Name: 使用微生理系统模拟人体乳房组织中的乳腺癌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学习利用微生理系统在体外长期维持人乳腺组织活性，研究乳腺癌与乳腺组织的相互作用。该技术保留脂肪细胞、免疫细胞及血管结构，为个性化医疗和药物开发提供重要研究平台。

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我们感谢杜兰大学流式细胞术与细胞分选核心实验室以及杜兰大学组织学核心实验室提供的技术支持。本研究由美国东南部整形外科协会资助 &amp;#38; 重建外科医生2019年研究基金以及美国国家科学基金会（EPSCoR Track 2 RII，OIA 1632854）。

所有人体组织均根据路易斯安那州立大学健康科学中心机构审查委员会批准的方案 #9189 进行收集。
1. 脂肪来源干细胞（ASCs）细胞片的接种
<ol>
	<li>从商业渠道购买ASCs，或按照既定方案从原代人乳腺组织中分离获取8,9. 以70%密度接种人乳腺脂肪来源干细胞（ASCs）（约80,000个细胞/cm²）2 将细胞以适当的密度接种于6孔标准组织培养板中，培养基为添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（BC-MPS培养基）。用于制备细胞片的脂肪来源干细胞（ASCs）代数应低于第10代。
	<ol>
		<li>为制备每孔乳腺癌微生理系统（BC-MPS），需在1个标准组织培养孔及1个尺寸相似的聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAAm）涂层组织培养塑料板孔中接种细胞。每块6孔BC-MPS需使用1块标准6孔组织培养板（底部）和1块pNIPAAm涂层板（顶部）。pNIPAAm板可从商业渠道购买，也可在实验室自行包被。10,11,12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂的组织培养孵育箱中培养ASCs2在生物安全柜中每2-3天更换一次培养基。</li>
	<li>将ASCs培养至100%汇合并形成条索状排列。根据接种时的汇合度，此过程需要7-10天。汇合的细胞片层对于固定漂浮的脂肪乳腺组织是必需的。</li>
</ol>
2. 准备BC-MPS所需材料
<ol>
	<li>为6孔板制备明胶，需在蒸馏水（H2O）中配制12%的明胶溶液。取19 g B型明胶（凝胶强度约为225 Bloom）与125 mL H2O混合于250 mL玻璃培养瓶中，再向溶液中加入1.6 mL 1 M NaOH以中和pH值。</li>
	<li>将溶液置于液体灭菌程序下高压灭菌25分钟，以实现溶液的灭菌。</li>
	<li>让溶液冷却至37 °C。在无菌生物安全柜中，向溶液中加入16 mL无菌的10倍浓度Hanks平衡盐溶液（HBSS），使最终体积达到160 mL。 
	&#8203;注意：明胶溶液可立即使用，也可在室温下储存以备后续使用。配制好的明胶在室温下可稳定保存1个月。若仅需少量冲头，可当天配制10 mL溶液，并按前述方法进行无菌过滤7。
	<ol>
		<li>若采用过滤灭菌法制备明胶溶液，可在15 mL锥形管中将1 mL 10倍浓度HBSS与9 mL H2O混合，配制成1倍浓度HBSS溶液。向每支10 mL溶液管中加入100 µL 1 M NaOH，随后加入0.7 g明胶。剧烈震荡混合，使明胶充分溶解。</li>
		<li>将管子置于75 °C水浴中孵育20分钟，每隔5分钟振荡一次。使用10 mL注射器和0.22 µm注射式滤器过滤明胶溶液，并在生物安全柜中直接将滤过的明胶溶液滴加至冲头上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过3D打印或使用普通丙烯酸材料制作用于转移细胞片的冲头。确保冲头能松动地放入目标规格的孔中。标准的3D打印冲头如图1所示。可使用TinkerCad等标准计算机辅助设计软件设计冲头，并采用兼容聚乳酸（PLA）材料的丝材3D打印机进行打印13,14。</li>
	<li>为放置冲头准备支架，将一个15 mL离心管架放入生物安全柜中。将冲头倒置放置在架上，使其底部朝上。在生物安全柜内放置一个带盖的塑料盒，用于运输BC-MPS。建议该盒子尺寸至少为35.5 cm（长）× 28 cm（宽）× 8.25 cm（高），以便容纳4块BC-MPS培养板。打开盒盖，并用70%乙醇喷洒支架、冲头和盒子表面。</li>
	<li>通过高压灭菌或将其置于生物安全柜中并用70%乙醇清洗的方式，准备无菌的剃刀刀片和镊子。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒冲头和盒子，并开启生物安全柜内的紫外灯至少30分钟，以对器械进行灭菌处理。</li>
</ol>
3. 准备明胶冲头并将其应用于上层细胞层
<ol>
	<li>如果明胶溶液已预先配制，将其放入37 °C水浴中加热以使其融化。</li>
	<li>在生物安全柜中，使用5 mL或10 mL移液管将明胶溶液加至活塞上。每孔6孔板所需的活塞需加入约2.5 mL明胶。</li>
	<li>待明胶在活塞上凝固（约30–45分钟）后，将涂有pNIPAAm的ASC培养板移至生物安全柜中。轻轻将活塞放入pNIPAAm包被的ASC培养板的孔中，使明胶接触ASC。在活塞上放置一个金属垫圈（约7.5 g），以压住活塞，确保明胶与ASC细胞层直接接触。将活塞在室温下静置于ASC细胞层上30分钟。</li>
	<li>轻轻将带有活塞的培养板移入生物安全柜中的无菌盒内，并盖上盖子。将该盒子放入4 °C冰箱中30分钟。若无4 °C冰箱，可将培养板置于生物安全柜内的冰桶冰上保持30分钟。</li>
</ol>
4. 癌细胞系的制备
<ol>
	<li>将癌细胞系接种于标准的T75组织培养瓶中，并进行常规培养，使细胞在准备BC-MPS的当天达到约80%融合度。（每个BC-MPS需要约200,000个癌细胞）。使用常规培养基培养癌细胞。 
	注意：为了识别和分离癌细胞，建议将细胞转染表达荧光蛋白，以便将其与ASCs及乳腺组织区分开来。每个BC-MPS所需的癌细胞数量已针对MCF7和MDA-MB-231细胞系优化。其他细胞系可能需要进一步优化。</li>
	<li>在准备BC-MPS当天，将含有癌细胞的培养瓶转移至生物安全柜中。吸除培养瓶中的培养基，并用5 mL PBS洗涤培养瓶。</li>
	<li>向含有癌细胞的培养瓶中加入1 mL细胞解离液，然后将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育，直至细胞完全脱落（约2–5分钟）。</li>
	<li>在生物安全柜中向培养瓶中加入9 mL PBS，将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，并使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。</li>
	<li>在室温下以500 × g 离心5分钟，沉淀癌细胞。</li>
	<li>用BC-MPS培养基重悬细胞，调整细胞密度至2 × 106 个/mL。</li>
	<li>将细胞置于37 °C水浴中保温，待其准备加入人组织时使用。</li>
</ol>
5. 人乳腺组织的处理
<ol>
	<li>在生物安全柜中，用 10 mL 无菌 PBS 将人乳腺组织（HBT）清洗 3 次。</li>
	<li>使用无菌镊子和剃刀刀片将 BC-MPS 粗略切碎，并尽可能去除筋膜和结缔组织。若未彻底去除结缔组织，可能导致 ASC 上层无法正确锚定 HBT。 
	注意：筋膜和结缔组织呈白色或透明状，与脂肪组织的黄色相比可明显区分。</li>
	<li>去除结缔组织后，使用无菌剃刀刀片将组织进一步精细切碎，直至形成均匀的液态状。当组织可使用 25 mL 血清移液枪头轻松移取时，即视为已充分切碎。</li>
	<li>使用无菌剃刀刀片将 p1000 移液枪头的尖端切去，以辅助移取切碎后的 HBT。</li>
	<li>在 1.5 mL 离心管中混合切碎的 HBT、癌细胞系和 BC-MPS 培养基（对于 6 孔板中的 1 个孔，需加入 200 µL 切碎的 HBT、100 µL BC-MPS 培养基和 100 µL 癌细胞）。</li>
	<li>将用于底部细胞层的 ASC 培养板从培养箱转移至生物安全柜中。吸除底部 ASC 培养板中的培养基。使用第 5.4 步中已切去远端的 p1000 移液枪头，将混合液移取至底部 ASC 培养板孔的中央。</li>
	<li>将装有带活塞的上层 ASC 培养板的盒子转移至生物安全柜中。轻轻将明胶活塞从 pNIPAAm 涂层的培养板上取下，并放置于 HBT 混合物上方。向孔中加入 BC-MPS 培养基（对于 6 孔板中的 1 个孔，加入 2 mL 培养基）。小心地将带有 BC-MPS 混合物和活塞的底部 ASC 培养板转移至无菌塑料盒中，并盖上盒盖以便运输。 
	注意：当活塞仍在培养板上时，6 孔板的盖子无法盖回 ASC 培养板上。操作时需格外注意避免污染培养物。</li>
	<li>将装有培养板的盒子置于 37 °C 培养箱中孵育，直至明胶完全融化，且上层 ASC 开始粘附于下层（约 30 分钟）。</li>
	<li>将装有培养板的盒子转移至生物安全柜中。轻轻将活塞从底部培养板上取下。此时，含有癌细胞的组织将锚定在孔的底部。</li>
	<li>将 6 孔板的盖子重新盖回底部培养板上，并在 37 °C 下继续孵育，直至明胶完全融化，且上层完全锚定于下层（约 30–60 分钟）。</li>
	<li>轻柔地将培养板转移至生物安全柜中，使用 10 mL 血清移液管吸除培养基。向每个孔中加入 2 mL 新鲜培养基。吸液和加液均应沿孔边缘操作，以避免组织移位。</li>
	<li>将 BC-MPS 系统维持在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养所需时间，并每 2–3 天更换一次培养基。</li>
</ol>
6. 用于分析的 BC-MPS 消化
<ol>
	<li>当BC-MPS准备进行分析时，将培养板转移至生物安全柜中。使用移液管移除培养基，以避免意外脱落任何组织。</li>
	<li>向每个孔中加入1体积的PBS。</li>
	<li>使用移液管移除PBS。</li>
	<li>向每个孔中加入1 mL细胞解离溶液。将培养板放回培养箱，在37 °C孵育5分钟，使细胞脱落。在生物安全柜中，使用细胞刮刀将细胞和组织从培养板上完全刮下。</li>
	<li>使用移液管将含有组织的溶液转移至15 mL锥形管中。向每个孔中加入2 mL PBS，以收集残留的细胞，并将该溶液转移至同一锥形管中。如果细胞具有荧光性，需用铝箔包裹管子以避光。</li>
	<li>将锥形管置于37 °C下，在轨道摇床中以1 × g持续振荡孵育10–20分钟，以彻底将细胞从组织中解离。</li>
	<li>在生物安全柜中，使用移液管轻轻吹打管中任何残留的细胞团块，并通过250 µm细胞筛网将样品过滤至新的15 mL离心管中。缓慢地将溶液通过筛网，防止溢出。</li>
	<li>用1 mL PBS冲洗筛网，以收集仍滞留在筛网中的细胞。</li>
	<li>在室温下以500 × g离心5分钟。离心后，脂肪细胞将漂浮在溶液上层，而癌细胞和脂肪源性基质细胞（ASCs）则混合在一起，形成位于管底的沉淀。</li>
	<li>为分离脂肪细胞，可轻柔地将上层液体倒入新管中；或剪去P1000移液枪头的尖端，将上层液体转移至新管。再次以500 × g离心5分钟，然后使用注射器和针头从脂肪细胞下方吸除液体，仅保留脂肪细胞。此时脂肪细胞已准备好用于分析。</li>
	<li>去除脂肪细胞后，若癌细胞先前已转染荧光蛋白，则可进一步将ASCs与癌细胞分离用于分析。吸取含有ASCs和癌细胞的离心管中剩余液体时，注意不要扰动细胞沉淀。将沉淀重悬于PBS或BC-MPS培养基中，利用流式细胞术根据荧光信号对细胞进行分选。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争利益。

为了更好地理解乳腺癌疾病，亟需开发新的系统来模拟人类乳腺癌。构建包含天然细胞外基质（ECM）和间质细胞的疾病模型的人源微生理系统，将提高临床前研究的预测能力。本文介绍的BC-MPS模型是一种新开发的系统，克服了以往模型的局限性，能够在原生人乳腺组织（HBT）环境中评估乳腺癌（BC）。该系统既可使用癌细胞系，也可使用肿瘤外植体，且至少可稳定维持14天。通过荧光标记乳腺癌细胞，可实时或在特定时间点观察癌细胞的运动性、细胞间相互作用、迁移、存活率或增殖情况（图3 和 图5）。该模型系统可用于阐明与癌细胞及其微环境之间相互作用相关的癌症生物学重要机制。对该系统的深入研究有助于揭示肿瘤微环境（TME）对癌症进展、药物反应以及转移起始的调控作用。
为了成功建立该系统，需要遵循几个关键步骤。第一个关键步骤是ASC细胞片的培养与转移。经pNIPAAm包被的培养板具有温度敏感性。当培养板温度高于32 °C时，其表面呈疏水性，ASC细胞会附着于表面；当温度低于此阈值时，表面变为亲水性...

每年，美国有超过 40,000 名女性死于乳腺癌（BC）1。尽管每年在乳腺癌研究上的投入超过 7 亿美元，但 97% 的候选乳腺癌药物在临床试验中失败2,3。迫切需要建立新的模型，以改善药物研发流程并加深对乳腺癌的理解。美国国立卫生研究院微生理系统（MPS）计划明确了突破性模型所需具备的特征，以促进基础科学向临床成功的转化4。这些特征包括使用原代人源细胞或组织、在培养中稳定维持 4 周、并包含天然组织结构和生理反应。
目前的体外乳腺癌模型，例如乳腺癌细胞系的二维培养、膜插件共培养以及三维球状体和类器官，均不符合美国国立卫生研究院（NIH）的微生理系统（MPS）标准，因为这些模型均未能重现天然乳腺组织的结构。当在这些系统中添加细胞外基质（ECM）时，并未使用乳腺来源的ECM，而是采用胶原凝胶和基底膜基质。
目前的体内系统，例如患者来源的异种移植模型（PDX），同样不符合美国国立卫生研究院（NIH）的微生理系统（MPS）标准，因为小鼠乳腺组织与人类乳房存在显著差异。此外，免疫系统与乳腺癌之间的相互作用在肿瘤发生过程中日益被认为至关重要，但用于构建PDX肿瘤的免疫缺陷型小鼠模型缺乏成熟的T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。 Furthermore，尽管PDX模型能够维持并扩增原发性乳腺肿瘤，但所获得的PDX肿瘤中已浸润了小鼠来源的原代基质细胞和细胞外基质（ECM）5。
为了克服这些挑战，我们开发了一种新型的体外三维人类乳腺微生理系统（MPS），该系统符合美国国立卫生研究院（NIH）MPS标准。本乳腺MPS的基础是将原代人类乳腺组织（HBT）夹在两层脂肪来源的干细胞（ASCs）之间，而这些ASCs也来源于HBT（图1）。用于转移细胞片层以夹合HBT的冲压装置可通过3D打印或使用简单的丙烯酸塑料制成（图1H，I）。该技术改进自我们先前报道的原代人类白色脂肪细胞组织培养方法6,7。随后，可在该乳腺MPS中接种任意选择的乳腺癌（BC）模型，范围涵盖标准BC细胞系至原代人类乳腺肿瘤。本文中，我们证明这些BC-MPS在培养中可稳定维持数周（图2）；包含HBT的天然组分，如乳腺脂肪细胞、细胞外基质（ECM）、内皮细胞和免疫细胞（图3）；并能再现BC与HBT之间的生理相互作用，例如代谢串扰（图4）。最后，我们展示BC-MPS可用于研究BC细胞在HBT中进行的变形虫样运动（图5）。

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>1333</td><td>用于分离乳腺癌-间充质干细胞（BC-MPS）的细胞解离液</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>用于细胞传代的细胞脱离溶液</td></tr><tr><td>BioStor Container 16oz</td><td>National Scientific Supply Co</td><td>MPCE-T016</td><td>用于无菌组织的运输</td></tr><tr><td>细胞培养瓶 75 cm²</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>用于ASCs的培养</td></tr><tr><td>锥形管 15 mL&amp;nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>ThermoScientific</td><td>1631T5</td><td>用于组织切碎过程中的组织操作&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM低糖培养基，含Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td>用于ASCs和BC-MPS的培养</td></tr><tr><td>经鉴定合格的胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10倍浓缩液</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Nunc UpCell 6孔板</td><td>ThermoScientific</td><td>174901</td><td>用于顶部ASC细胞片层</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（5,000 U）</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 150 mm</td><td>FisherBrand</td><td>FB0875714</td><td>用于组织切碎时盛放组织&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>单刃，用于组织切碎</td></tr><tr><td>筛网 250 µm&amp;nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>87791</td><td>用于分离BC-MPS</td></tr><tr><td>组织培养6孔板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>用于底部ASC细胞片层</td></tr><tr><td>配重/垫圈</td><td>BCP Fasteners</td><td>BCP672</td><td>用于压紧活塞，内径1/2&quot;</td></tr></tbody></table>

使用微生理系统在人乳腺组织中建立乳腺癌模型

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

乳腺癌（BC）仍然是导致女性死亡的主要原因。尽管每年在乳腺癌研究上的投入超过7亿美元，但97%的候选药物在临床试验中失败。因此，需要新的模型来加深对这种疾病的理解。美国国立卫生研究院（NIH）微生理系统（MPS）计划旨在提高基础科学发现和有前景的新治疗策略向临床应用的转化效率。本文介绍一种用于构建乳腺癌微生理系统（BC-MPS）的方法。该模型改进了先前描述的一种方法，即通过将白色脂肪组织（WAT）夹在脂肪来源的干细胞片（ASC）之间来培养原代人白色脂肪组织（WAT）。本BC-MPS的创新之处在于：将乳腺癌细胞接种到含有天然细胞外基质、成熟脂肪细胞、定居的成纤维细胞和免疫细胞的非病变人乳腺组织（HBT）中；再将乳腺癌与HBT的混合物夹在来源于HBT的ASC细胞片之间。所构建的BC-MPS在体外培养中至少可稳定维持14天。该模型系统包含了影响乳腺癌的多种微环境成分，包括脂肪细胞、基质细胞、免疫细胞以及细胞外基质。因此，BC-MPS可用于研究乳腺癌与其微环境之间的相互作用。
我们通过研究两种已知会影响癌症进展和转移的乳腺癌（BC）行为来展示本研究中BC-MPS的优势：1）乳腺癌细胞的运动性；2）乳腺癌细胞与人乳腺脂肪组织（HBT）之间的代谢串扰。尽管此前已通过活体成像技术展示了乳腺癌细胞的运动性，但BC-MPS系统能够利用荧光显微镜实现持续数天的高分辨率时间序列成像。此外，虽然代谢串扰此前曾通过乳腺癌细胞与小鼠前脂肪细胞分化为未成熟脂肪细胞的共培养模型得以证实，但我们的BC-MPS模型是首个在体外展示原代人乳腺脂肪细胞与乳腺癌细胞之间存在此类代谢串扰的系统。

培养过程中的稳定性 
BC-MPS 是一种稳定的微生理系统，可在体外培养至少14天。在100倍放大倍数下拍摄ASC细胞片的明场图像，以显示融合细胞片的条纹状结构（图2A）。ASC细胞片在培养中至少可保持稳定4周。在6孔板的一个孔中培养14天后的BC-MPS使用彩色相机成像，结果显示漂浮的HBT仍通过ASC细胞片稳定锚定在孔底（图2B）。这表明用于夹持脂肪组织的细胞片仍然完整。表达RFP的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231在HBT中培养14天后，通过荧光显微镜成像，显示BC-MPS与细胞系共培养至少14天仍保持稳定（图2C）。组织中乳腺癌细胞的存在表明癌细胞具有侵袭HBT的能力。将来自小鼠的三阴性PDX组织块切除后，用Cell Tracker CMTPX染色，并与HBT共同培养。在第6天进行荧光显微镜成像，以显示BC-MPS与肿瘤组织块共培养至少6天的稳...

本方案描述了一种利用现成材料和原代人乳腺组织构建体外微生理系统以研究乳腺癌的方法。

乳腺癌（BC）仍然是女性死亡的主要原因。尽管每年在乳腺癌研究上的投入超过7亿美元，但97%的候选乳腺癌药物……

这是首个能够将人类乳腺组织在体外长期维持存活的实验方案，从而直接促进对人类乳腺组织与人类乳腺癌之间相互作用的研究。该技术的主要优势在于，它能够使包含乳腺脂肪细胞、免疫细胞、血管结构、导管结构以及细胞外基质在内的大块人类乳腺组织在体外保持活性。该技术对多个乳腺癌研究领域具有重要意义，包括个体化医疗、药物开发，以及肿瘤发生机制和较慢性的乳腺癌相关过程（如纤维化和细胞外基质重塑）的病理生理学研究。本实验操作由本实验室的杜兰大学研究生凯瑟琳·赫伯特（Katherine Hebert）以及杜兰大学医学院学生拉凯什·古拉拉（Rakesh Gurrala）示范。首先，将制备好的明胶溶液置于37摄氏度水浴中融化。使用5或10毫升的血清移液管，将2.5毫升该溶液分别加入六孔板每个孔的活塞上。待明胶凝固后，将带有 pNIPAAm 编码的 ASC 培养板转移至生物安全柜中。轻轻将柱塞放入培养板的孔中，使明胶接触 ASC。在柱塞上放置一个金属垫圈以增加重量，确保明胶与 ASC 单层直接接触，在室温下维持 30 分钟。在生物安全柜中，轻轻将带有柱塞的培养板放入无菌盒内，并盖上盖子。将盒子移至4°C冰箱，或将培养板置于生物安全柜中的冰盒冰上，静置30分钟。在生物安全柜中，用10毫升无菌PBS清洗人乳腺组织三次。使用无菌镊子和剃刀片将乳腺癌转移灶组织（BC-MPS）进行粗略剪切，并尽可能去除筋膜和结缔组织。待结缔组织去除后，使用无菌剃刀片将组织进一步剪切至呈现均一的液状质地。剪去P1000移液器吸头的尖端，以协助移取剪切后的组织。在1.5毫升离心管中，按照文稿所述，将切碎的组织、癌细胞系和BC-MPS培养基混合。将用于底部细胞层的ACS板从培养箱转移至生物安全柜中，并吸除板中的培养基。使用剪切过的移液枪头，将制备好的乳腺组织混合物滴加到底部ACS板孔的中央，然后将装有带活塞上层ACS板的盒子移至生物安全柜中。轻轻将明胶柱塞从 pNIPAAm 涂层板上取下，并将其放置在组织混合物上方。向孔中加入 BC-MPS 培养基，小心地将含有 BC-MPS 混合物和柱塞的底部 ACS 板转移至无菌塑料盒中。盖上盒子的盖子进行运输，注意避免培养物受到污染。将底部培养板放入盒子中，并置于37摄氏度培养箱内孵育，直至明胶完全融化且顶部ACS层开始与底层粘附。随后将装有培养板的盒子转移至生物安全柜中，轻轻取出底部培养板中的柱塞，以观察锚定于孔底部的癌细胞组织。将六孔板的盖子重新盖回底部培养板上，于37摄氏度继续孵育，使明胶完全融化，并让顶部层充分锚定于底层。将培养板轻轻转移至生物安全柜中，使用10毫升血清移液管从孔的边缘吸出培养基。在每个孔的边缘加入2毫升新鲜培养基，以避免组织移位。将BC-MPS在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养所需的时间。每两到三天更换一次培养基。当BC-MPS准备进行分析时，将培养板转移至生物安全柜中。使用血清学移液管移除培养基，以避免意外扰动任何组织。向每个孔中加入一倍体积的 PBS。然后用刻度移液管吸除 PBS。向每个孔中加入 1 毫升细胞解离溶液，并将培养板放回培养箱中孵育 5 分钟，以使细胞脱落。孵育后，在生物安全柜中使用细胞刮刀将细胞和组织从培养板上完全刮下。将含有组织的溶液转移至15毫升锥形管中，并加入2毫升PBS收集残留的细胞。如果细胞具有荧光，请用铝箔包裹试管。将试管置于37摄氏度下，在轨道摇床中以1 × g的转速持续振荡孵育10至20分钟，以彻底使细胞从组织中解离。在生物安全柜中，使用血清学移液管将试管中任何残留的细胞团块打散。然后通过250 µm的组织筛网将样品过滤至新的15 mL离心管中。用一毫升磷酸盐缓冲液冲洗滤网，以收集任何残留的细胞。在室温下以500 × g离心样品五分钟，使脂肪细胞（位于上层液体中）与细胞沉淀中的癌细胞和ASCs分离开。使用去尖端的移液器吸头将脂肪细胞层转移至新的离心管中。再次离心样品，使用注射器和针头从脂肪细胞下方移除残留溶液。从含有ASCs和癌细胞的试管中吸取残留溶液，注意不要扰动细胞沉淀。将沉淀重悬于PBS或BC-MPS培养基中，利用流式细胞术根据荧光信号对细胞进行分选。此处展示了融合的ASC细胞片的条带辅助排列模式。经过14天培养后，漂浮的人类乳腺组织仍通过ASC细胞片稳定地锚定在培养孔底部。荧光显微镜图像显示，在培养14天后，表达RFP的MDA-MB-231细胞系构建的BC-MPS保持稳定；三阴性肿瘤组织来源的PDX模型在至少6天内也保持稳定。含有乳腺组织的BC-MPS在体外培养14天后进行染色和成像，以在100倍和20倍放大倍数下展示组织的天然组分。通过巨噬细胞标志物的染色，显示原代巨噬细胞在培养第3天和第7天后仍得以保留。经Bodipy染色的MDA-MB-231细胞在培养14天后进行流式细胞术分析，结果表明在2D培养条件下脂质积累极少，而在BC-MPS中则出现大量脂质积累。在BC-MPS中，脂质阳性的MDA-MB-231细胞比例比2D培养条件下高26.2倍。与标准2D培养的细胞相比，BC-MPS中培养的细胞显示出更多的脂滴。用RFP标记的含MDA-MB-231细胞的BC-MPS的延时成像显示，231细胞呈现阿米巴样运动，具有伪足并表现出高迁移能力。乳腺组织必须被切碎至足够小并充分分散，以便均匀分布于孔板底部。乳腺组织具有较强的浮力，如果组织块过大或过于密集地聚集在一起，ASC细胞层将无法将乳腺组织固定在孔板底部。所形成的乳腺组织癌构建体可经过酶消化处理，以分离出特定的感兴趣细胞类型。这将有助于回答一些关键问题，例如乳腺组织中的癌细胞对化疗的反应与传统二维培养或类器官相比有何不同。

modeling-breast-cancer-human-breast-tissue-using-microphysiological

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

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