睡眠美人转座转染人视网膜色素上皮细胞氧化应激的诱导与分析
December 11th, 2020
我们提出了一种开发和使用氧化应激模型的方案，方法是用H2O2处理视网膜色素上皮细胞，分析细胞形态，活力，密度，谷胱甘肽和UCP-2水平。它是研究转座子转染细胞分泌的蛋白质治疗神经视网膜变性的抗氧化作用的有用模型。
过氧化氢模型是一种简单而有效的方法，用于评估可能有助于治疗年龄相关性黄斑变性或类似神经退行性疾病的因子的抗氧化作用。氧化剂过氧化氢以单脉冲方式输送，与必须重复过氧化氢处理数天的模型相比，其执行速度更快、更简单。由于接种的细胞数量会影响处理的氧化效应，因此在培养前仔细计数细胞非常重要。
演示该程序的是 Gabriele Thumann 实验室的博士后 Thais Bascuas。对于条件培养基制备，在转染 PEDF、GM-CSF 或两者后 28 天，从每毫升完全培养基浓度的 500， 000 个细胞中接种人 ARPE-19 细胞系 T-75 培养瓶。当细胞达到约 80% 汇合时，用新鲜的完全培养基替换上清液，并在 24 小时后收集新的上清液。
为了纯化组氨酸标记的 GM-CSF 和 PEDF 蛋白，离心上清液以去除潜在的剩余细胞，并将样品放在一边。接下来，将 30 微升镍 NTA 溶液添加到 1.5 毫升试管中。离心后，丢弃镍 NTA 流通液，每次洗涤用 200 μL 1X 孵育缓冲液洗涤沉淀两次。
第二次洗涤后，将沉淀重悬于 40 μL 4X 孵育缓冲液和 900 μL 离心条件培养基中。将条件培养基溶液在室温下孵育 1 小时，每分钟旋转 70 次。孵育结束时，离心样品并洗涤沉淀两次，每次洗涤 175 μL 1X 孵育。
第二次洗涤后，加入 20 μL 洗脱缓冲液，在室温下以每分钟 70 转的速度孵育 20 分钟。孵育结束时，离心样品。将上清液放在一边，根据标准方案定量 BCA 蛋白测定洗脱的总蛋白。
对于用条件培养基和过氧化氢处理未转染的视网膜色素上皮细胞，将 3000 个细胞接种到 200 μL 完全培养基中，放入 96 孔板的每个孔中，在细胞培养箱中孵育 24 小时。第二天早上，用每孔 200 μL 条件培养基替换上清液，并将细胞放回细胞培养箱中 10 天。在培养的第 11 天，用 350 微摩尔过氧化氢的完全培养基处理细胞 24 小时。
对于用纯化或商业 PEDF 和/或 GM-CSF 处理未转染的 RPE 细胞，将 3000 个细胞接种在 200 μL 完全培养基中，每孔补充有 500 ng/mL 重组 PEDF 和/或 50 ng/mL 重组 GM-CSF，在细胞培养箱中孵育 48 小时。孵育结束时，用每孔含有 350 微摩尔过氧化氢和 500 ng/mL PEDF 和/或 50 ng/mL GM-CSF 的完全培养基替换上清液，持续 24 小时。对于转染 RPE 细胞的过氧化氢处理，在细胞培养箱中用 200 μL 完全培养基培养 5， 000 个转染细胞 24 小时，然后用 350 μmol 过氧化氢处理细胞，如图所示。
为了测量过表达 PEDF 和/或 GM-CSF 的转染细胞或过氧化氢处理后用生长因子预处理的未转染细胞中产生的谷胱甘肽水平，用每孔 100 μL 新鲜制备的 1X 试剂混合物替换每个孔中的上清液，并在定轨振荡器上以每分钟 500 转的速度将细胞与试剂混合物混合 14 秒。摇动后，将板在室温下孵育 30 分钟，然后向每个孔中加入 100 μL 重构的荧光素检测试剂。在摇床上混合溶液 15 秒，然后在室温下孵育 15 分钟。
孵育结束时，将板加载到酶标仪上，然后选择 Change Layout。在"基本参数"选项卡下，应选择 96 孔板和顶部光学元件，并将定位延迟设置为 0.1，将"测量开始时间"设置为零，将"测量间隔时间"设置为"1"，将"归一化结果时间"设置为零。定义空白、标准品和样品，然后单击 Start measurement（开始测量）。
然后将数据导出为电子表格文件，并通过标准曲线的插值计算每个样品中谷胱甘肽的浓度。为了测量细胞活力，用每孔补充 1% FBS 的 100 微升完全培养基替换每个孔中的上清液，并将细胞放入细胞培养箱中直至分析。从培养物中收集未处理的 ARPE-19 细胞后，在补充有 1% FBS 浓度的 DMEM Hams F-12 培养基中以每毫升 100， 000 个细胞的比例重悬细胞。
接下来，在 200 微升补充有 1% FBS 的培养基中制备 7 个连续的 1：1 稀释液，并将 100 微升每种标准液一式两份转移到 96 孔板的适当孔中。向所有孔中加入 50 μL 新鲜制备的试剂混合物，在摇床上将细胞与混合物混合 15 秒，然后在室温下孵育板 15 分钟。在孵育结束时，测量所示的发光。
获得测量结果后，向每个孔中加入 50 微升裂解试剂，在室温下孵育 15 分钟，然后再次测量发光并使用公式计算活细胞的百分比。用 50 微摩尔和 100 微摩尔的过氧化氢处理 24 小时不会影响细胞内谷胱甘肽的产生，而当用 350-500 或 700 微摩尔的过氧化氢处理细胞时，观察到谷胱甘肽的显着减少浓度。从形态学上讲，随着化合物浓度的增加，过氧化氢处理的细胞看起来分布较少且更圆润。
对于用过氧化氢处理的 PEDF 和 GM-CSF 转染细胞，这种影响不太明显。需要注意的是，细胞数量会影响过氧化氢介导的氧化应激，因为在仅接种 5， 000 个细胞的孔中，过氧化氢处理后谷胱甘肽水平在统计学上显着降低。在氧化条件下，与未处理的对照细胞相比，用 PEDF 和/或 GM-CSF 处理或转染表达 PEDF 和/或 GM-CSF 的细胞产生更多的谷胱甘肽。
此外，过氧化氢后 PEDF 和 GM-CSF 转染细胞中 UCP2 基因表达水平增加，尽管增加没有统计学意义。对暴露于过氧化氢的 GM-CSF 转染细胞裂解物的磷酸化 AKT 进行蛋白质印迹分析，结果显示，与未处理的对照细胞相比，磷酸化仅略有降低，表明 GM-CSF 可以保护细胞免受氧化应激损伤。以正确的密度接种细胞，使用新鲜的过氧化氢溶液，并向培养基中添加新鲜蛋白质，这一点很重要。
一旦使用过氧化氢模型证实了生长因子的抗氧化作用，就可以在氧化应激相关的眼部疾病模型中测试这些因子。目前的过氧化氢氧化应激模型允许评估不同因素可能产生的抗氧化作用，因此支持新基因疗法的开发。
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概述
本文介绍了一种使用过氧化氢建立氧化应激模型以处理视网膜色素上皮细胞的协议。该模型旨在分析各种细胞参数，并研究蛋白质对神经视网膜变性的抗氧化作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 眼科学
背景
- 年龄相关性黄斑变性是一种常见的神经退行性疾病。
- 氧化应激在视网膜细胞损伤中起着重要作用。
- 过氧化氢是细胞模型中广泛使用的氧化剂。
- 了解抗氧化机制可以导致新的治疗策略。
研究目的
- 建立使用H2O2的可靠氧化应激模型。
- 评估分泌蛋白对细胞活力和形态的影响。
- 提供有关神经视网膜变性潜在治疗的见解。
使用的方法
- 用单次脉冲H2O2处理视网膜色素上皮细胞。
- 评估细胞形态、活力和密度。
- 测量谷胱甘肽水平和UCP-2表达。
- 从转染细胞制备条件培养基。
主要结果
- 证明了单次脉冲H2O2处理的有效性。
- 确定了治疗后细胞形态和活力的变化。
- 测量了谷胱甘肽和UCP-2水平的显著变化。
- 为测试抗氧化蛋白提供了框架。
结论
- 氧化应激模型是研究的有价值工具。
- 研究结果支持抗氧化蛋白在治疗中的潜力。
- 未来的研究可以在此模型基础上探索新的治疗方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Oxidative stress models are essential for de-risking neuroprotective targets in retinal degeneration programs. This hydrogen peroxide-based assay enables rapid, quantitative evaluation of secreted factors like PEDF and GM-CSF for antioxidant potency. It supports early target validation by linking molecular mechanisms to functional cell survival outcomes under disease-relevant stress.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis of neuroprotective factor secretion in mitigating oxidative damage.
- Operational Value: Enables functional validation of PEDF and GM-CSF as secreted proteins with antioxidant activity.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating glutathione restoration and UCP2 expression with cell viability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, single-pulse H2O2 treatment for reproducible oxidative stress induction.
- Quantitative Output: Measures glutathione levels, UCP2 expression, and viability as multiparametric readouts.
- Scalability: Compatible with 96-well format for screening conditioned medium or purified proteins.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models oxidative stress mechanisms implicated in AMD and neurodegenerative pathologies.
- Translational Continuity: Bridges secreted protein function to cellular protection in RPE, a key retinal support cell.
- Mechanistic De-risking: Evaluates whether secreted factors mitigate oxidative stress before in vivo testing.
Pipeline & Workflow Integration
This assay fits within early discovery to preclinical transition, enabling iterative testing of neuroprotective candidates.
- Discovery Biology: Tests hypothesis that secreted PEDF and GM-CSF reduce oxidative stress in RPE cells.
- Screening: Conditions medium or purified proteins for antioxidant activity in a high-throughput compatible format.
- Analytics: Glutathione, UCP2, and viability measurements provide quantitative, normalized data for comparison.
- Translational Research: Links molecular effectors to phenotypic rescue in oxidative stress models.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to other secreted factors or cell types in neurodegeneration programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking secreted factors to antioxidant responses.
- Operational Value: Standardized cell seeding and H2O2 dosing improve reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions on neuroprotective targets using functional, not just biochemical, readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene therapy candidates based on oxidative stress protection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection, and protein purification via nickel NTA.
- Depends on accurate cell counting and consistent H2O2 preparation for reliable oxidative stress induction.
- Needs standardized protocols for glutathione and viability assays using luminometric detection.
- Adaptation to other models requires validation of oxidative stress levels and readout relevance.
- Practical limitation: Model uses acute H2O2 pulse; may not fully replicate chronic oxidative stress in vivo.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Conditioned Medium Preparation and Collection
2:47
Treatment of RPE Cells with Growth Factors and H2O2
4:33
Glutathione Assay
6:00
Cytotoxicity Assay and Microscopic Analysis
7:24
Results: Representative Oxidative Stress Induction and Analysis
9:10
Conclusion
