Name: 使用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行基于电穿孔的遗传修饰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 了解使用睡美人转座子系统通过电穿孔技术对原代人色素上皮细胞进行基因修饰的方法。该技术可实现稳定的转基因表达和蛋白分泌，为视网膜退行性疾病的基因治疗提供基础。

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本工作由欧盟研究、技术发展和示范第七框架计划资助，资助协议编号为305134。Zsuzsanna&#160;Izsvák获得了欧洲研究理事会高级资助（ERC-2011-ADG 294742）的支持。作者谨此感谢Anna Dobias和Antje Schiefer（亚琛工业大学医院眼科系）提供的出色技术支持，以及亚琛角膜库（亚琛工业大学医院眼科系）提供的人类供体眼球。

人眼供体来自亚琛工业大学医院眼科系（亚琛工业大学大学医院）的亚琛角膜库，在符合《赫尔辛基宣言》协议的前提下，获得知情同意后获取。人源样本的采集和使用程序已获机构伦理委员会批准。
1. 原代人视网膜色素上皮细胞的分离
<ol>
	<li>准备好无菌防护服和手套，并在层流台下放置无菌铺巾。</li>
	<li>将无菌制备器械及其他所需无菌设备置于层流台下。</li>
	<li>记录眼球的接收时间、制备开始时间以及任何可能的异常情况。登记供体年龄、性别、死亡原因以及死亡至眼球摘除之间的时间间隔。</li>
	<li>将眼球置于无菌纱布中，用手握住。</li>
	<li>使用手术刀和超细尖眼科剪，在距角膜缘约 3.5 mm 的后方，作一周向切割，分离前段与后段。</li>
	<li>将眼球后段向下倾斜，用蜂鸟镊小心去除玻璃体和视网膜。</li>
	<li>用直型虹膜镊轻柔调整塌陷的视网膜色素上皮/脉络膜复合体，随后用弯型虹膜镊固定其位置。</li>
	<li>向眼球后杯中加入 1 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）、80 U/mL 青霉素和 80 µg/mL 链霉素（Pen/Strep）以及 2.5 µg/mL 两性霉素 B（AmphoB）的杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F-12 营养混合物（DMEM/F12）。 
	&#8203;注意：与从猪或牛眼分离原代 RPE 细胞不同36,37，眼球后杯无需用胰蛋白酶填充并孵育。</li>
	<li>用火焰抛光的弯头玻璃巴斯德吸管，从视神经向角膜缘方向轻轻刷取视网膜色素上皮细胞，同时用蜂鸟镊在角膜缘处固定 RPE/脉络膜复合体。将细胞悬液转移至培养皿中。</li>
	<li>重复步骤 1.8 和 1.9，将所有细胞收集至培养皿中。使用单通道移液器（100–1,000 µL）反复吹打，轻柔重悬细胞悬液。</li>
	<li>将每个眼球的 RPE 细胞悬液接种至 24 孔细胞培养板的三个孔中，并用添加了 FBS、Pen/Strep 和 AmphoB 的 DMEM/F12 培养基补足至 1 mL。</li>
	<li>将 RPE 细胞培养物置于 37 °C、含 95% 空气和 5% CO2 的湿润环境中培养，直至细胞融合。每周更换两次培养基。</li>
</ol>
2. 原代人视网膜色素上皮细胞的电穿孔
<ol>
	<li>制备 SB100X 转座酶/PEDF 转座子质粒混合物
	<ol>
		<li>纯化 SB100X 转座酶和 PEDF 使用常规质粒纯化试剂盒提取转座子质粒DNA，所选试剂盒需经验证适用于转染等应用，具体操作按照制造商提供的说明书进行。</li>
		<li>使用微量分光光度计定量质粒DNA含量，并用10 mM Tris-HCl（pH 8.5）将其浓度调整至250 ng/µL。</li>
		<li>混合一份250 ng/µL的溶液 SB100X 转座酶质粒DNA（例如2.5 µL）与16份250 ng/µL的组分 PEDF 转座子质粒DNA（例如40 µL）。剩余的质粒混合物可保存在-20 °C。 
		&#8203;注意：应避免对质粒混合物进行多次反复冻融。</li>
		<li>加入2 µL的 SB100X 转座酶/PEDF 转座子质粒混合物，包含29.4 ng的 SB100X 转座酶质粒和470.6 ng PEDF转座子质粒，置于无菌1.5 mL安全锁微型离心管中。混合细胞前保持冰上放置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>毛细管转染系统的设置 
	注意：根据制造商的说明书，已使用10 µL试剂盒的毛细管转染系统对原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞进行电穿孔转染。该系统包括转染装置、转染移液器和移液器工作站。试剂盒包含10 µL转染吸头、缓冲管、电解缓冲液E（buffer E）和重悬缓冲液R（buffer R）。
	<ol>
		<li>将移液工作站连接至转染装置。</li>
		<li>用3 mL缓冲液E填充缓冲管，并将其插入移液工作站，直至听到咔嗒声。 
		注意：确保缓冲液管的侧电极与移液工作站的侧球形顶针相连。</li>
		<li>对于原代人RPE细胞的电穿孔，将转染设备的脉冲参数设置如下：1,100 V（脉冲电压）、20 ms（脉冲宽度）、两次脉冲（脉冲次数）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养的原代人RPE细胞的制备
	<ol>
		<li>通过相差显微镜记录原代RPE细胞培养物的形态特征。拍摄低倍镜照片以显示RPE细胞生长形成融合且完整的单层结构，同时拍摄高倍镜照片以突出RPE细胞典型的鹅卵石样形态。</li>
		<li>吸弃细胞培养基，用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤细胞两次。</li>
		<li>用0.5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C、含95%空气和5% CO₂的加湿环境中消化原代人视网膜色素上皮细胞2 7-15 分钟（最长）。在显微镜下检查细胞脱落情况。</li>
		<li>用含FBS的DMEM/F12培养基1 mL终止消化。取20 µL细胞悬液，用血细胞计数板进行细胞计数。将RPE细胞悬液在106 x g 10分钟</li>
		<li>将20 µL样品与20 µL台盼蓝溶液混合。用移液器将10 µL混合液分别加入血细胞计数板的两个计数区，于相差显微镜下进行细胞计数。</li>
		<li>离心后，将RPE细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。</li>
		<li>取10,000–100,000个RPE细胞用于每次转染反应，于106 x g离心 g 10 分钟 
		&#8203;注意：除施加电场并添加质粒DNA的转染反应外，每种方法还包括两种不同的对照培养：（1）不施加电场且不添加质粒DNA；（2）施加电场但不添加质粒DNA。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于11 µL缓冲液R中，并与2 µL的 SB100X 转座酶/PEDF 转座子质粒混合物（见步骤 2.1.4）。 
		&#8203;注意：细胞在缓冲液R中重悬后，必须在15分钟内进行处理，以避免细胞活力和转染效率下降。</li>
		<li>将转染移液器的头部插入10 µL转染吸头，直至卡扣完全固定活塞的安装杆。吸取细胞/质粒溶液至转染吸头中。 
		注意：避免产生气泡，并防止气泡被吸入转染尖端。</li>
		<li>向24孔细胞培养板中所需的孔数加入1 mL DMEM/F12培养基，该培养基需添加FBS，但不含有青霉素/链霉素（Pen/Strep）和两性霉素B（AmphoB）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔过程
	<ol>
		<li>将转染移液管插入移液管架中的缓冲液管内（见步骤 2.2.2），直至听到咔嗒声。 
		&#8203;注意：确保转染移液器的金属头已连接至移液器站内的球形推杆以及缓冲管。</li>
		<li>按压 开始 在转染设备的触摸屏上。在施加电脉冲之前，设备会自动检测缓冲液管和转染移液管是否已正确插入。电脉冲递送完成后， 完成 显示在触摸屏上。</li>
		<li>小心地将转染移液枪从移液枪架上取下，并立即将电穿孔后的细胞从10 µL转染吸头中释放，通过移液将细胞/质粒溶液加入已准备好的细胞培养板孔中（见步骤2.3.10）。</li>
		<li>将转染的RPE细胞培养物置于37 °C、95%空气和5% CO₂的湿化气氛中培养2电穿孔后3天进行首次换液时，加入青霉素/链霉素和两性霉素B。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 转染的人原代视网膜色素上皮细胞的分析
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>培养3周后，最终将RPE细胞培养物在1.0 mL添加了FBS、Pen/Strep和AmphoB的DMEM/F12培养基中，于确定时间内孵育24 h。</li>
		<li>收集细胞培养上清液，短期保存可置于 -20 °C，如样品热不稳定或需长期保存则应置于 -80 °C。</li>
		<li>用0.5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C、含95%空气和5% CO₂的湿润环境中消化转染的RPE细胞培养物2 10 分钟。</li>
		<li>用含FBS的DMEM/F12培养基1 mL终止胰蛋白酶消化。取少量细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数（见步骤2.3.5）。将RPE细胞悬液在106 × g 10 分钟。</li>
		<li>将RPE细胞沉淀物于-80 °C保存，直至后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过蛋白质印迹法评估PEDF的分泌 
	注意：对于定性评估，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及后续的蛋白质印迹法分析细胞培养上清液（见步骤 3.1.2）。根据 PEDF 转座子质粒DNA的使用，上清液必须进行不同的处理。
	<ol>
		<li>从细胞培养上清液中纯化 His 标签 PEDF 融合蛋白
		<ol>
			<li>每份样品使用斜切尖端枪头取 30 µL 镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）悬浊液，通过离心（2,660 x g 30 秒。</li>
			<li>小心地用 200 µL 1x 孵育缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8.0）并通过离心收集沉淀（2,660 × g 30 秒。</li>
			<li>重复上一步骤。</li>
			<li>小心地用 40 µL 4x 孵育缓冲液（200 mM NaH2PO4，每样品加入1.2 M NaCl、40 mM 咪唑，pH 8.0的缓冲液。</li>
			<li>将900 µL细胞培养上清液与260 µL 4x孵育缓冲液及55 µL预处理的Ni-NTA悬液混合（参见步骤3.2.1.4）。</li>
			<li>将混合物在室温下于摇床中孵育60分钟。</li>
			<li>通过离心沉淀 Ni-NTA 树脂（2660 x g 60 秒。</li>
			<li>小心地用 175 µL 1x 孵育缓冲液重悬 Ni-NTA 树脂，并通过离心（2,660 x g）收集树脂沉淀 g 60 秒。</li>
			<li>重复上一步骤。</li>
			<li>小心地用 30 µL 洗脱缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 8.0）中，室温下于摇床上孵育20分钟。</li>
			<li>通过离心沉淀 Ni-NTA 树脂（2,660 x g 30秒。</li>
			<li>小心吸取上清液，并与2x SDS上样缓冲液混合47.</li>
			<li>在95 °C下加热混合物5分钟，并在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离Ni-NTA纯化的蛋白质。</li>
			<li>使用抗Penta-His抗体（小鼠单克隆，1:500）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠抗体（兔多克隆，1:1,000）进行Western印迹分析，方法如前所述36,37.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>直接分析非标记的PEDF蛋白
		<ol>
			<li>取15 µL细胞培养上清液，与2x SDS上样缓冲液混合47.</li>
			<li>在 95 °C 下加热混合物&#160;5 分钟后，在 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质。</li>
			<li>使用抗人PEDF抗体（兔多克隆，1:4,000）和HRP标记的抗兔抗体（山羊多克隆，1:2,000）进行Western印迹分析，方法如前所述38.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过ELISA定量检测PEDF的分泌
		<ol>
			<li>使用人PEDF ELISA试剂盒，按照制造商说明书分析细胞培养上清液（参见步骤3.1.2）。</li>
			<li>将每次转染反应所分泌的PEDF量与对应的时间和细胞数量相关联（参见步骤3.1.4）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析 PEDF 转染RPE细胞中的基因表达
		<ol>
			<li>使用商品化试剂盒，按照生产商说明书从RPE细胞沉淀（见步骤3.1.5）中提取总RNA。</li>
			<li>使用微量分光光度计定量RNA含量。</li>
			<li>使用逆转录系统，按照制造商说明书对0.1 µg RNA进行逆转录。</li>
			<li>按照先前所述方法进行实时定量 PCR38.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>转染RPE细胞中外源基因插入位点的分析
		<ol>
			<li>从视网膜色素上皮细胞中分离基因组DNA&#160;使用市售试剂盒，按照生产商说明书提取细胞沉淀（参见步骤 3.1.5）。</li>
			<li>使用微量分光光度计定量DNA含量。</li>
			<li>使用先前所述的计算辅助半特异性PCR方案生成插入位点文库38.</li>
			<li>按照先前所述进行计算分析38.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Zoltán Ivics 和 Zsuzsanna Izsvák 是多项关于 SB 转座子技术专利的发明人

在本项目中，我们的目标是通过非病毒方法制备能够持续过表达并分泌有效因子的基因修饰人原代视网膜色素上皮（RPE）细胞，从而将转染后的细胞用作建立和维持保护性微环境的长期治疗手段。我们已成功导入编码PEDF的基因，该基因表达一种广泛存在的多功能蛋白，具有抗血管生成和神经保护功能。本文所述方案可用于利用SB100X转座子系统对人原代RPE细胞进行稳定且可重复的转染。DNA的递送及导入RPE细胞过程采用基于移液管的毛细管转染系统完成，该系统使用特制的转染尖端作为电穿孔室，取代传统的电穿孔杯。
用于后续转染的、由形态学上良好分化的细胞组成的原代视网膜色素上皮（RPE）培养物的富集效果，受到多种因素影响，包括供体的人类个体因素（年龄和总体健康状况）以及眼球获取情况（细胞分离的死后时间）。新分离并接种的原代RPE细胞至少需要2&#160;周时间才能形成由六边形细胞组成的单层结构。通常情况下，在转染前需要更长时间达到汇合的细胞培养物，在转染后也表现出粘附和铺展速度减慢的现象。细胞粘附和铺展还可能受到RPE细胞在分离或转染过程中受损所释放的游离色素沉积的阻碍。
<p cla...

高龄被认为是神经退行性疾病的主要风险因素。年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种多基因疾病，可导致60岁以上患者严重视力丧失，属于全球致盲和视力障碍的四大最常见病因之一1，预计到2040年将影响2.88亿人2。视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是AMD发病机制的重要组成部分。RPE是一层紧密排列的细胞，位于脉络膜毛细血管与视网膜光感受器之间，承担多种对正常视网膜功能至关重要的功能3，并分泌多种生长因子及其他对维持视网膜和脉络膜毛细血管结构完整性至关重要的因子，从而支持光感受器的存活，并为血液循环和营养供应提供基础。
在健康的眼睛中，色素上皮衍生因子（PEDF）负责平衡血管内皮生长因子（VEGF）的作用，保护神经元免于凋亡，抑制内皮细胞增殖，并稳定毛细血管内皮。VEGF与PEDF比例的改变与眼部新生血管形成相关，这一现象已在动物模型4,5以及因年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性糖尿病视网膜病变导致脉络膜新生血管（CNV）的患者样本中观察到6,7,8,9,10。目前的标准治疗靶向于升高的VEGF浓度。抗VEGF药物贝伐单抗、雷珠单抗、阿柏西普，以及最近的布罗鲁单抗，可使约三分之一的CNV患者视力改善，或在90%的病例中稳定视力11,12,13。然而，频繁的（通常为每月一次）玻璃体内注射存在不良事件风险14，影响患者的依从性，并对医疗系统造成显著的经济负担15。此外，一定比例的患者（2%–20%）对抗VEGF治疗无反应或反应不佳16,17,18,19。这些不利因素促使人们需要开发替代疗法，例如眼内植入物、细胞治疗和/或基因治疗策略。
基因治疗已发展成为治疗遗传性和非遗传性疾病的一种有前景的方法，旨在恢复功能异常的基因序列或抑制功能失调的基因。对于多基因疾病，由于难以识别和替换致病因子，治疗策略通常着眼于持续递送保护性因子。以年龄相关性黄斑变性（AMD）为例，已开发出多种附加治疗策略，例如内抑素（endostatin）和抑血管生成素（angiostatin）的稳定表达20、血管内皮生长因子（VEGF）拮抗剂可溶性类fms酪氨酸激酶-1（sFLT-1）21,22、补体调节蛋白分化簇59（CD59）23，或色素上皮衍生因子（PEDF）24,25。眼睛，尤其是视网膜，因其封闭的结构、良好的可及性、较小的体积以及免疫豁免特性，成为基因治疗药物的理想靶器官，可实现低治疗剂量的局部递送，并降低移植组织被排斥的风险。此外，眼部可进行无创监测，视网膜可通过多种成像技术进行观察。
由于病毒载体具有较高的转导效率，因此是将治疗性基因递送至靶细胞的主要工具。然而，根据所使用的病毒载体类型，已报道存在不同的不良反应，例如免疫和炎症反应26、致突变性和致癌效应27,28，或在其他组织中的扩散29。实际应用中的限制还包括包装容量有限30，以及临床级批次生产过程中相关的技术难度和高成本31,32。这些缺点推动了非病毒性、基于质粒的载体的进一步发展，这类载体可通过脂质/聚合物复合物、超声或电穿孔等方式进行转导。然而，质粒载体通常不会促进外源基因在宿主基因组中的整合，因此只能实现短暂的表达。
转座子是一类天然存在的DNA片段，可在基因组内改变其位置，这一特性已被应用于基因治疗。由于具有活跃的整合机制，基于转座子的载体系统可实现插入的外源基因持续而稳定的表达。 睡美人 (SB) 转座子，由一种古老的 Tc1/mariner在鱼类中发现的 -型转座子33 并通过分子进化进一步优化，获得了高活性变体 SB100X34，可在多种原代细胞中实现高效的转座，并已用于不同疾病模型中的表型矫正35目前已有13项临床试验采用了该方法 SB 转座子系统。该 SB100X 转座子系统包含两个组分：转座子和转座酶。转座子由位于末端反向重复序列（TIRs）之间的目的基因构成，而转座酶负责介导转座子的移动。在将质粒DNA递送至细胞后，转座酶结合TIRs，并催化转座子从载体上切离，进而整合到细胞基因组中。
我们开发了一种用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）的非病毒细胞基础的增补疗法。该方法通过PEDF基因与SB100X转座子系统，利用电穿孔技术将基因导入原代色素上皮（PE）细胞36,37,38。转座酶和PEDF的遗传信息分别由两个独立的质粒提供，从而可调节理想的SB100X与PEDF转座子比例。电穿孔操作采用基于移液管的毛细管转染系统，其特点是电极间距离最大化，同时电极表面积最小化。该装置已被证明可在多种哺乳动物细胞中实现优异的转染效率39,40,41。较小的电极表面积可产生均匀的电场，并减少电解过程中的多种副作用42。
通过转染色素上皮细胞分泌的PEDF的抗血管生成功能已在多种体外实验中得到验证，这些实验分析了人脐静脉内皮细胞的出芽、迁移和凋亡情况43。此外，在角膜新生血管化兔模型44以及脉络膜新生血管（CNV）大鼠模型43,45,46中移植PEDF转染细胞后，新生血管化程度有所下降。
本文详细描述了一种利用SB100X转座子系统结合毛细管转染技术，将PEDF基因稳定插入原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞的实验方案。转染后的细胞培养21天，随后通过定量聚合酶链式反应（qPCR）检测PEDF基因的表达水平，并通过免疫印迹和酶联免疫吸附试验（ELISA）分析PEDF蛋白的分泌情况（图1）。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;原代人视网膜色素上皮细胞的分离&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td>0030722019</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B250 &amp;micro;g/mL（两性霉素B）</td><td>默克公司，德国达姆施塔特</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>科利布里镊子</td><td>Geuder，德国海德堡</td><td>G-18950</td><td></td></tr><tr><td>弯曲虹膜镊&amp;nbsp;</td><td>Geuder，德国海德堡</td><td>G-18856</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀（No. 11）</td><td>中国日本大阪羽</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基&amp;rsquo;s Medium/Ham&amp;rsquo;DMEM/F12 营养混合物</td><td>PAN-Biotech，德国艾登巴赫</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>超细尖眼科剪&amp;nbsp;</td><td>Geuder，德国海德堡</td><td>G-19405</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清0.2 &amp;micro;m 无菌过滤的胎牛血清（FBS）</td><td>PAN-Biotech，德国艾登巴赫</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德玻璃移液管</td><td>品牌，德国韦尔泰姆</td><td>747715</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 [10,000 单位/毫升] 和链霉素 [10 毫克/毫升]（Pen/Strep）</td><td>默克公司，德国达姆施塔特</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头1000 &amp;micro;L)</td><td>Starlab，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（100-1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌铺巾</td><td>Lohmann &amp;amp; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布敷料&amp;nbsp;</td><td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td><td>321063</td><td></td></tr><tr><td>无菌手套</td><td>Sempermed，维也纳，奥地利</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿（Falcon 60 mm × 15 mm）</td><td>康宁，纽约州，康宁</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术衣</td><td>Halyard Health，美国佐治亚州阿尔法雷塔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>直型虹膜镊&amp;nbsp;</td><td>Geuder，德国海德堡</td><td>G-18855</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;原代人视网膜色素上皮细胞的电穿孔&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td>0030722019</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B250 &amp;micro;g/mL（两性霉素B）</td><td>默克公司，德国达姆施塔特</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基&amp;rsquo;s Medium/Ham&amp;rsquo;DMEM/F12 营养混合物</td><td>PAN-Biotech，德国艾登巴赫</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 微量离心管（1.5 mL）</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清0.2 &amp;micro;m 无菌过滤的胎牛血清（FBS）</td><td>PAN-Biotech，德国艾登巴赫</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td><td>Leica DMi8</td><td></td></tr><tr><td>微量分光光度计（NanoDrop 分光光度计）</td><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛细管转染系统（Neon 转染系统）</td><td>Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统 10 &amp;micro;L 试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（Neubauer 计数室）</td><td>Paul Marienfeld, Lauda-K&amp;ouml;nigshofen，德国</td><td>0640110</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco 不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 不含 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Biochrom，德国柏林</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 [10,000 单位/毫升] 和链霉素 [10 毫克/毫升]（Pen/Strep）</td><td>默克公司，德国达姆施塔特</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（10 &amp;micro;L)</td><td>德国汉堡 Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头1000 &amp;micro;L)</td><td>德国汉堡 Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头200 &amp;micro;L)</td><td>德国汉堡 Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（0.1-10 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（100-1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（10-200 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>默克公司，德国达姆施塔特</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05&amp;nbsp;%)</td><td>Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;转染的人类原代视网膜色素上皮细胞分析&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× 孵育缓冲液（50 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SDS上样缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x 孵育缓冲液（200 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.2 M NaCl，40 mM 咪唑，pH 8.0）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 支持膜 0.2 &amp;micro;m&amp;nbsp;硝酸纤维素印迹膜</td><td>Cytiva，马萨诸塞州马尔伯勒</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B250 &amp;micro;g/mL（两性霉素B）</td><td>默克公司，德国达姆施塔特</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>抗PEDF抗体（兔多克隆）</td><td>BioProducts，马里兰州米德尔顿</td><td>AB-PEDF1</td><td></td></tr><tr><td>抗五聚组氨酸抗体（小鼠单克隆）</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基&amp;rsquo;s Medium/Ham&amp;rsquo;DMEM/F12 营养混合物</td><td>PAN-Biotech，德国艾登巴赫</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>洗脱缓冲液（50 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 8.0&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清0.2 &amp;micro;m 无菌过滤的胎牛血清（FBS）</td><td>PAN-Biotech，德国艾登巴赫</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（Neubauer 计数室）</td><td>Paul Marienfeld, Lauda-K&amp;ouml;nigshofen，德国</td><td>0640110</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体（兔多克隆）</td><td>Agilent Dako，加利福尼亚州圣克拉拉</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体（山羊多克隆）</td><td>Abcam，英国剑桥</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>人PEDF ELISA试剂盒&amp;nbsp;</td><td>BioProducts，马里兰州米德尔敦</td><td>PED613</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 成像系统</td><td>富士胶片，日本东京都港区</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 1.2 仪器</td><td>罗氏生命科学，德国彭茨贝格</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td><td>罗氏生命科学，德国彭茨贝格</td><td>12239264001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&amp;nbsp;毛细血管（20 &amp;mu;l)</td><td>罗氏生命科学，德国彭茨贝格</td><td>4929292001</td><td></td></tr><tr><td>微量分光光度计（NanoDrop 分光光度计）</td><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;nbsp;四细胞铸造模块</td><td>Bio-Rad Laboratories，德国菲尔德基兴</td><td>1658015</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;nbsp;用于小型预制胶的四垂直电泳槽，4块胶</td><td>Bio-Rad Laboratories，德国菲尔德基兴</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白质标准品</td><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 [10,000 单位/mL] 和链霉素 [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td><td>默克公司，德国达姆施塔特</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头10 &amp;micro;L)</td><td>德国汉堡 Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头1000 &amp;micro;L)</td><td>Starlab，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头200 &amp;micro;L)</td><td>德国汉堡 Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic 电源供应器</td><td>Bio-Rad Laboratories，德国菲尔德基兴</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>逆转录系统&amp;nbsp;</td><td>Promega，美国威斯康星州麦迪逊市</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase试剂盒</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>摇床振荡器</td><td>Cole-Parmer，英国斯塔福德郡</td><td>SSM3</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 微量离心管（1.5 mL）</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 微量离心管（2.0 mL）</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（0.1-10 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（100-1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（10-200 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 转膜系统</td><td>Bio-Rad Laboratories，德国菲尔德基兴</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>默克公司，德国达姆施塔特</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05&amp;nbsp;%)</td><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

基于电穿孔技术利用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行遗传修饰

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

社会老龄化程度日益加剧，导致神经退行性疾病的发病率不断上升。迄今为止，其病理机制尚未被充分阐明，从而阻碍了明确治疗手段的建立。基于细胞的增补型基因疗法通过提高保护性因子的表达水平，被视为治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）等神经退行性疾病的一种有前景的策略。我们开发了一种方法，利用Sleeping Beauty（SB）转座子系统，将编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因稳定整合到原代人眼色素上皮（PE）细胞基因组中，实现其稳定表达。PEDF是一种在神经系统中具有神经保护和抗血管生成作用的蛋白质。原代PE细胞从人供体眼球中分离并进行体外培养。当细胞达到汇合状态后，将1 × 104个细胞悬浮于11 µL重悬缓冲液中，并与2 µL含有30 ng高活性SB（SB100X）转座酶质粒和470 ng PEDF转座子质粒的纯化溶液混合。采用毛细管电穿孔系统进行遗传修饰，电穿孔参数为：两个脉冲，电压1,100 V，脉宽20 ms。转染后的细胞被转移至含有添加胎牛血清培养基的培养板中；抗生素和抗真菌剂在首次换液时加入。在独立重复的实验中验证了转染的成功。定量聚合酶链式反应（qPCR）结果显示PEDF转基因表达显著升高。免疫印迹分析表明PEDF分泌水平显著提高，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）证实其分泌持续稳定。由SB100X介导的基因转移实现了PEDF基因在PE细胞基因组中的稳定整合，确保了PEDF的持续分泌，这对于开发用于治疗AMD或其他视网膜变性疾病基于细胞的基因增补疗法至关重要。此外，对PEDF转座子在人PE细胞中整合位点分布的分析表明，其在基因组中的整合几乎呈随机分布。

原代人视网膜色素上皮细胞的培养与电穿孔 
我们已证明，接种足量的动物来源原代视网膜色素上皮（RPE）细胞，可使其在体外培养形成由色素化、六边形细胞组成的完整单层36,37,48。这些细胞在体外能够形成紧密连接、表现出吞噬活性并表达特定的标志基因48，反映了视网膜色素上皮在体内的主要功能。从人供体眼球中分离的原代RPE细胞在体外培养后同样呈现典型的鹅卵石样形态，且不受供体年龄（65.3 ± 9.94 岁，最小值：49 岁，最大值：83 岁，n = 12）、死亡后取材时间（37.3 ± 17.0 小时，最小值：16 小时，最大值：68 小时，n = 12）以及培养时间（27.6 ± 14.1 天，最小值：13 天，最大值：61 天，n = 12）的影响（图2</s...

我们建立了一种利用Sleeping Beauty（SB）转座子系统，通过电穿孔将编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因转染至原代人色素上皮细胞的实验方案。转染成功通过定量聚合酶链式反应（qPCR）、免疫印迹（immunoblotting）和酶联免疫吸附测定（ELISA）得以验证。

我们日益老龄化的人口导致神经退行性疾病的发病率不断上升。迄今为止，其病理机制尚未得到充分阐明……

本方法展示了利用睡美人转座子系统，通过电穿孔法对原代人色素上皮细胞进行转染，并验证外源基因表达及蛋白分泌的效果。睡美人转座子系统与电穿孔技术的结合，可实现原代人色素上皮细胞的高效转染，并支持外源基因的稳定且持续表达以及蛋白的持续分泌。该研究的总体目标是建立一种基于细胞的基因增补疗法，用于治疗视网膜变性疾病，此类疗法需要治疗性活性蛋白的稳定且持续的分泌。进行该操作演示的将是来自实验室的医学技术助理 Anne Freialdenhoven 和 Antje Schiefer。为准备用于原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞电穿孔的质粒 DNA，需使用微量分光光度计定量质粒 DNA 含量，并用 10 毫摩尔 Tris-HCl 将其浓度调整至 250 纳克/微升。取一份体积的 250 纳克/微升 SB100X 转座酶质粒 DNA 与十六份体积的 250 纳克/微升色素上皮衍生因子转座子质粒 DNA 混合。将2 µL终末血浆混合物加入预冷的无菌1.5 mL安全锁微型离心管中，置于冰上，并在缓冲液管中加入3 mL缓冲液E。然后将试管插入移液工作站，直至听到咔嗒声，设置转染仪参数为1,100伏、20毫秒脉冲宽度，共施加两次脉冲。为电穿孔实验准备细胞时，首先通过相差显微镜观察原代RPE细胞培养物的形态，以评估其生长状态和融合度。在细胞培养孵育箱中，每孔加入 500 微升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，处理 7 至 15 分钟。待细胞脱落后，通过离心收集细胞，用 1 毫升 PBS 重悬细胞，并将每转染反应分为 1 至 10 份细胞等分试样，每份含 10⁴ 个细胞，离心。每管中加入 11 微升缓冲液 R 重悬沉淀，并向每管加入 2 微升已制备的质粒混合物。将转染移液器的头部插入10微升转染吸头中，直至夹子完全卡住活塞的安装杆，然后将细胞与质粒溶液加载到转染吸头中。将转染移液器插入放置在移液器工作站内的缓冲液管中，听到“咔哒”声后按下启动键，开始电穿孔过程。转染完成后，小心地将转染移液器从移液器工作站中取出，并立即用其将细胞与质粒溶液转移至已准备好的细胞培养板孔中。从RPE细胞培养上清液中纯化带有his标签的色素上皮衍生因子融合蛋白。首先，使用斜切枪头为每个样品收集30微升镍-NTA悬浊液，并通过离心沉淀镍-NTA树脂。随后，用200微升1×孵育缓冲液小心重悬镍-NTA树脂，并额外进行两次离心沉淀。第二次离心后，每份样品用 40 微升 4× 孵育缓冲液小心重悬镍 NTA 树脂沉淀。接下来，将一份预处理的镍 NTA 悬液 55 微升与 260 微升 4× 孵育缓冲液及 900 微升每种转染的 RPE 细胞培养上清液混合。将混合物在室温下于摇床上孵育 60 分钟，然后再次离心收集镍 NTA 树脂混合物。将沉淀物小心地重悬于 175 微升 One X 孵育缓冲液中，并将混合物再离心两次。第二次离心后，将镍 NTA 树脂沉淀物小心地重悬于 30 微升洗脱缓冲液中，在室温下振荡孵育 20 分钟，然后再次离心样品。随后小心收集上清液，并与 Two X SDS 上样缓冲液混合，用于纯化蛋白的 Western 印迹分析。从人类供体眼球分离培养的原代视网膜色素上皮（RPE）细胞表现出典型的鹅卵石样形态，且不受供体年龄、死亡后分离时间或培养时间的影响。对原代人RPE细胞施加短时电脉冲。采用毛细管转染系统不会对上皮细胞形态产生不利影响。转染原代人视网膜色素上皮细胞培养上清液的Western血液分析显示，在超过500天的时间内，色素上皮衍生因子的分泌水平稳定，且无外源基因沉默现象。如本代表性细胞培养基的Western血液分析结果所示（该分析来自连续进行的转染实验），转染后21天可观察到普遍更高的色素上皮衍生因子分泌率。在持续培养中，PEDF的长期高分泌状态至少可持续165天。此外，基于ELISA的定量分析显示，与未转染的对照细胞相比，转染的人原代视网膜色素上皮（RPE）细胞中色素上皮衍生因子（PEDF）的总分泌量增加了20倍。该增量在基因表达水平上也得到证实，总PEDF表达量升高了30倍以上。在实施本方案时，重要的是使用形态学特征符合体内状态的色素上皮细胞。此外，注意将细胞溶液吸入转染枪头时避免产生气泡。稳定转染的细胞可用于不同的离体或体内模型，以验证这种基于细胞的基因添加疗法的功能性。

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医学

使用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行基于电穿孔的遗传修饰

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在我们首次进行的人体基因治疗临床试验中，将表达靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）的T细胞作为B细胞恶性肿瘤的试验性治疗手段。本文描述了利用Sleeping...

用于外周血和脐带血T细胞基因修饰的Sleeping Beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

软脑膜表面是中枢神经系统中一个独特的前体细胞区域，正受到越来越多的关注。本文详细介绍了一种利用改良电穿孔技术快速进行该前体区域遗传操作的方法。该方法可用于研究细胞谱系和参与细胞分化过程的信号通路，进而阐明子代细胞的命运及其生物学特性。...

新生小鼠软脑膜表面电穿孔技术

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用于原代细胞培养研究的鸡视网膜高效基因转导：一种 体外培养 电穿孔法

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一种高效的方法 体外 通过转录调控的睡美人系统介导的转座方法——该系统被包装至整合缺陷型慢病毒载体中

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利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

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诱导与分析Sleeping Beauty转座子转染的人视网膜色素上皮细胞中的氧化应激

本文介绍了一种从多种哺乳动物（小鼠、大鼠、兔、猪和牛）中分离并转染原代虹膜和视网膜色素上皮细胞的实验方案。该方法非常适用于在多种实验条件下开展眼部基因治疗的研究，可用于可转化至人类的离体 分析以及 在体研究。...

分离、培养及遗传改造哺乳动物原代色素上皮细胞用于非病毒基因治疗

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了解使用睡美人转座子系统通过电穿孔技术对原代人色素上皮细胞进行基因修饰的方法。该技术可实现稳定的转基因表达和蛋白分泌，为视网膜退行性疾病的基因治疗提供基础。

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