基于电穿孔技术利用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行遗传修饰

本方法展示了利用睡美人转座子系统，通过电穿孔法对原代人色素上皮细胞进行转染，并验证外源基因表达及蛋白分泌的效果。睡美人转座子系统与电穿孔技术的结合，可实现原代人色素上皮细胞的高效转染，并支持外源基因的稳定且持续表达以及蛋白的持续分泌。该研究的总体目标是建立一种基于细胞的基因增补疗法，用于治疗视网膜变性疾病，此类疗法需要治疗性活性蛋白的稳定且持续的分泌。

进行该操作演示的将是来自实验室的医学技术助理 Anne Freialdenhoven 和 Antje Schiefer。为准备用于原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞电穿孔的质粒 DNA，需使用微量分光光度计定量质粒 DNA 含量，并用 10 毫摩尔 Tris-HCl 将其浓度调整至 250 纳克/微升。取一份体积的 250 纳克/微升 SB100X 转座酶质粒 DNA 与十六份体积的 250 纳克/微升色素上皮衍生因子转座子质粒 DNA 混合。

将2 µL终末血浆混合物加入预冷的无菌1.5 mL安全锁微型离心管中，置于冰上，并在缓冲液管中加入3 mL缓冲液E。然后将试管插入移液工作站，直至听到咔嗒声，设置转染仪参数为1,100伏、20毫秒脉冲宽度，共施加两次脉冲。为电穿孔实验准备细胞时，首先通过相差显微镜观察原代RPE细胞培养物的形态，以评估其生长状态和融合度。

在细胞培养孵育箱中，每孔加入 500 微升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，处理 7 至 15 分钟。待细胞脱落后，通过离心收集细胞，用 1 毫升 PBS 重悬细胞，并将每转染反应分为 1 至 10 份细胞等分试样，每份含 10⁴ 个细胞，离心。每管中加入 11 微升缓冲液 R 重悬沉淀，并向每管加入 2 微升已制备的质粒混合物。

将转染移液器的头部插入10微升转染吸头中，直至夹子完全卡住活塞的安装杆，然后将细胞与质粒溶液加载到转染吸头中。将转染移液器插入放置在移液器工作站内的缓冲液管中，听到“咔哒”声后按下启动键，开始电穿孔过程。转染完成后，小心地将转染移液器从移液器工作站中取出，并立即用其将细胞与质粒溶液转移至已准备好的细胞培养板孔中。

从RPE细胞培养上清液中纯化带有his标签的色素上皮衍生因子融合蛋白。首先，使用斜切枪头为每个样品收集30微升镍-NTA悬浊液，并通过离心沉淀镍-NTA树脂。随后，用200微升1×孵育缓冲液小心重悬镍-NTA树脂，并额外进行两次离心沉淀。

第二次离心后，每份样品用 40 微升 4× 孵育缓冲液小心重悬镍 NTA 树脂沉淀。接下来，将一份预处理的镍 NTA 悬液 55 微升与 260 微升 4× 孵育缓冲液及 900 微升每种转染的 RPE 细胞培养上清液混合。将混合物在室温下于摇床上孵育 60 分钟，然后再次离心收集镍 NTA 树脂混合物。

将沉淀物小心地重悬于 175 微升 One X 孵育缓冲液中，并将混合物再离心两次。第二次离心后，将镍 NTA 树脂沉淀物小心地重悬于 30 微升洗脱缓冲液中，在室温下振荡孵育 20 分钟，然后再次离心样品。随后小心收集上清液，并与 Two X SDS 上样缓冲液混合，用于纯化蛋白的 Western 印迹分析。

从人类供体眼球分离培养的原代视网膜色素上皮（RPE）细胞表现出典型的鹅卵石样形态，且不受供体年龄、死亡后分离时间或培养时间的影响。对原代人RPE细胞施加短时电脉冲。采用毛细管转染系统不会对上皮细胞形态产生不利影响。

转染原代人视网膜色素上皮细胞培养上清液的Western血液分析显示，在超过500天的时间内，色素上皮衍生因子的分泌水平稳定，且无外源基因沉默现象。如本代表性细胞培养基的Western血液分析结果所示（该分析来自连续进行的转染实验），转染后21天可观察到普遍更高的色素上皮衍生因子分泌率。在持续培养中，PEDF的长期高分泌状态至少可持续165天。

此外，基于ELISA的定量分析显示，与未转染的对照细胞相比，转染的人原代视网膜色素上皮（RPE）细胞中色素上皮衍生因子（PEDF）的总分泌量增加了20倍。该增量在基因表达水平上也得到证实，总PEDF表达量升高了30倍以上。在实施本方案时，重要的是使用形态学特征符合体内状态的色素上皮细胞。

此外，注意将细胞溶液吸入转染枪头时避免产生气泡。稳定转染的细胞可用于不同的离体或体内模型，以验证这种基于细胞的基因添加疗法的功能性。