Name: 猪缺血/再灌注模型中脊髓微灌注的实时评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学习在猪缺血/再灌注模型中使用激光多普勒针探头实时评估脊髓微灌注的方法。该技术可同步监测脑脊液压力与宏观血流动力学，为脊髓损伤治疗策略研究提供可重复的微创评估手段。

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作者谨此感谢德国汉诺威医学院动物研究所的兽医 Lena Brix 以及德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心实验动物护理中心的 Jutta Dammann 女士，感谢她们在动物围手术期和术前护理方面提供的帮助以及在动物操作方面的技术支持。作者还感谢卢森堡基希贝格医院血管外科的 Daniel Manzoni 博士提供的技术协助。

本研究经德国汉堡市动物护理与使用政府委员会批准（编号：60/17）。动物护理遵循《实验动物护理与使用指南》（NIH 出版物编号 86-23，2011 年修订版）以及 FELASA 推荐意见，实验操作按照 ARRIVE 指南进行24,25。本研究为急性实验，所有动物在实验方案结束后被实施安乐死。
注意：本研究使用六只三个月大的雄性和雌性猪（德国长白猪），体重约为 40 kg。动物在实验开始前至少 7 天被转移至动物饲养设施，并按照动物福利建议进行饲养。动物可自由获取食物和饮水，其健康状况由负责的兽医定期评估。实验前保持 12 小时禁食。整个实验过程及动物操作均由负责的兽医监督。
1. 麻醉诱导与麻醉维持
<ol>
	<li>麻醉诱导和维持期间，先通过肌肉注射对动物进行预处理并深度镇静，必要时辅以静脉注射，以便实施气管插管。随后，采用挥发性麻醉剂联合持续输注阿片类药物的方式进行麻醉诱导与维持，并根据需要追加阿片类药物推注剂量。</li>
	<li>预处理和镇静时，肌肉注射氯胺酮 20 mg·kg-1、阿扎哌隆 4 mg·kg-1 和咪达唑仑 0.1 mg·kg-1。</li>
	<li>在耳缘静脉放置静脉导管，妥善固定，并通过快速推注 10 mL 生理盐水评估其通畅性。</li>
	<li>将动物仰卧于保温毯上，以防止热量散失。</li>
	<li>通过心电图（ECG）和脉搏血氧饱和度监测动物的心肺状态，并连接至基本监护设备。</li>
	<li>通过猪专用面罩以 15 L·min-1 的流速给予氧气，进行预充氧。</li>
	<li>必要时，静脉推注 1% 丙泊酚 0.1 mg·kg-1，并实施气管插管。</li>
	<li>通过呼气末二氧化碳监测和听诊确认气管导管位置正确，给予泮库溴铵 0.1 mg•kg-1&#160;，并妥善固定气管导管。</li>
	<li>使用麻醉机建立容量控制通气，潮气量为 10 mL·kg-1 体重-1，呼气末正压为 10 cmH2O，吸入氧浓度（FiO2）为 0.3。调整呼吸频率以维持呼气末二氧化碳分压（etCO2）在 35–45 mmHg 范围内。</li>
	<li>插入胃管，吸除胃内容物，妥善固定胃管并连接至收集袋。小心闭合动物眼睑，防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>通过持续输注芬太尼（10 µg·kg-1·h-1）和七氟烷（3.0% 呼出浓度，由挥发罐输送）来维持麻醉。在整个实验过程中，通过密切观察生命体征、呼吸参数以及无任何自主运动（尤其注意手术刺激阶段）来确保适当的麻醉深度。如出现疼痛或应激迹象，追加芬太尼推注剂量（50 µg）。 
	注意：整个操作过程中应确保有具备动物麻醉经验的研究人员在场，并由经验丰富的兽医进行监督，以保障麻醉安全。</li>
	<li>以 10 mL·kg-1·h-1 的基础速率输注平衡晶体液，以补偿麻醉、手术准备及实验操作过程中的液体丢失。使用液体加温装置防止体温下降。</li>
	<li>用肥皂水轻柔清洁猪的皮肤。使用含聚维酮碘的皮肤消毒液以减少皮肤污染。手术准备时佩戴无菌手套。给予克林霉素 300 mg 作为抗菌预防用药，并在 6 小时后重复给药一次。</li>
</ol>
2. 探针放置
<ol>
	<li>将动物置于右侧卧位，并屈曲动物背部以扩大椎骨之间的间隙。</li>
	<li>外科暴露椎旁区域，准备棘突和椎弓（图1A）。</li>
	<li>在胸椎（Th）13/14 或腰椎（L）1/2 水平，于两个椎弓之间，将一根14 G的血管外周静脉导管以旁正中方式插入脊髓（图1B）。</li>
	<li>取出针芯，通过静脉导管插入激光/多普勒针式探头（图1C），并连接至指定的硬件和软件以测试信号质量。确保获得具有适度脉动性的稳定信号。</li>
	<li>用缝线小心固定探头（图1D），并使用垫料防止探头移位或弯曲。</li>
	<li>为经皮放置脑脊液引流以测量和控制脑脊液压力，确定 L 4/5 或 L 5/6 水平，使用穿刺针穿刺皮肤及皮下组织，随后取出内针。</li>
	<li>将装有生理盐水的注射器连接到穿刺针上，并持续施加压力，小心地将针推进，同时保持注射器内液体的压力。</li>
	<li>当感觉到阻力消失，提示已到达硬膜外腔时，重新插入内针，再将穿刺针向前推进2-3 mm以穿破硬脑膜，随后取出内针。</li>
	<li>通过观察清亮脑脊液快速滴出确认针尖位于蛛网膜下腔。将引流管插入至深度达20 cm，连接鲁尔锁接头，并通过轻柔抽吸脑脊液确认位置正确。</li>
	<li>用缝线小心固定引流管，并将其连接至脑脊液引流系统。</li>
	<li>暴露左耳后方的颅骨，使用6 mm钻头附件小心进行皮肤钻孔开颅。</li>
	<li>将第二个激光多普勒探头直接插入脑组织中。用缝线小心固定探头，并连接至指定的硬件和软件以测试信号质量。再次确认获得具有适度脉动性的稳定信号。</li>
	<li>断开所有探头连接，小心将动物转为仰卧位，确保探头位置不受影响。此操作应由至少4-5名研究人员共同完成。</li>
	<li>重新连接探头，并再次检查信号质量。</li>
	<li>将激光多普勒设备的输出通道连接至放大器及同步采集硬件与软件，以便同时记录激光/多普勒血流（Flux）与宏观血流动力学信号。</li>
	<li>使用两点校准法将血流（Flux）校准为任意单位（PU）。
	<ol>
		<li>按Enter 键打开菜单，选择analogue output setting（模拟输出设置）。</li>
		<li>使用显示的转换系数（5.0 V = 1000 PU）对血流进行两点校准，以便与同步采集软件配合使用。</li>
		<li>选择Return （返回）回到上一级菜单，选择Measurement（测量）以继续进行测量。</li>
		<li>打开synchronic acquisition（同步采集）软件。从Setup （设置）菜单中选择zero all inputs（将所有输入归零）。将所有输入通道连接至所使用的设备和探头。</li>
		<li>通过点击Flux channel（血流通道）的下拉菜单进行两点校准。选择2-point calibration（两点校准）。将units-conversion（单位转换）设为on （开启），并选择BPU 作为单位。对于point 1（第一点），将0 V设为0 BPU；对于point 2（第二点），将5.0 V设为1000 BPU。选择set units（设置单位）应用于all and new data（所有及新数据）。按OK 关闭菜单。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动持续脑脊液引流，目标压力为10 mmHg，引流速度为20 mL·h-1。</li>
</ol>
3. 导管置入
<ol>
	<li>暴露双侧股动脉。</li>
	<li>结扎右侧股动脉远端部分，使用血管环暂时阻断动脉近端管腔，用Potts剪刀对血管进行2 mm的切口，并插入导丝。</li>
	<li>继续推进导丝，确保无阻力插入并避免导丝扭曲；沿导丝送入导管。</li>
	<li>用缝线固定导管。</li>
	<li>通过抽吸动脉血并经血气分析验证，以及在正确连接至血压和跨心肺监测硬件及软件后测量动脉信号，确认导管位置正确。</li>
	<li>将一个5 mm的血流探头放置于左侧股动脉，并通过连接流量计测试信号质量。</li>
	<li>用缝线关闭双侧腹股沟切口。</li>
	<li>暴露右侧颈总动脉及右侧颈内静脉，用于置入8 Fr.导引鞘。</li>
	<li>导管置入操作步骤同3.2–3.4所述。</li>
	<li>将颈动脉导引鞘的侧腔连接至基础压力监测和肺热稀释硬件，用于动脉压测量。</li>
	<li>将带压力传感器的导管插入升主动脉，并通过连接放大器及同步数据采集硬件和软件验证其位置。</li>
	<li>经静脉鞘管插入Swan-Ganz肺动脉导管，在插入深度达20 cm时充盈球囊，轻柔推进直至血流动力学曲线上出现嵌顿压；随后放气并将导管回撤2 cm。确保肺动脉压力信号质量满意。将热敏电阻连接至基础压力监测和肺热稀释硬件。</li>
	<li>在超声引导下经皮置入12 Fr.五腔中心静脉导管至右侧颈外静脉，用于给药及中心静脉压监测。采用六步法进行超声引导下置管38</li>
	<li>将导管远端腔连接至血压及跨心肺监测硬件和软件。将所有药物和输液切换至中心静脉导管。分别使用不同腔道输注镇痛药、液体和儿茶酚胺类药物，保留大腔道用于容量负荷阶段胶体液的输注。</li>
</ol>
4. 手术准备
<ol>
	<li>进行小切口剖腹手术，游离膀胱，插入导尿管以引流尿液，用生理盐水充盈气囊，并用荷包缝线固定导尿管。</li>
	<li>将导尿管连接至显示尿量（单位为 mL）的尿液收集袋。</li>
	<li>将吸入氧浓度（FiO2 ）提高至 1.0，并静脉重新给予 0.1 mg·kg-1 潘库溴铵。</li>
	<li>使用电刀切开至胸骨，行胸骨正中切开术。轻柔地将胸骨从周围组织中分离。在胸骨后方放置压迫垫，以防止损伤。</li>
	<li>暂停通气，使用摆动锯切断胸骨。恢复通气后，将 FiO2 降低至 0.3。使用电刀控制出血，并用骨蜡封闭胸骨断端。</li>
	<li>仔细游离左肺心尖部，并切开膈肌左侧部分，以利于手术暴露。</li>
	<li>通过轻柔牵拉左肺，暴露腹腔干近端的降主动脉，确保通气不受干扰，并避免左肺损伤（图 2A），并分离周围组织（图 2B）。如需血流动力学稳定，可给予 7 mL·kg-1 羟乙基淀粉胶体液。</li>
	<li>在降主动脉周围放置荷包缝线，以确保充分暴露（图 2C）。</li>
	<li>将血流探头环绕置于降胸主动脉上（图 2D）。通过连接至血流模块及同步采集的硬件和软件，确保信号质量良好。必要时使用接触凝胶以改善信号质量。</li>
	<li>在血流探头远端的降主动脉周围放置血管环，标记主动脉阻断钳夹区域。</li>
</ol>
5. 评估与数据采集
<ol>
	<li>使用置于右心房水平的充液管路对所有导管进行调零并校准水平。</li>
	<li>放置针式心电图电极，并将其连接至同步采集硬件和软件。</li>
	<li>经心肺热稀释法评估以及主动脉血流和压力测量方法此前已有描述34。</li>
	<li>采用肺动脉热稀释法测量心输出量时，进行3次注射，每次注入10 mL冷生理盐水，并记录基本监护设备显示的平均值。</li>
	<li>通过简单按下Start启动激光多普勒软件，并通过将各测量步骤仔细标记为M0至M5来为每一步设置标记。</li>
</ol>
6. 实验方案
<ol>
	<li>进行基线测量（M0）。</li>
	<li>通过每次7 mL·kg-1的羟乙基淀粉胶体进行容量负荷，实施血流动力学优化。每次容量负荷在5分钟内通过加压输注完成。每次容量负荷结束后，留出5分钟时间以达到平衡状态。持续进行容量负荷，直至心输出量的增加幅度小于&#60;15%。</li>
	<li>完成血流动力学优化后，重复测量（M1）。</li>
	<li>通过在标记区域放置主动脉夹，实施缺血/再灌注，总共进行48分钟的膈上腹主动脉阻断。</li>
	<li>按照1、2、5、10和30分钟的递增顺序进行主动脉夹闭，以提高实验动物在研究方案中的存活率。</li>
	<li>每次间隔后继续进行主动脉阻断，持续时间最长为5分钟，或直至股动脉血流恢复正常。</li>
	<li>手动阻断下腔静脉入肝血流，以防止平均动脉压升高超过&#62;100 mmHg。</li>
	<li>在夹闭期间，如需要，可给予去甲肾上腺素或肾上腺素的推注，以防止平均动脉压下降至40 mmHg以下。</li>
	<li>在再灌注前30分钟夹闭阶段结束时重复测量（M2）。</li>
	<li>缓慢松开主动脉夹以确保血流动力学稳定。若血压下降过快，则重新夹闭，并等待血流动力学稳定。</li>
	<li>给予7 mL·kg-1羟乙基淀粉胶体，以及额外的10–20 µg去甲肾上腺素和/或肾上腺素推注以维持稳定。若pH值降至7.1以下，给予2 mL·kg-1 的8.4%碳酸氢钠。适当调整呼吸频率，以维持正常二氧化碳水平。</li>
	<li>再灌注1小时后重复测量（M3）。</li>
	<li>按照6.2节所述方法再次进行血流动力学优化，并重复测量（M4）。</li>
	<li>在诱导缺血/再灌注后4.5小时进行最终测量（M5）。</li>
</ol>
7. 安乐死
<ol>
	<li>静脉注射 40 mmol 氯化钾以诱导心室纤维性颤动和停搏，实施安乐死。</li>
	<li>终止通气并移除所有导管。</li>
</ol>
8. 器官采集
<ol>
	<li>将动物置于俯卧位，移除针式探头以及引流装置。</li>
	<li>使用手术刀和镊子切开皮肤并去除肌肉组织，暴露脊柱。</li>
	<li>使用摆动锯在两侧椎弓的旁正中位置进行切割，并通过小心侧向移动棘突以松解残余连接，从而去除椎骨的背侧部分。</li>
	<li>用镊子从尾端向头端轻轻提起脊髓，使用手术刀切断脊神经，以完整取出脊髓。</li>
	<li>将脊髓保存于4%甲醛溶液中，直至用于后续组织病理学评估或微球定量分析。</li>
</ol>
9.&#160;统计分析
<ol>
	<li>使用统计学软件。</li>
	<li>通过直方图检查正态分布，必要时对变量进行对数转换。</li>
	<li>将因变量——脊髓血流、心输出量、心率、每搏输出量、收缩压、平均动脉压、舒张压、中心静脉压、全身血管阻力——以及如需要时通过荧光微球法评估的上段和下段脊髓微循环灌注——纳入一般线性混合模型分析，对连续数据采用 GENLINMIXED 程序并设置恒等连接函数。</li>
	<li>进行基线值校正。</li>
	<li>设定包含基线值和测量时间点作为固定效应的模型。将测量时间点视为动物个体内的重复测量。</li>
	<li>报告每个参数在测量时间点上的固定效应的 p 值。</li>
	<li>对于脊髓荧光微球分析，额外将区域（下段脊髓、上段脊髓）作为固定效应，并纳入区域与测量时间点的交互作用，以评估区域与时间点之间的交互效应，并同时报告交互作用固定效应的 p 值。</li>
	<li>计算在 M1–M5 测量时间点上所有因变量经基线校正后的边缘均值及其 95% 置信区间（CI），随后通过最小显著差异法进行成对比较。</li>
	<li>变量以均值（95% CI）表示。动物体重以均值 ± 标准差表示。</li>
	<li>报告未经校正的 p 值。</li>
</ol>

Constantin J. C. Trepte 收到了来自 Maquet 的讲座荣誉奖项。其他所有作者均声明不存在利益冲突。本研究得到了欧洲麻醉学会2018年青年研究者启动基金的资助。

由脊髓缺血引起的脊髓损伤（SCI）是主动脉修复术的主要并发症，对患者预后具有重大影响1,2,3,4,10,11,12。以微循环为靶向的治疗策略在预防和治疗SCI方面最具前景。本方案提供了一种可重复的实时评估脊髓微循环的方法，并能够在缺血/再灌注条件下评估新型治疗手段对脊髓微循环的影响。
在此实验模型中，存在一些关键的方法学步骤。为防止动物丢失，研究人员必须具备麻醉技术方面的经验（包括脑脊液引流置入、超声引导下血管通路建立、主动脉暴露期间的血流动力学治疗、主动脉交叉阻断及再灌注），以及外科手术技术经验（胸骨切开术、血管暴露、...

由缺血/再灌注引起的脊髓损伤（SCI）是主动脉修复术最严重的并发症之一，与不良预后相关1,2,3,4。目前预防和治疗SCI的策略包括优化宏观血流动力学参数，以及通过调节脑脊液压力（CSP）以提高脊髓灌注压2,5,6,7,8,9。尽管已实施上述措施，SCI的发生率仍介于2%至31%之间，具体取决于主动脉修复术的复杂程度10,11,12。
近年来，微循环受到越来越多的关注13,14。微循环是细胞摄取氧气和进行代谢交换的区域，因此在器官功能和细胞完整性中起着关键作用13。微循环血流受损是组织缺血的主要决定因素，并与死亡率升高密切相关15,16,17,18,19。脊髓微循环障碍与神经功能下降及不良预后相关20,21,22,23。因此，优化微灌注以治疗脊髓损伤（SCI）是最具前景的策略之一。已有研究指出，即使在宏观循环得到优化的情况下，微循环障碍仍可能持续存在26,27,28,29。这种血流动力学不一致的现象在多种病理状态下频繁出现，包括缺血/再灌注损伤，凸显了直接评估微循环以及发展靶向微循环治疗的必要性26,27,30。
迄今为止，仅有少数研究采用激光多普勒探针对脊髓微循环行为进行实时评估20,31。现有研究常使用微球注射技术，但该方法受限于间歇性使用以及需要进行死后分析32,33。微球注射技术可进行的不同测量次数受限于具有不同波长的微球的可获得性。此外，与激光多普勒技术相比，该方法无法实现微灌注的实时评估，因其需要对死后组织进行处理和分析。本文介绍了一种在猪的大动物缺血/再灌注模型中对脊髓微循环进行实时评估的实验方案。
本研究属于一项大型动物实验项目，该项目包括一项随机对照研究，旨在比较晶体液与胶体液在缺血/再灌注过程中对微循环的影响；此外还包含一项探索性随机研究，旨在评估液体复苏与血管加压药对脊髓微灌注的作用。流量探针的两点校准以及带压敏尖端导管的校准方法此前已有描述34。除已报道的实验方案外，本研究还采用荧光微球法测量脊髓微灌注，具体方法如前所述，每只动物采集12份脊髓组织样本，其中样本1-6代表上段脊髓，样本7-12代表下段脊髓35,36。每次测量均在完成激光多普勒记录和宏观血流动力学评估后进行微球注射。组织病理学评估采用此前描述的Kleinman评分法进行37。

<table><tbody><tr><td>CardioMed 流量计</td><td>Medistim AS, Oslo, Norway</td><td>CM4000</td><td>股动脉流量探头用流量计</td></tr><tr><td>CardioMed 流量探头，5mm</td><td>Medistim AS, Oslo, Norway</td><td>PS100051</td><td>股动脉流量探头</td></tr><tr><td>COnfidence 探头&amp;nbsp;</td><td>Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA</td><td>MA16PAU</td><td>主动脉流量探头</td></tr><tr><td>16 mm 衬管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIVA 七氟烷蒸发器</td><td>Dr&amp;auml;ger Medical, L&amp;uuml;beck, Germany</td><td></td><td>蒸发器</td></tr><tr><td>Hotline Level 1 液体加温器</td><td>Smiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, Germany</td><td>HL-90-DE-230</td><td>液体加温设备</td></tr><tr><td>Infinity Delta</td><td>Dr&amp;auml;ger Medical, L&amp;uuml;beck, Germany</td><td></td><td>基本监护硬件</td></tr><tr><td>Infinity Hemo</td><td>Dr&amp;auml;ger Medical, L&amp;uuml;beck, Germany</td><td></td><td>基本压力监测与肺热稀释硬件</td></tr><tr><td>LabChart Pro</td><td>ADInstruments Ltd., Oxford, UK</td><td>v8.1.16</td><td>同步激光多普勒、血压、心电图和血流采集软件</td></tr><tr><td>LiquoGuard 7</td><td>M&amp;ouml;ller Medical GmbH, Fulda, Germany</td><td></td><td>脑脊液引流系统</td></tr><tr><td>Millar 微尖端压力导管（5F，单弯，120cm，PU/WD）</td><td>ADInstruments Ltd., Oxford, UK</td><td>SPR-350</td><td>主动脉压力尖端导管</td></tr><tr><td>moor VMS LDF</td><td>moor Instruments, Devon, UK</td><td></td><td>专用激光多普勒硬件</td></tr><tr><td>moor VMS 研究软件</td><td>moor Instruments, Devon, UK</td><td></td><td>专用激光多普勒软件</td></tr><tr><td>血管周围流量模块</td><td>Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA</td><td>TS 420</td><td>主动脉流量探头用流量模块</td></tr><tr><td>PiCCO 2，科研版本</td><td>Getinge AB, G&amp;ouml;teborg, Sweden</td><td>v. 6.0</td><td>血压与经心肺热稀释监测软硬件</td></tr><tr><td>PiCCO 5 Fr. 20cm</td><td>Getinge AB, G&amp;ouml;teborg, Sweden</td><td></td><td>带热敏电阻尖端的动脉导管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PowerLab</td><td>ADInstruments Ltd., Oxford, UK</td><td>PL 3516</td><td>同步激光多普勒、血压、心电图和血流采集硬件</td></tr><tr><td>QuadBridgeAmp</td><td>ADInstruments Ltd., Oxford, UK</td><td>FE 224</td><td>四通道桥式放大器，用于激光多普勒和有创血压采集</td></tr><tr><td>Silverline</td><td>Spiegelberg, Hamburg, Germany</td><td>ELD33.010.02</td><td>脑脊液引流</td></tr><tr><td>SPSS 统计软件包&amp;nbsp;</td><td>IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, New York, USA</td><td>v. 27</td><td>统计软件</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twinwarm 加温系统</td><td>Moeck &amp;amp; Moeck GmbH, Hamburg, Germany</td><td>12TW921DE</td><td>加温系统</td></tr><tr><td>Universal II 加温毯</td><td>Moeck &amp;amp; Moeck GmbH, Hamburg, Germany</td><td>906</td><td>加温毯</td></tr><tr><td>VP 3 探头，8mm 长度（定制生产）</td><td>moor Instruments, Devon, UK</td><td></td><td>激光多普勒探头</td></tr><tr><td>Zeus</td><td>Dr&amp;auml;ger Medical, L&amp;uuml;beck, Germany</td><td></td><td>麻醉机</td></tr></tbody></table>

缺血/再灌注猪模型中脊髓微循环灌注的实时评估

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

脊髓损伤是主动脉修复手术的一种毁灭性并发症。尽管在脊髓损伤的预防和治疗方面已有进展，但其发生率仍然较高，因而显著影响患者的预后。微循环在组织灌注和氧气供应中起关键作用，且常与宏观血流动力学相分离。因此，对脊髓微循环进行直接评估，对于开发以微循环为靶点的治疗策略以及评价现有方法在脊髓微循环方面的效果至关重要。然而，大多数现有方法无法实现对脊髓微循环的实时评估。本研究旨在描述一种使用直接插入脊髓的激光多普勒针式探针进行脊髓微循环实时评估的标准化操作流程。我们采用猪的缺血/再灌注模型以诱导脊髓微循环功能恶化，并结合荧光微球注射技术进行检测。实验开始时，先对动物实施麻醉并进行机械通气。随后插入激光多普勒针式探针，并放置脑脊液引流装置。通过正中胸骨切开术暴露降主动脉，以便实施主动脉阻断。通过腹腔动脉上方的主动脉夹闭共48分钟诱导缺血/再灌注损伤，随后进行再灌注及血流动力学稳定。在监测宏观血流动力学的同时，同步进行激光多普勒血流监测。此外，采用自动脑脊液引流以维持稳定的脑脊液压力。在完成实验流程后，处死动物并取出脊髓组织，用于组织病理学分析和微球定量分析。该方案证实了使用激光多普勒探针测量脊髓微灌注的可行性，结果显示在缺血期间血流显著下降，再灌注后出现恢复。结果与荧光微球评估方法表现出相似的变化趋势。综上所述，该新型实验方案可能为未来在缺血/再灌注条件下开展脊髓微循环实时评估的研究提供一种有价值的大型动物模型。

所有六只动物均存活至实验方案结束。动物体重为48.2 ± 2.9 kg；其中五只为雄性，一只为雌性。所有动物均成功插入脊髓针式探针，并完成脊髓血流（Flux）测量。
在主动脉阻断诱导缺血以及去夹和再灌注期间，脊髓微循环实时记录与脑微循环及大血管血流动力学记录相结合的实际示例如图3A、图3B所示。降主动脉血流中断后，脊髓血流量（Flux）显著下降，而升主动脉压力升高（图3A）。再灌注则导致相反效应（图3B）。
大循环和微循环参数的统计分析结果见表1。混合模型估算的边...

脊髓微循环在脊髓损伤中起着关键作用。大多数方法无法实现实时评估脊髓微循环，而实时评估对于开发靶向微循环的治疗策略至关重要。本文提出了一种利用激光多普勒血流针式探针在缺血/再灌注大型动物模型中进行检测的实验方案。

脊髓损伤是主动脉修复手术的一种毁灭性并发症。尽管在脊髓损伤的预防和治疗方面已取得进展，但其……

本方案提供了一种可重复的方法，用于实时评估脊髓微循环。该方法能够评价各种治疗手段对脊髓微循环以及缺血-再灌注状态的影响。我们的技术易于掌握，具有最小侵入性，并可在大动物模型中同步评估脊髓微灌注、脑脊液压力及宏观血流动力学参数。演示该操作的将是麻醉学专家、本实验室科研人员克里斯托夫·贝赫姆博士（Dr. Christoph Behem）和蒂尔·弗里德海姆博士（Dr. Till Friedheim）。额外的演示人员包括麻醉科住院医师迈克尔·格拉勒（Michael Graessler）。在确认一头三个月大、体重40公斤的猪达到适当的镇静水平后，将动物置于右侧卧位，并屈曲其背部以扩大椎骨之间的间隙。手术暴露椎旁区域，准备棘突和椎弓，于胸椎13至14或腰椎1至2节段的两个椎弓之间，将14号外周静脉导管经旁正中方向置入脊髓。取出针芯，插入激光多普勒探针，并将探针连接至指定的硬件和软件以检测信号质量。应观察到具有适度脉动性的稳定信号。用缝线仔细固定探头，并通过调整角度防止探头移位或弯曲。对于经皮放置脑脊液引流管以测量和控制脑脊液压力的情况，应确定腰椎4至5节段或L5至6节段的位置。使用套管针穿刺皮肤及皮下组织，然后取出针芯。将装有生理盐水的注射器连接至穿刺针上，通过持续施压，小心地将穿刺针置入硬膜外腔。当感觉到阻力消失，提示穿刺针已正确进入硬膜外腔后，插入内针，并将针头向前推进2至3毫米进入蛛网膜下腔。将引流管置入至深度达20厘米处。连接鲁尔锁接头，并通过小心抽吸脑脊液来确认位置。然后用缝线仔细固定引流管，并将引流管连接至脑脊液引流系统。接着，暴露左侧耳后颅骨，使用直径6毫米的钻头附件，小心进行颅骨钻孔环锯术。将第二个激光多普勒探头直接插入脑组织，并使用缝线小心固定探头位置。将探头连接至硬件和软件系统以检测信号质量。应观察到具有适度脉动性的稳定信号。断开所有探头，并在四到五名助手的协助下，使用垫料小心地将动物置于仰卧位，注意不要扰动探头。重新连接探头并检查信号质量。随后开始持续脑脊液引流，目标压力为10毫米汞柱，引流量为每小时20毫升。进行小切口剖腹手术后，将吸入氧浓度提高至1，并静脉注射0.1毫克/千克的潘库溴铵。轻柔地将胸骨从周围组织中游离，然后放置胸骨后压迫装置以防止损伤。停止通气后，使用摆动锯锯开骨骼，随后恢复通气，并将吸入氧浓度降低至0.3。使用电凝止血，并用骨蜡封闭胸骨。仔细游离左肺基底部，切开膈肌左侧部分以改善手术暴露。轻柔牵拉左肺，暴露腹腔干近端的降主动脉，并分离其周围组织。在降主动脉周围放置一个血管套带（Overholt）以确保充分暴露，并在降胸主动脉上安装血流探头，随后确认获得高质量信号，再在血流探头远端的降主动脉上套入血管环，以标记主动脉阻断的部位。在获取基线测量值后，分步给予羟乙基淀粉胶体液，每步按每公斤体重7毫升的剂量，在5分钟内输注完毕。每步输注后等待5分钟平衡期，直至心输出量增加小于15%。完成血流动力学优化后，重复各项测量。接下来，在腹腔动脉上方主动脉先前标记的部位放置主动脉夹，以诱导缺血-再灌注，分别在1分钟、2分钟、5分钟、10分钟和30分钟的时间点进行，总时长为48分钟。每次时间点后继续进行主动脉横断阻断。在最长5分钟内或股动脉血流恢复正常后，手动阻断下腔静脉入流，以防止平均动脉压升高超过100 mmHg，并在再灌注前30分钟阻断期结束时重复测量各项指标。获得测量数据后，逐渐打开夹闭钳以确保血流动力学稳定，并给予每公斤体重7毫升的羟乙基淀粉胶体液，以及10至20微克去甲肾上腺素和/或肾上腺素的额外推注剂量以维持稳定。根据需要调整呼吸频率，以确保正常二氧化碳水平。一小时后，重复进行测量。获得再灌注后测量数据后，重复进行容量负荷操作并获取另一组测量数据。在缺血再灌注诱导后4.5小时，获取最终一组测量数据。此处可观察到在诱导缺血期间主动脉阻断时、以及在解除阻断和再灌注期间，实时的脊髓微循环记录与脑微循环及大血管血流动力学记录相结合的示例。降主动脉血流中断后，脊髓血流量显著减少，同时升主动脉压力升高。再灌注则引起相反效应。宏观与微循环参数的统计学分析表明，缺血期间脊髓血流量显著降低。相比之下，脑部血流量在缺血期间显著增加，这由估算的边缘均值及其置信区间表明。此过程伴随心率、动脉压和全身血管阻力的升高，而心输出量和每搏输出量则下降。荧光微球分析显示，脊髓下段的微循环血流显著减少，而脊髓上段未观察到明显变化。再灌注产生了相反的效果。尽管在实验方案结束时，心输出量、每搏输出量和动脉压进一步下降，但脊髓血流和脊髓微循环血流保持稳定。脊髓穿刺针探头的插入需要对解剖结构有深入的了解。此外，操作探针时需要极高的技术水平。必须避免多次尝试，以防止损伤脊髓，从而影响实验方法的准确性。

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