotyping and phenotypic analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns vector genetic models with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from gene discovery to preclinical validation of vector-targeted interventions.
- Reduces risk in advancing vector control strategies by enabling mechanistic studies in a natural disease vector.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling the generation of genetically modified sand fly lines for hypothesis-driven studies.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene function in vector competence.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined models for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative PCR-based genotyping to confirm targeted mutagenesis.
- Translational Research: Bridges basic vector biology with translational studies on disease transmission.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative gene function studies in sand flies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vector biology and target validation.
- Operational Value: Standardizes genetic manipulation in a previously intractable vector species.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for vector-targeted R&D programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of vector control and transmission-blocking strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection and sand fly colony maintenance.
- Demands specialized instrumentation for embryo handling and injection.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation may be needed for other non-model vector species.
- Embryo viability and humidity sensitivity impose practical throughput limitations.
