3D细胞打印缺氧肿瘤芯片用于模拟实体癌的病理进展

缺氧是驱动癌症发展的重要因素，可诱导基因组不稳定性和肿瘤发生。我们展示了一种基于3D生物打印技术在体外构建实体癌中心缺氧区域的方法。利用该方法，通过结合3D打印的透气屏障与玻璃盖玻片这一简单策略，即可重现放射状缺氧梯度。

这种缺氧肿瘤芯片技术可用于预测药物疗效，从而促进针对患者的个体化抗癌药物处方。同时，该技术还有望实现对侵袭性癌症的快速诊断。为协助制备3毫升中和胶原蛋白预凝胶溶液，将30毫克胶原蛋白海绵切成5×5平方毫米的片状。

将组织块放入无菌的10毫升玻璃小瓶中，加入2.4毫升经0.2微米注射器滤器过滤的0.1 N盐酸，在4°C、15转/分钟条件下孵育三天。消化完成后，通过40微米细胞滤筛过滤未消化的胶原颗粒，并将酸溶性胶原溶液在4°C保存，最长可保存七天。为调节1%中和胶原预凝胶溶液的pH值，加入30微升酚红溶液至终浓度1%，并加入300微升10× PBS至终浓度10%。混匀后离心，使用1 N氢氧化钠将pH中和至7，通过颜色变化确认中和效果，并加入蒸馏水定容至总体积3毫升。

然后将pH调整后的1%中和胶原蛋白预凝胶溶液在4摄氏度保存，于三天内使用。为预先检测中和胶原蛋白预凝胶溶液的凝胶化情况，使用正向置换移液器将50微升胶原蛋白液滴加入小培养皿中，并将液滴置于37摄氏度培养箱中孵育1小时。孵育结束后，检查胶原蛋白是否由透明状态转变为不透明的白色。

倾斜容器，确认胶原蛋白已附着在容器底部。将 PBS 缓冲液倒入液滴中，以确认胶原蛋白结构在溶液中不会破裂。对于牺牲性 PEVA 模具的 3D 打印，请点击“文件”并选择保存文件类型为 STL，将 3D CAD 文件转换为 STL 文件，然后点击“选项”并设置输出格式为 ASCII，以生成 G 代码。

要导入生成的 STL 文件，请点击“文件”并打开 STL 文件，然后选择已保存的 STL 文件。为自动生成牺牲性 PEVA 模具的 G 代码，需选择 STL-CAD 转换器的切片模型。随后，为生成芯片制备的打印路径，使用 50 针精密喷嘴，在 500 千帕气动压力和 110 摄氏度条件下，将牺牲性 PEVA 模具打印至无菌亲水性组织学载玻片上。

为了制备PDMS屏障，将6毫升PDMS基础弹性体与600微升固化剂在塑料储液器中混合5分钟，然后将均匀混合的溶液装入一支10毫升的一次性注射器中。为注射器安装一个20号塑料锥形分配头，并用混合好的PDMS溶液填充可牺牲的PEVA模具。混合后的PDMS将填充该可牺牲的PEVA模具，形成凸面，且形成的屏障高度将高于模具本身。

为避免熔化PEVA，在40摄氏度烘箱中固化PDMS屏障超过36小时后，使用精密镊子剥离牺牲性PEVA模具，并在120摄氏度下通过高压灭菌器对透气屏障进行灭菌。将溶液与癌细胞混合时，将每种收集的细胞沉淀重悬于20微升培养基中，并在湿冰上轻轻混合的条件下，向每种重悬的细胞悬液中加入1毫升1%中和胶原蛋白预凝胶溶液。使用正向置换移液器混匀每种细胞悬液。

当获得均一溶液后，使用一次性正向移液器将包埋细胞的胶原蛋白生物墨水转移至各个三毫升一次性注射器中，并在四摄氏度保存，直至进行三维细胞打印。对于癌-间质同心环的三维打印，将相应的三维CAD文件转换为STL文件格式，并使用STL-CAD转换器生成癌-间质同心环的G代码。将包埋细胞的胶原蛋白生物墨水装载至三维打印机喷头中，并将喷头和打印平台的温度设置为15摄氏度。

将生成的打印路径载入3D打印机的控制软件中，点击“开始”，在15摄氏度条件下，使用18号塑料针头和约20千帕的气动压力，根据加载的G代码将胶原蛋白生物墨水打印到透气屏障上。每次打印操作结束后，手动将一片灭菌的22毫米×50毫米玻璃盖片放置在透气屏障上方，以形成低氧梯度。生成三个低氧肿瘤芯片后，将芯片转移至37摄氏度培养箱中孵育一小时，使胶原蛋白生物墨水交联。

当所有缺氧肿瘤芯片打印完成后，使用细胞刮刀轻轻擦拭盖玻片顶部的透气屏障，以实现紧密贴合。为在不脱离肿瘤结构的前提下更换芯片中的细胞培养基，将芯片倾斜，并用移液器向每个芯片的一侧加入1.5毫升内皮细胞生长培养基。该缺氧肿瘤芯片设计为同心环结构，旨在模拟肿瘤组织中观察到的径向氧扩散与耗竭现象。

在定义了氧气在其中扩散并被细胞消耗的空间控制体积后，可通过计算有限元分析确定产生中心缺氧所需的适当细胞密度。经过3D细胞打印，可构建分区的癌-间质同心环结构，以重现实体瘤的解剖特征。定量结果显示，打印后的细胞活力通常高于96%，证实制造条件适用于癌细胞和间质细胞。

在此代表性分析中，通过比较有无氧梯度的两组，以验证缺氧梯度对癌症进展的影响。在两种条件下，外周区域均存在成熟的 CD31 阳性内皮细胞，表明利用 3D 生物打印技术成功构建了具有空间模式的活体结构。与无氧梯度条件相比，有氧梯度条件显示出缺氧梯度，提示 HIF1 alpha 呈梯度表达。

还观察到SHMT2阳性的假栅栏状细胞和SOX2阳性的多能细胞，提示存在实体瘤的侵袭性病理生理特征。这种缺氧型“器官芯片”癌症模型是研究实体瘤病理生理特性以及癌细胞与促肿瘤微环境之间动态相互作用的有力工具。由于该方法可在合理的时间范围内适用于个体化药物设计，因此有望弥合体内与体外癌症模型之间的差距。