Name: 睡眠美人转座转染人视网膜色素上皮细胞氧化应激的诱导与分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习利用过氧化氢单次脉冲处理人视网膜色素上皮细胞建立氧化应激模型，评估PEDF和GM-CSF等抗氧化蛋白对神经视网膜退行性疾病的潜在治疗作用。

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作者谨此感谢 Gregg Sealy 和 Alain Conti 提供出色的技术支持，并感谢柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的 Zsuzsanna Izsvák 教授慷慨提供 pSB100X&#160; 和 pT2-CAGGS-Venus&#160; 质粒。本研究由瑞士国家科学基金会和欧洲委员会在第七框架计划背景下资助。Z.I. 由欧洲研究理事会高级资助项目 [ERC-2011-ADG 294742] 资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案提供了一种分析转染细胞所产生的PEDF和GM-CSF抗氧化及保护功能的方法，该方法可适用于转染了任何假定有益基因的细胞。在以移植基因修饰细胞将蛋白质递送至组织为目的的基因治疗策略中，获取有关蛋白表达水平、表达持续时间以及所表达蛋白在疾病模型中功效的信息至关重要。在本实验室中，该方案已成功用于明确PEDF和GM-CSF在氧化应激中的作用效果，而氧化应激已被假定为年龄相关性黄斑变性（aAMD）发病机制中的重要环节。6,7具体而言，我们已采用该方案来界定抗氧化作用 SB100X介导的PEDF/GM-CSF转染原代hRPE细胞。多位研究者已证实，H2O2 诱导显著的氧化应激症状，但仍允许细胞再生28,29,38，这与我们的实验结果相似，已证明350 µM浓度作用24小时可...

此处描述的模型为评估生物制药制剂在降低细胞氧化应激方面的有效性提供了一种有用的方法。我们已利用该模型研究了PEDF和GM-CSF对H2O2介导的氧化应激对视网膜色素上皮细胞的影响，这些细胞暴露于高水平的O2以及可见光，并吞噬感光细胞外节膜，从而产生大量活性氧（ROS）1,2它们被认为是非血管性年龄相关性黄斑变性（aAMD）发病机制中的主要致病因素3,4,5,6,7,8此外，视网膜色素上皮（RPE）合成的神经保护因子减少，特别是色素上皮衍生因子（PEDF）、类胰岛素生长因子（IGFs）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），导致RPE细胞功能障碍及其丢失，进而引起光感受器细胞和视网膜神经节细胞（RGC）死亡3,4,5. 年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种复杂的疾病，由代谢、功能、遗传和环境因素之间的相互作用引起4. 在工业化国家，年龄超过60岁的患者因缺乏对aAMD的治疗方法，是导致失明的主要原因9,10通过视网膜下移植过表达PEDF和GM-CSF的基因修饰RPE细胞，重建具有神经保护和神经再生作用的视网膜微环境，有望通过减轻氧化应激损伤、抑制炎症反应并支持细胞存活，从而防止视网膜退行性变11,12,13,14,15,16尽管存在多种将基因递送至细胞的方法，我们仍选择了非病毒性高活性 睡美人 转座子系统以递送 PEDF 和 GM-CSF 由于其安全性、能够将基因整合到宿主细胞基因组中，以及倾向于将递送的基因整合至非转录活性位点（如我们先前所示）的特性，将基因递送至RPE细胞17,18,19.
细胞氧化应激可通过多种氧化剂在体外培养细胞中诱导产生，包括过氧化氢（H₂O₂）2O2）、4-羟基壬烯醛（HNE）、叔丁基过氧化氢（tBH）、高氧张力以及可见光（全光谱或紫外照射）20,21高氧张力和光照需要特殊的设备和条件，这限制了向其他系统的可转移性。H等试剂2O2，HNE 和 tBH 会诱导产生重叠的氧化应激分子与细胞变化。我们选择了 H2O2 为了检测PEDF和GM-CSF的抗氧化活性，因为该物质由视网膜色素上皮（RPE）细胞在光感受器外节吞噬过程中作为活性氧中间体产生，具有操作简便性和生物学相关性22 并且在体内存在于眼部组织中23. 由于谷胱甘肽的氧化可能部分介导了H2O2 在眼部研究中，我们分析了谷胱甘肽（GSH）的水平，其与H相关2O2诱导的氧化应激与细胞的再生能力21,22谷胱甘肽水平的分析尤为重要，因其参与了眼部的抗氧化保护机制24. 暴露于 H2O2 常被用作研究视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化应激敏感性及抗氧化活性的模型1,25,26,27,28,29,30，并且还表现出与光诱导的氧化应激损伤的相似性，一种 &#34;生理的&#34; 氧化应激的来源21.
为了评估神经保护因子的功能性和有效性，我们建立了一种体外模型，可用于分析经基因改造过表达PEDF和GM-CSF的细胞所表达的生长因子的抗氧化作用。在此，我们证明，转染了PEDF和GM-CSF基因的视网膜色素上皮（RPE）细胞相较于未转染的对照细胞，对H2O2的有害作用具有更强的抵抗力，这一结论通过细胞形态、密度、存活率、细胞内谷胱甘肽水平以及UCP2基因的表达得以证实。UCP2基因编码线粒体解偶联蛋白2，该蛋白已被证实可降低活性氧（ROS）水平31。

<table><tbody><tr><td>24孔板</td><td>康宁</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>格雷纳</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>96孔培养板，白色，透明平底&amp;nbsp;</td><td>Costar</td><td>3610</td><td>可在进行发光检测（GSH-Glo Assay）前检查细胞状态</td></tr><tr><td>96孔板</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺 40%</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>AMIMED</td><td>4-05F00-H</td><td></td></tr><tr><td>抗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PA5-24184</td><td></td></tr><tr><td>抗体 抗小鼠 IgG/IgA/IgM&amp;nbsp;</td><td>安捷伦</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>抗体抗PEDF&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-390172</td><td></td></tr><tr><td>抗五聚组氨酸抗体&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化-Akt 抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>抗体 anti-rabbit IgG H&amp;amp;L-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔Alexa Fluor 594抗体&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>抗体 山羊抗小鼠 Alexa 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>ARPE-19细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td></td></tr><tr><td>BSA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-500G</td><td></td></tr><tr><td>腔室培养玻片</td><td>康宁</td><td>354118</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo 细胞毒性检测&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Duo Set ELISA试剂盒</td><td>R&amp;amp;D Systems&amp;nbsp;</td><td>DY215-05</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>ELISAquant 试剂盒</td><td>BioProducts MD</td><td>PED613-10-人类</td><td></td></tr><tr><td>眼睛（人类）</td><td>Lions Gift of Sight 眼库（美国明尼苏达州圣保罗市）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>布伦施维格</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount 水性封片介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega 酶标仪&amp;nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件（版本 8.0）</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH-Glo 谷胱甘肽检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>V6912</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢（H₂O₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>默克</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件（图像处理程序）</td><td>W.S. Rasband，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院（NIH）；https://imagej.nih.gov/ij/；1997&amp;ndash;2014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>咪唑&amp;nbsp;</td><td>Axonlab</td><td>A1378.0010</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI4000B 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 仪器 II&amp;nbsp;</td><td>罗氏分子系统公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SW1.5.1 软件</td><td>罗氏分子系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Axonlab</td><td>3468.1000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统 10 &amp;micro;L 型试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>马里恩费尔德-上部</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-3197</td><td></td></tr><tr><td>Omega Lum G 凝胶成像系统</td><td>Aplegen 生命科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1×</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quantabio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PFA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>引物&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td></td><td>参见补充材料中的表1</td></tr><tr><td>pSB100X (250 ng/&amp;micro;L</td><td></td><td></td><td>M&amp;aacute;t&amp;eacute;s 等，2009。由 Zsuzsanna Izsvak 教授提供</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His 质粒 DNA（250 ng/&amp;micro;L</td><td></td><td></td><td>使用 Johnen, S. 等人（2012）在 IOVS, 53 (8), 4787-4796 中报道的现有 pT2-CMV-PEDF-EGFP 质粒构建而成。</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-His 质粒 DNA（250 ng/&amp;micro;L</td><td></td><td></td><td>使用 Johnen S. 等人（2012）在 IOVS, 53 (8), 4787-4796 中报道的现有 pT2-CMV-PEDF-EGFP 质粒构建。</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>重组hGM-CSF&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>重组hPEDF&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BioProductsMD</td><td>004-096</td><td></td></tr><tr><td>ReliaPrep RNA 细胞微量提取系统</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td></td></tr><tr><td>RIPA缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Applichem</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>用于WB的半干式转膜系统&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperMix qScript</td><td>Quantabio</td><td>95048-025</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐溶液（TBS）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>AppliChem&amp;nbsp;</td><td>A1390</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL HRP 底物</td><td>Advansta</td><td>K-12045-D50</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 硝酸纤维素膜</td><td>Chemie Brunschwig</td><td>MNSC04530301</td><td></td></tr></tbody></table>

诱导与分析sleeping beauty转座子转染的人视网膜色素上皮细胞中的氧化应激

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

氧化应激在多种退行性疾病中发挥关键作用，包括年龄相关性黄斑变性（AMD），这是一种全球约影响3000万患者的病理状态。氧化应激可导致视网膜色素上皮（RPE）细胞合成的神经营养保护因子减少，例如色素上皮衍生因子（PEDF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），继而引发RPE细胞丢失，最终导致光感受器细胞和视网膜神经节细胞（RGC）死亡。我们假设，通过视网膜下移植过表达PEDF和GM-CSF的转染RPE细胞，重建具有神经营养保护和神经发生潜能的视网膜微环境，有望通过减轻氧化应激损伤、抑制炎症反应以及促进细胞存活来防止视网膜退行性病变。利用 睡美人 转座子系统（SB100X人RPE细胞已转染了 PEDF 和 GM-CSF 基因，并利用qPCR、Western印迹、ELISA和免疫荧光证实了稳定的基因整合、长期的基因表达及蛋白质分泌。为确认其功能性和效力 PEDF 和 GM-CSF 由转染的RPE细胞分泌，我们已开发出一种体外检测方法，用于定量分析H的减少程度2O2诱导的氧化应激对培养的RPE细胞的影响。通过分析细胞形态、密度以及细胞内谷胱甘肽水平来评估细胞保护作用， UCP2 基因表达和细胞活力。与未经处理的对照组相比，转染后过表达PEDF和/或GM-CSF的RPE细胞，以及未经转染但经PEDF和/或GM-CSF预处理（使用市售产品或从转染细胞中纯化获得）的细胞，均表现出显著的抗氧化细胞保护作用。本研究中的H2O2-模型是一种简单而有效的方法，用于评估可能对治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）或类似神经退行性疾病有效的因素的抗氧化作用。

人视网膜色素上皮细胞中氧化应激的诱导 
ARPE-19 细胞和原代 hRPE 细胞用不同浓度的 H2O2 处理 24 小时，并定量检测细胞内抗氧化剂谷胱甘肽的水平（图 2A、B）。50 µM 和 100 µM 的 H2O2 对谷胱甘肽的生成无明显影响，而在 350 µM 浓度下，ARPE-19 细胞和原代 hRPE 细胞中的谷胱甘肽水平均显著降低。细胞毒性分析显示，350 µM 是 H2O2 引起细胞活力显著下降的最低浓度（图 2C）。形态学上，经 H2O2 处理的 ARPE-19 细胞铺展减少、更趋圆形，且随着 H2O2 浓度升高，这些特征更加明显（<strong...

我们介绍一种通过过氧化氢（H2O2）处理视网膜色素上皮细胞以建立和使用氧化应激模型的实验方案，用于分析细胞形态、活力、密度、谷胱甘肽水平及UCP-2表达水平。该模型可用于研究转座子转染细胞所分泌蛋白对神经视网膜变性的抗氧化作用。

诱导与分析Sleeping Beauty转座子转染的人视网膜色素上皮细胞中的氧化应激

氧化应激在多种退行性疾病中发挥关键作用，包括年龄相关性黄斑变性（AMD），这是一种影响约30 ...

过氧化氢模型是一种简单且有效的研究方法，可用于评估某些因素在治疗年龄相关性黄斑变性或类似神经退行性疾病中可能具有的抗氧化作用。该模型通过单次脉冲方式施加氧化剂过氧化氢，相较于需要连续数天重复处理的模型，操作更为快速简便。由于接种细胞的数量会影响处理的氧化效应，因此在细胞培养前仔细计数细胞至关重要。进行该实验操作的是Gabriele Thumann实验室的博士后Thais Bascuas。制备条件培养基时，在转染PEDF、GM-CSF或两者后的第28天，将人ARPE-19细胞系以每毫升完全培养基含500,000个细胞的浓度接种于T-75培养瓶中。当细胞融合度达到约80%时，弃去原有上清液，更换为新鲜的完全培养基，并在24小时后收集新的上清液。为了纯化带有组氨酸标签的GM-CSF和PEDF蛋白，先将上清液离心以去除可能残留的细胞，并将样品暂置。接着，向一个1.5毫升离心管中加入30微升镍-NTA溶液。离心后，弃去镍-NTA流穿液，并用200微升1×孵育缓冲液洗涤沉淀物，每次洗涤重复两次。第二次洗涤后，将沉淀重悬于40微升4X孵育缓冲液和900微升经离心的条件培养基中。室温下以每分钟70转的速度孵育条件培养基溶液1小时。孵育结束后，离心样品，并用175微升1X孵育缓冲液洗涤沉淀两次，每次洗涤使用175微升。第二次洗涤后，加入20 µL洗脱缓冲液，在室温下以70转/分钟的速度孵育20分钟。孵育结束后，离心样品，保留上清液，并根据标准操作流程通过BCA蛋白测定法对洗脱的总蛋白进行定量。对于未经转染的视网膜色素上皮细胞，采用条件培养基和过氧化氢处理时，将3000个细胞接种于96孔板的每孔中，每孔加入200 µL完全培养基，在细胞培养箱中孵育24小时。次日早晨，将各孔上清液更换为200 µL条件培养基，再将细胞放回细胞培养箱中继续培养10天。在培养的第11天，用含350 µmol/L过氧化氢的完全培养基处理细胞，持续24小时。对于未转染的RPE细胞使用纯化或商用PEDF和/或GM-CSF处理，将3000个细胞接种于每孔200微升完全培养基中，培养基中添加500纳克/毫升重组PEDF和/或50纳克/毫升重组GM-CSF，在细胞培养箱中孵育48小时。孵育结束后，弃去上清液，更换为含有350微摩尔过氧化氢以及500纳克/毫升PEDF和/或50纳克/毫升GM-CSF的完全培养基，每孔200微升，继续培养24小时。对于转染RPE细胞的过氧化氢处理，先将5,000个转染细胞接种于每孔200微升完全培养基中，在细胞培养箱中培养24小时，随后按照上述方法加入350微摩尔过氧化氢进行处理。为了检测转染后过表达PEDF和/或GM-CSF的细胞，或经生长因子预处理的非转染细胞在过氧化氢处理后产生的谷胱甘肽水平，将每孔中的上清液替换为100微升新鲜配制的1X试剂混合液，并在轨道摇床上以每分钟500转的速度将细胞与试剂混合液混匀14秒。振荡后，将培养板在室温下孵育30分钟，然后向每孔加入100微升重悬的荧光素检测试剂。在摇床上混合溶液15秒，随后在室温下孵育15分钟。孵育结束后，将酶标板放入酶标仪，选择“更改布局”。在“基本参数”选项卡下，选择96孔板和顶部光学检测模式，定位延迟设为0.1，测量开始时间设为0，测量间隔时间设为1，结果归一化时间设为0。定义空白孔、标准品和样品，然后点击“开始测量”。然后将数据导出为电子表格文件，并通过标准曲线的插值计算每个样品中谷胱甘肽的浓度。为检测细胞活力，将每孔中的上清液更换为100微升含1% FBS的完全培养基，每孔加样后将细胞置于细胞培养箱中孵育直至分析。收集未经处理的ARPE-19细胞后，用添加了1% FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，使其浓度为每毫升100,000个细胞。接下来，在含有1% FBS的200微升培养基中进行七次连续的1:1倍比稀释，并将每种标准品各100微升以复孔形式加入96孔板的相应孔中。向所有孔中加入50微升 freshly-prepared 试剂混合液，在振荡器上振荡15秒使细胞与混合液充分混匀，然后将板在室温下孵育15分钟。孵育结束后，按所示方法检测发光信号。获得测量结果后，向每个孔中加入 50 µL 裂解试剂，在室温下孵育 15 分钟，然后再次测量发光信号，并使用公式计算活细胞百分比。用 50 和 100 µM 过氧化氢处理 24 小时对细胞内谷胱甘肽的生成无明显影响，而当细胞用 350、500 或 700 µM 浓度的过氧化氢处理时，谷胱甘肽水平显著降低。从形态学上看，随着过氧化氢浓度的增加，处理后的细胞显得更不铺展，且更加圆润。对于经氢过氧化物处理的PEDF和GM-CSF转染细胞，该效应较不显著。需要注意的是，细胞数量会影响氢过氧化物介导的氧化应激，因为在仅接种5,000个细胞的孔中，经氢过氧化物处理后谷胱甘肽水平在统计学上显著降低。在氧化条件下，经处理或转染以表达PEDF和/或GM-CSF的细胞所产生的谷胱甘肽显著多于未经处理的对照组细胞。此外，PEDF 和 GM-CSF 转染细胞在过氧化氢处理后，UCP2 基因表达水平有所升高，尽管该升高无统计学意义。对暴露于过氧化氢的 GM-CSF 转染细胞裂解液进行磷酸化 AKT 的 Western 印迹分析，结果显示与未处理的对照细胞相比，其磷酸化水平仅轻微下降，表明 GM-CSF 能够保护细胞免受氧化应激损伤。实验中需注意以适当的密度接种细胞，使用新鲜的过氧化氢溶液，并向培养基中添加新鲜的蛋白质。在利用过氧化氢模型验证生长因子的抗氧化作用后，可进一步在与氧化应激相关的眼部疾病模型中测试这些因子。目前的过氧化氢诱导氧化应激模型可用于评估不同因子的抗氧化效果，从而支持新型基因疗法的开发。

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医学

睡眠美人转座转染人视网膜色素上皮细胞氧化应激的诱导与分析

检测氧化性细胞环境的一种筛选方法是测定CM-H2DCFDA的氧化程度。CM-H2DCFDA在细胞内被氧化后，会从无荧光状态转变为荧光化合物。这种荧光变化可通过流式细胞术进行检测，从而反映处于氧化环境中的细胞数量。...

猫星形胶质细胞系G355-5中氧化应激的筛选实验

本文报道了一种用于检测活体斑马鱼胚胎氧化应激的实验方案。该方法可实现对整个胚胎组织及单细胞群体中活性氧（ROS）的检测。本方案可同时完成定性与定量分析。...

斑马鱼胚胎中氧化应激的分析

非相干氙灯光源通过窄带干涉滤光片和中性密度滤光片，以向培养细胞递送不同波长和强度的光。该方案用于评估红光/近红外光治疗对活性物质生成的影响...

评估不同波长和强度的红光/近红外光疗法对氧化应激影响的方法 体外

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基于电穿孔技术利用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行遗传修饰

本实验方案描述了一种利用定性成像和定量流式细胞术检测小鼠肠道类器官中活性氧（ROS）的方法。该方法可进一步扩展至其他荧光探针，用于检测特定化合物对活性氧的影响。...

利用活性氧敏感型荧光探针对小鼠肠道类器官中的氧化应激进行分析

本文提出了一种系统化、易于操作且可重复的实验方案，用于通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针（DCFH-DA）检测穆勒胶质细胞（MGCs）中的细胞内活性氧（ROS）。该方法利用流式细胞仪对细胞内总活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便，适用性强，且具有良好的可重复性。...

使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针和流式细胞术定量穆勒胶质细胞中的活性氧物种

人视网膜色素上皮细胞（H-RPE）的代谢状态反映了其健康状况和功能。本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法检测H-RPE实时代谢通量的优化方案。...

利用高分辨率呼吸测定法对原代人视网膜色素上皮细胞中的生物能量学进行实时分析

我们介绍一种用于测量视网膜色素上皮（RPE）细胞培养中耗氧率（OCR）的新型装置。该装置可在标准细胞培养板上使用标准培养基，在标准细胞培养箱中连续数周对RPE细胞进行OCR测量。...

高度分化且极化的视网膜色素上皮细胞培养物中耗氧率的长期监测

介绍了一种使用无偏方法识别致癌未知驱动因素的技术。该方法利用 Sleeping Beauty...

使用连接介导的 PCR 鉴定实体瘤中 Sleeping Beauty 转座子插入位点

学习利用过氧化氢单次脉冲处理人视网膜色素上皮细胞建立氧化应激模型，评估PEDF和GM-CSF等抗氧化蛋白对神经视网膜退行性疾病的潜在治疗作用。

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