2021年2月6日
我们提供一个详细的协议,电穿孔中化RNA干扰昆虫的顺序奥多纳塔(龙和水坝自体)使用蓝尾大坝自己(伊施努拉塞内加尔:科埃纳吉罗尼达:Zygoptera)和皮鱼掠食(伪themis zonata:利贝鲁利达:阿诗兰图。
这是一种用于奥多纳塔电穿孔中位RNA干扰方法的视频协议。龙和水坝,秩序奥多纳塔的成员,是最祖先的昆虫之一。成人奥多纳塔在身体颜色和图案上表现出显著的多样性,并且已经进行了许多生态和行为研究。
然而,由于基因功能分析非常困难,对奥多纳塔的分子遗传学研究一直缺乏。例如,传统的RNAi方法对奥多纳塔物种无效。最近,我们建立了一种与体内电穿孔相结合的RNM方法。
在这里,我们为电穿孔的RNAi提供了一个视频协议,既包括蛾子,也包括水坝。作为我们代表性的水坝物种,我们自己使用蓝尾水坝。Ischnura 塞内加尔。
这是最常见的水坝物种之一,经常出现在日本阳光明媚的池塘。首先,我们展示RAI协议,针对一个水坝的腹部,伊施努拉塞内加尔。在冰冷麻醉后,在原盘两侧的两个针脚,并固定幼虫到固定支架上。
使用钳子拉动和拉伸第七和第八腹部段之间的段间膜。保持部际膜用手拉伸。将准备好的毛细管的尖端插入拉伸的分段膜中。
注射1微升的siRNA或dsRNA溶液。使用钳子在幼虫表面涂抹两滴超声波凝胶。将电极放在超声波凝胶上,在注射的一侧放置正极。
使用电穿孔器生成 10 次电穿孔脉冲。用纸焊擦去表面的剩余凝胶。取出昆虫针,将经过处理的幼虫放在湿纸巾上大约一天,以进行恢复。
接下来,我们展示RAI协议,该协议针对的是大坝的胸口,伊施努拉·塞内森西斯。冰冷麻醉后,在原盘两侧连接两个针脚,将幼虫固定在固定支架上。用手拉和拉伸前三角和合成器之间的分段膜。
将准备好的毛细管的尖端插入拉伸的分段膜中。注射一微升的siRNA或dsRNA溶液。用钳子在幼虫表面涂抹两滴超声波凝胶。
将电极放在超声波凝胶上,注射侧有正极。使用电丙子生成 10 次电穿孔脉冲。用纸焊擦去表面的剩余凝胶。
取出昆虫针,将经过处理的幼虫放在湿纸巾上大约一天,以进行恢复。作为一个具有代表性的喵鱼种,我们使用皮德掠食者。伪特米斯 · 佐纳塔
这是最常见的龙类之一,经常出现在日本阴凉的池塘里。最后,我们显示了RMIS协议针对一只小动物的腹部,伪僵尸佐纳塔。在第四和第五腹部段之间拉伸分段膜。
在第四和第五腹部段之间用细针做一个小孔。将准备好的毛细管的尖端插入准备好的孔中。注射一微升的siRNA或dsRNA溶液。
使用销将幼虫固定在固定支架上。使用钳子在幼虫表面涂抹两滴超声波凝胶。将电极放在超声波凝胶上,将正极放在喷射侧。
使用电穿孔器生成 10 次电穿孔脉冲。用纸焊擦去表面的剩余凝胶。取出昆虫针,将经过处理的幼虫放在湿纸巾上大约一天,以进行恢复。
在这里,我们选择了黑色素合成基因MCO2作为靶基因,而EGFP或bla作为负控制靶点。MCO2对于各种昆虫的黑颜色形成至关重要。首先,我们显示的结果在希努拉塞内加内森西斯的腹部。
白色箭头表示压抑的黑色色素沉着区域,其中正极被放置在电穿孔上。通过siRNA治疗和dsRNA治疗,观察到色素沉着的孵化。RNI表型的大小和位置在个体之间差别很大。
没有电穿孔,没有RNI表型被观察到,表明电穿孔对于该物种的RNI至关重要。接下来,我们展示在希努拉塞内加内森西斯的胸图的结果。同样,在正极置于电穿孔区域周围也观察到黑色色素沉着的抑制。
最后,我们显示了伪特米斯佐纳塔腹部的结果。正如预期的那样,在正极被放置在电穿孔区域周围检测到RNI表型。我们确认电丙化调理RNAi方法在奥多纳塔非常有用。
它可以诱导局部基因抑制几乎100%的效率。至少在表皮,当我们选择适当的发展阶段。此方法在 CRISPR/Cas9 方法上具有多个方法。
例如,RNAi 表型出现区域可以通过电位时正极的位置进行控制,并且 RNA 表型可以很容易地与同一个体中并排的受控表型进行比较。此外,这种方法不需要微注射到微小的鸡蛋。因此,与CRISPR/Cas9方法更快观察表型要容易、更快。
此外,这种方法可以应用于新产的卵子难以收集的昆虫。例如,伪僵尸佐纳塔的女性在飞行过程中产卵。因此,收集他们新产的鸡蛋是非常困难的。
我们预计,当常规 RNI 不能有效工作时,此协议可能一般适用于非模型生物体。
本文介绍了一种详细的电穿孔介导RNA干扰(RNAi)协议,专门针对蓝尾小蜻蜓(Ischnura senegalensis)和白斑沙蜓(Pseudothemis zonata)。该方法解决了这些昆虫基因功能分析中的挑战,为分子遗传学研究提供了一种可靠的技术。
Electroporation-mediated RNA interference (RNAi) in Odonata enables functional genomics in previously intractable insect systems, addressing a critical gap in target validation for non-model organisms. This method provides a robust platform for dissecting gene function in developmental, pigmentation, and morphogenesis pathways, supporting predictive confidence at early discovery inflection points. Its applicability to species with challenging life cycles expands the portfolio of tractable models for biopharma R&D.
This electroporation-mediated RNAi protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model development, particularly for non-model and ecologically relevant species.