Name: 纯化的DEC-205定向抗体与全长蛋白的化学偶联，用于在体外和体内靶向小鼠树突状细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解DEC-205抗体与OVA抗原的化学偶联方法，用于小鼠树突状细胞靶向。该技术无需基因融合，可灵活选择蛋白抗原和抗体，适用于抗肿瘤疫苗开发及免疫治疗研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者感谢 S. Prettin 提供的专业技术协助。本工作由德国研究中心联合会（HGF）的资助支持，该资助为“癌症免疫治疗”亥姆霍兹联盟&#34;（HCC_WP2b）项目的一部分。

<ol><li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663(2020).</li>
<li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li>
<li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li>
<li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li>
<li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li>
<li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418(2019).</li>
<li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li>
<li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4%2B+T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li>
<li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+T+helper+1+%28Th1%29+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin%2C+DEC205%2C+and+Clec9A%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li>
<li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel%2C+DC-restricted+C-type+lectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li>
<li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985(2017).</li>
<li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans%27+cells%2C+veiled+cells%2C+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li>
<li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly%28I%3AC%29%2FCpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

将特异性靶向内吞作用受体的抗体与蛋白质抗原进行化学偶联，提供了一种高效且重要的是具有高度灵活性的方法 体内 在临床前小鼠模型中靶向树突状细胞。本方案提供了一种高效方法，可成功将模型抗原OVA与特异性靶向DEC-205的IgG抗体进行偶联。
在我们的实验方案中，αDEC-205 从杂交瘤细胞系中纯化而来，过去我们曾如所述使用蛋白G琼脂糖进行抗体纯化。值得注意的是，在后续研究中我们也采用了FPLC纯化αDEC-205，其后的化学偶联同样高效。实现高效化学偶联的关键步骤是对抗体和蛋白的预处理。我们从多种现有方案中优化了这些步骤，最终确定将抗体与交联剂sulfo-SMCC孵育，并通过TCEP-HCl还原蛋白。具体而言，关键步骤包括TCEP-HCl的新鲜配制（步骤3.1）以及TCEP-HCl与蛋白孵育的时间控制，后者不应延长（步骤3.1.2）。此外，用于TCEP-HCl还原二硫键的蛋白缓冲液也至关重要，因其可能对TCEP-HCl的还原效果产生负面影响。同时，必须立即将活化的抗体与还原后的蛋白混合（步骤3.3.6），以确保偶联反应的最佳条件。在我们的实验中，该方法在偶联效率和...

树突状细胞（DC）是免疫系统中的关键细胞。它们是一类在抗原提呈方面具有特殊功能的异质性细胞，主要作用是连接先天性免疫与适应性免疫1,2。重要的是，树突状细胞不仅在高效且特异的抗病原体免疫应答中发挥重要作用，还参与抗肿瘤免疫的多个方面1,3。
由于树突状细胞（DC）在宿主免疫中具有独特作用，因此成为疫苗接种的靶细胞而受到关注4一种方法是将抗原靶向树突状细胞（DC） 体内 以诱导抗原特异性免疫反应，近年来已有大量研究致力于确定合适的受体及靶向策略1,4一个例子是C型凝集素受体DEC-205，可通过特异性靶向DEC-205的抗体诱导其内吞作用。重要的是，将DEC-205靶向与合适的佐剂联用，已被证明可有效诱导持久且具有保护性的CD4⁺ T细胞应答。+ 和 CD8+ T细胞以及针对肿瘤抗原的抗体反应3,5,6,7,8,9.
已有大量研究表明，将抗原与树突状细胞（DC）靶向分子偶联后，其效果优于游离的非偶联抗原3,5,10,11,12。因此，将抗原与相应的DC靶向部分进行偶联，成为DC靶向策略中的关键步骤。在利用抗体或抗体片段实现DC靶向的情况下，抗原可通过化学或基因方式连接，两种策略各有其优缺点1。一方面，在基因工程构建的抗体-抗原复合物中，抗原剂量及其连接位置可控，从而在不同批次之间具有更好的可比性1；但另一方面，化学偶联所需准备时间更短，在实验性及临床前模型中，若需测试和比较不同抗原和/或疫苗接种策略时，具有更高的灵活性。
在此，我们介绍一种高效且可靠的化学偶联方法，将卵清蛋白（OVA）作为模式蛋白抗原与靶向DEC-205的IgG2a抗体（αDEC-205）进行偶联，适用于 体内 小鼠中的树突状细胞靶向。首先，从&#160;NLDC-145 杂交瘤细胞13采用化学偶联方法时，使用异双功能交联剂磺基琥珀酰亚胺-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯（sulfo-SMCC），该试剂含有NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）酯和马来酰亚胺基团，可实现含氨基和巯基分子的共价偶联。具体而言，抗体上的伯氨基首先与sulfo-SMCC反应，生成带有马来酰亚胺活性的αDEC-205；随后，该活化产物与经TCEP-HCl（盐酸三（2-羧乙基）膦）还原后含有巯基的OVA蛋白发生反应。最终获得化学偶联产物αDEC-205/OVA。图1）。除了化学偶联本身外，本方案还描述了从偶联物中去除过量OVA的方法&#160;以及通过蛋白质印迹分析和特异性酶联免疫吸附测定验证偶联成功。我们此前已成功采用该方法将OVA及其他蛋白质或免疫原性肽段化学偶联至αDEC-205。我们证实了其与CD11c的高效结合+ 细胞 体外 以及有效诱导细胞免疫和体液免疫 体内.
当然，该方法存在一些缺点，例如在不同批次之间的可比性以及最终偶联物中抗原的精确剂量控制方面。然而，与基因工程构建体相比，化学偶联法在抗体和蛋白抗原的选择上提供了更大的实验灵活性。因此，我们认为该方法在评估不同抗原在临床前小鼠模型中靶向树突状细胞的效率时尤为有价值，特别是在特异性抗肿瘤免疫反应的背景下。

<table><tbody><tr><td>抗体缓冲液 2 %</td><td></td><td></td><td>TBS-T 中含 2 % (w/v) Slim-Fast 巧克力粉</td></tr><tr><td>抗体缓冲液 5 %</td><td></td><td></td><td>TBS-T 中含 5 %（w/v）脱脂奶粉</td></tr><tr><td>封闭缓冲液（ELISA）</td><td></td><td></td><td>PBS 中含 10% FBS</td></tr><tr><td>封闭缓冲液 4 %</td><td></td><td></td><td>TBS-T 中含 4 % (w/v) Slim-Fast 巧克力粉</td></tr><tr><td>封闭缓冲液 10 %</td><td></td><td></td><td>TBS-T 中含 10 % (w/v) 脱脂奶粉</td></tr><tr><td>T25 细胞培养瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td>我们使用标准的 CELLSTAR 带滤膜瓶盖细胞培养瓶；也可选用悬浮培养瓶（690195）</td></tr><tr><td>T75 细胞培养瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>我们使用标准 CELLSTAR&amp;nbsp; 带滤膜盖的细胞培养瓶；或 alternatively 使用悬浮培养瓶（658195）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T175 细胞培养瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>661175</td><td>我们使用标准的 CELLSTAR 带滤膜瓶盖细胞培养瓶；也可选用悬浮培养瓶（661195）</td></tr><tr><td>离心浓缩管，截留分子量 10 kDa</td><td>赛多利斯</td><td>VS2001</td><td>Vivaspin 20 离心浓缩器</td></tr><tr><td>离心式蛋白浓缩器，截留分子量 100 kDa，5 - 20 ml</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88532</td><td>Pierce 蛋白浓缩器，PES 5–20 ml；我们使用的是 Pierce 浓缩器 150K MWCO 20 mL（货号 89921），但该产品目前已不再供应&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Nalgene</td><td>525-2314</td><td>500 ml 聚丙烯共聚物（PPCO）容器，带聚丙烯（PP）螺口盖；购自德国 VWR</td></tr><tr><td>包被缓冲液（ELISA）</td><td></td><td></td><td>0.1 M 碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H中的）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O（pH 9.6）</td></tr><tr><td>脱盐柱 截留分子量 7 kDa</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89891</td><td>Thermo Scientific Zeba 脱盐离心柱，7K 分子量截留值，5 mL</td></tr><tr><td>检测试剂 ELISA（HRPO 底物）</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T8665-100ML</td><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-四甲基联苯胺（TMB）液体底物系统</td></tr><tr><td>Western blot 检测试剂（HRPO 底物）</td><td>罗氏/默克</td><td>12 015 200 01</td><td>Lumi-Light 蛋白质印迹底物（Roche）</td></tr><tr><td>透析袋截留分子量 12 - 14 kDa</td><td>SERVA 电泳</td><td>44110</td><td>Visking 透析管，16 毫米直径</td></tr><tr><td>ELISA 96孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>442404</td><td>MaxiSorp Nunc-Immuno 板</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAN-BIOtech</td><td>P40-47500</td><td>FBS 优质培养基</td></tr><tr><td>ISF-1 培养基</td><td>Biochrom/bioswisstec</td><td>F 9061-01</td><td></td></tr><tr><td>奶粉</td><td>卡尔·罗斯</td><td>T145.2</td><td>脱脂奶粉，印迹级，低脂肪；也可选用市售普通脱脂奶粉</td></tr><tr><td>NLDC-145 杂交瘤</td><td>ATCC</td><td>HB-290</td><td>若尚未备有，可从ATCC获取杂交瘤细胞</td></tr><tr><td>非还原性SDS上样缓冲液 4 x&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>12 ml：10 % SDS 4 ml，600 &amp;micro;l 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)，3.3 ml 无菌 H₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，4 ml 甘油，100 &amp;micro;5% 溴酚蓝</td></tr><tr><td>卵清蛋白</td><td>Hyglos（通过 BioVendor）</td><td>321000</td><td>EndoGrade OVA 超纯 &amp;lt;0.1 EU/mg</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td>Gibco 青霉素/链霉素 10,000 U/ml；也可使用 Gibco 青霉素/链霉素 5,000 U/ml (15070-063)</td></tr><tr><td>PETG 聚对苯二甲酸乙二醇酯共聚物细胞培养滚瓶</td><td>Nunc 体外实验</td><td>734-2394</td><td>标准PDL包被、带透气膜（1.2X）、1050 cm²培养瓶&amp;sup2;，100 - 500 ml 容量；购自德国 VWR&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pH 指示试纸</td><td>默克</td><td>109535</td><td>pH 指示试纸 0-14</td></tr><tr><td>多克隆山羊 &amp;alpha;大鼠IgG(H+L)-HRPO（Western印迹）</td><td>杰克逊免疫研究实验室&amp;nbsp;</td><td>112-035-062</td><td>购自德国 Dianova；用于 Western 印迹时稀释比例为 1:5000</td></tr><tr><td>多克隆山羊 &amp;alpha;大鼠 IgG+IgM-HRPO 抗体&amp;nbsp; （ELISA）</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>112-035-068</td><td>购自德国 Dianova；ELISA 实验中使用浓度为 1:2000</td></tr><tr><td>多克隆山羊 &amp;alpha;兔IgG-HRPO（Western印迹）</td><td>杰克逊免疫研究实验室&amp;nbsp;</td><td>111-035-045&amp;nbsp;</td><td>购自德国 Dianova；用于 Western 印迹时稀释比例为 1:2000</td></tr><tr><td>多克隆兔 &amp;alpha;OVA（ELISA）</td><td>Abcam</td><td>ab181688</td><td>3 ng/使用&amp;micro;l</td></tr><tr><td>多克隆兔 &amp;alpha;OVA 抗体（蛋白质印迹）</td><td>OriGene</td><td>R1101</td><td>用于 Western 印迹时按 1:3,000 稀释</td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 柱</td><td>默克/密理博</td><td>P3296</td><td>将5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow 装填至空的PD-10柱（Merck，GE 17-0435-01）中</td></tr><tr><td>蛋白标准品</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26616</td><td>PageRuler 预染蛋白标准品 10 - 180 kDa</td></tr><tr><td>PVDF（聚偏二氟乙烯）膜</td><td>默克/密理博</td><td>IPVH00010</td><td>Immobilon-P PVDF（聚偏二氟乙烯）膜</td></tr><tr><td>橡胶塞</td><td>Omnilab</td><td>5230217</td><td>德语 &amp;和 NEUMANN 橡胶塞（下部 &amp;Phi; 17 毫米；上方 &amp;Phi; 22 mm</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Omnilab</td><td>5430925</td><td>德语 &amp;和 NEUMANN（内部） &amp;Phi; 1 mm；外侧 &amp;Phi; 3 mm</td></tr><tr><td>Slim-Fast</td><td></td><td></td><td>我们使用了药店可随意购买的普通Slim-Fast巧克力，因为在该蛋白质印迹方法中，其效果优于奶粉</td></tr><tr><td>终止液（ELISA）</td><td></td><td></td><td>1M H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>sulfo-SMCC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22322</td><td>Pierce Sulfo-SMCC 交联剂；也可使用货号 A39268（10 × 2 mg）</td></tr><tr><td>0.22 微米注射器滤器单元 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>默克/密理博</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV 注射器滤器，0.22 &amp;micro;m，PVDF，33 mm，γ射线灭菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>Omnilab</td><td></td><td>一次性注射器 Injekt&amp;reg; Solo B. Braun</td></tr><tr><td>斯特里坎&amp;reg; 套管针</td><td>B. Braun</td><td></td><td>斯特里坎&amp;reg; G 20 x 1 1/2""；0.90 x 40 mm；黄色</td></tr><tr><td>TBS-T</td><td></td><td></td><td>含0.1% (v/v) 吐温-20的Tris缓冲盐水</td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A35349</td><td></td></tr><tr><td>管路连接器</td><td>Omnilab</td><td></td><td>Kleinfeld 微型管路连接器（用于硅胶管）</td></tr></tbody></table>

化学偶联靶向dec-205的纯化抗体与全长蛋白以靶向小鼠树突状细胞 体外 和 在体 内

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

靶向抗原递送至交叉提呈树突状细胞（DC） 在体内 高效诱导效应T细胞反应，并展现出一种有价值的方法&#160;疫苗设计。通过针对内吞受体（如DEC-205）的特异性抗体将抗原递送至树突状细胞，从而诱导抗原的摄取、加工以及MHC I类和II类分子的呈递。
高效且可靠的将目标抗原与合适的抗体偶联是树突状细胞（DC）靶向中的关键步骤，该过程在很大程度上取决于抗原的形式，并涉及化学偶联方法&#160;全长蛋白与纯化抗体交联是一种可行的策略。过去，我们已成功建立了模型抗原卵清蛋白（OVA）与特异性针对DEC-205的IgG2a抗体（αDEC-205）的交联&#160;用于 体内 小鼠中的树突状细胞靶向研究。该实验方案的第一步是通过亲和层析法从NLDC（非淋巴样树突状细胞）-145杂交瘤的上清液中纯化抗体。纯化后的抗体通过磺基-SMCC（磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯）进行活化以用于化学偶联，同时通过与TCEP-HCl（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）孵育暴露OVA蛋白的巯基。去除过量的TCEP-HCl和磺基-SMCC后，将抗原与活化的抗体混合，进行过夜偶联。所得的αDEC-205/OVA偶联物被浓缩并去除未结合的OVA。通过蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附测定（ELISA）验证OVA与αDEC-205的成功偶联。
我们已成功使用化学交联的αDEC-205/OVA在肝脏中诱导细胞毒性T细胞反应，并比较了不同佐剂在诱导体液和细胞免疫反应方面的潜力 体内 靶向 DEC-205+ DC。此外，这类化学偶联的抗体/抗原复合物为有效诱导针对肿瘤抗原的疫苗免疫反应提供了有价值的工具，在预防和治疗多种肿瘤方面已证明优于传统的免疫方法。

使用本方案将αDEC-205与OVA蛋白进行化学偶联，通常可高效制备αDEC-205/OVA 体内 DC靶向策略。有多种方法可用于验证该技术本身以及检测所获得偶联物的功能性。Western blot分析和ELISA用于验证偶联是否成功，同时检测可能残留的游离OVA图2). 体外 结合研究（图3）和 体内 免疫接种图4）证实偶联物与DEC-205结合并靶向树突状细胞（DC）。
通过平行的蛋白质印迹分析，可同时检测偶联的OVA（图2A）以及偶联的αDEC-205（图2B）。具体而言，印迹中在抗体分子量位置出现...

我们描述了一种将模型抗原卵清蛋白化学偶联至内吞作用受体特异性抗体的方案，用于体内树突状细胞靶向。该方案包括抗体的纯化、抗原的化学偶联、偶联物的纯化以及偶联效率的验证。

化学偶联靶向DEC-205的纯化抗体与全长蛋白以靶向小鼠树突状细胞 体外 和 在体 内

将抗原靶向递送至体内具有交叉提呈功能的树突状细胞（DC）可高效诱导效应T细胞应答，是一种具有重要价值的策略……

本方案已对所有实验条件进行了精心优化，可用于实现DEC-205抗体与OVA抗原的成功且高效的化学偶联。该技术的主要优势在于允许灵活选择蛋白抗原和抗体，且不依赖于这些组分的基因融合。我们还曾利用此方案制备了丙型肝炎病毒蛋白与抗DEC-205抗体的偶联物，用于体内树突状细胞（DC）靶向。 这同样可能对抗肿瘤疫苗策略具有重要价值。开始抗DEC-205生产时，将1 mL体积的100万至500万个解冻的冻存NLDC 145细胞重悬于9 mL 37°C的ISF-1培养基中，该培养基需添加1%青霉素和链霉素，随后将细胞接种至25 cm²细胞培养瓶中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养24至48小时。当细胞达到70%融合度时，将整个细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，通过离心收集细胞。将沉淀重悬于12毫升新鲜的完全37度ISF-1培养基中，并将细胞重新接种至一个75平方厘米的培养瓶中。培养48至72小时后，将70%融合度的细胞培养物均分至两个新的75平方厘米培养瓶中，每个培养瓶加入6毫升新鲜完全ISF-1培养基。当细胞培养物达到70%融合度时，使用10毫升移液管用细胞悬液冲洗细胞培养瓶底部及培养表面，以收集全部细胞，并将每份扩增的NLDC 145细胞悬液各10毫升转移至单独的PETG旋转培养瓶中。然后向每个转瓶培养物中加入140毫升完全ISF-1培养基，并将转瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳、每分钟25转的条件下培养三天。从NLDC 145上清液中纯化抗体时，将硅胶管的一端插入盛有上清液的烧杯中，使800毫升上清液逐滴通过Protein G Sepharose柱。洗脱时，向二十个1.5毫升离心管中各加入100微升1.5摩尔Tris-HCl，并移除柱子上的橡胶塞。将1毫升0.1摩尔的甘氨酸转移至层析柱的上室中，收集含有抗体的洗脱液至已准备好的1.5毫升离心管中，并对每根离心管重复此操作。当所有抗体均已收集完毕且含抗体的洗脱液已合并后，用适当的透析袋夹关闭一段20厘米长透析袋的底部，小心地将抗体洗脱液用移液器转移至透析袋内。用第二个夹子封闭透析袋的顶部，并将透析袋的上端夹子固定在浮架上。将磁力搅拌子加入含有 PBS 的烧杯中，并将烧杯置于磁力搅拌器上。在 4°C 条件下透析过夜后，打开一个夹子，将全部透析液转移至截留分子量为 10 千道尔顿的离心浓缩管中，在 693 × g 和 4°C 条件下离心 30 分钟。离心结束后，向离心浓缩管中加入 10 毫升 PBS，进行第二次离心，直至获得最终体积为 1 至 1.5 毫升的抗体溶液。为了将OVA与抗DEC-205抗体偶联，取一个1.5毫升离心管，加入200微升PBS、500微克OVA蛋白、240微升新鲜配制的TCEP-HCL溶液以及560微升无菌超纯水，在室温下孵育1.5小时。同时，在另一个1.5毫升离心管中加入2.5毫克抗DEC

chemical-conjugation-purified-dec-205-directed-antibody-with-full

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

纯化的DEC-205定向抗体与全长蛋白的化学偶联，用于在体外和体内靶向小鼠树突状细胞

本视频展示了化学偶联的抗体-抗原复合物的检测方法 通过...

酶联免疫吸附测定法验证化学偶联的抗体-抗原结合物

本视频演示了一种将高盐处理的抗原呈递性树突状细胞（DCs）过继转移至小鼠体内的实验方法。将小鼠CD11c+树突状细胞（DCs）暴露于含高浓度钠的培养基中，使细胞内形成异构左旋糖醛（IsoLG）-蛋白加合物。这些加合物作为新抗原，呈递于DC细胞表面。随后通过过继细胞转移技术，将经高盐处理的细胞注射入小鼠体内。...

一种高盐处理树突状细胞及其过继性转移至小鼠的方法

本实验利用逆转录病毒转导和串联转染技术，构建一种可在无四环素条件下表达慢病毒载体（LV）各组分的细胞系。该慢病毒载体编码绿色荧光蛋白（GFP），并假型化携带一种糖蛋白SVGmu，后者特异性识别树突状细胞表面的受体。...

一种受四环素调控的细胞系可产生高滴度慢病毒载体，特异性靶向树突状细胞

不同的树突状细胞亚群作为稀有群体存在于淋巴器官中，因此难以分离出足够数量和高纯度的细胞用于免疫学实验。本文介绍一种高效、高产量的方法，用于分离目前所知的所有小鼠脾脏树突状细胞主要亚群。...

一种高效且高得率的小鼠树突状细胞亚群分离方法

我们报道了一种利用荧光激活细胞分选技术从易患狼疮小鼠的骨髓中高纯度分离浆细胞样树突状细胞（pDC）的方案，用于pDC的功能研究。...

利用荧光激活细胞分选法从鼠骨髓中纯化浆细胞样树突状细胞

单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够感知微量的危险相关分子，因此极易被启动。本文提供了从血液和肿瘤中分离MoDC并利用免疫复合物对其进行激活的详细方案，同时强调了应考虑的关键注意事项，以避免其过早激活。...

小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。...

小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

转免疫化（TI）装置或培养板及相关实验方案已在实验条件下开发，用于模拟体外光化学疗法（ECP）的关键特征，从而生成生理活化且可调控的树突状细胞（DCs），用于癌症免疫治疗。...

生成生理免疫原性树突状细胞的新方法

在此方案中，将一种基于 DsRed 的表位配体固定化，以制备高选择性亲和树脂，用于从粗制植物提取物或细胞培养上清液中捕获单克隆抗体，可作为 Protein A...

用于快速开发亲和层析树脂的活化交联琼脂糖——以抗体捕获为例

抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）的研发为清除有害抗体提供了新策略。本文详细描述了DCAF1分子的合成方案，该分子可选择性阻断4G2抗体，从而在登革病毒感染过程中消除抗体依赖性增强效应。...

抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）介导的靶向抗体阻断

本文详细介绍了对一种人源特异性抗CD19单克隆抗体进行放射性标记的方法，以及如何利用该标记抗体在多发性硬化小鼠模型中定量中枢神经系统及外周组织中的B细胞 体内 PET成像， 离体...

使用正电子发射断层扫描在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中成像 CD19+ B 细胞

了解DEC-205抗体与OVA抗原的化学偶联方法，用于小鼠树突状细胞靶向。该技术无需基因融合，可灵活选择蛋白抗原和抗体，适用于抗肿瘤疫苗开发及免疫治疗研究。

化学偶联靶向DEC-205的纯化抗体与全长蛋白以靶向小鼠树突状细胞体外和在体内

探索更多视频

化学偶联靶向DEC-205的纯化抗体与全长蛋白以靶向小鼠树突状细胞 体外 和 在体 内

探索更多视频

化学偶联靶向DEC-205的纯化抗体与全长蛋白以靶向小鼠树突状细胞体外和在体内