使用自动图像分析对啮齿动物模型的亚斯坦蒂娅尼格拉多巴明神经元密度进行半定量测定
2021年2月2日
在这里，我们提出了一个自动方法，用于半定量确定大鼠亚坦蒂娅尼格拉解析压实数中的多巴明神经元数。
估计亚坦蒂亚尼格拉的多巴明神经元数是帕金森病研究的关键成果指标。此协议显著缩短了估计神经元数量所需的工作量。该方法为检测多巴明神经元数的变化提供了一个时间高效、准确的过程，适合确定干预对细胞生存的影响。
这种方法可以很容易地适应，以提供不同大脑区域的神经元的准确计数，同时保持成本和时间优势比传统的固态方法。要捕获 IHC 图像，请使用该软件与 10 倍放大倍数的对焦显微镜耦合。将针孔打开至 1.5 个区域单位，以捕获总长 1.5 微米的宽平面，并将焦点放在大脑的注射侧。
在获取选项卡上检查磁贴扫描成像选项，并将尺寸设置为 10 乘 4。在采集模式面板下将变焦设置为 1.1，以避免磁贴扫描图像之间的任何缝合标记。将帧尺寸设置为 1024 x 1024 像素，平均值设置为 2，以确保高质量的图像采集。
在通道面板设置轨道一到亚历克萨 488 和轨道二到亚历克萨 555 。将幻灯片加载到舞台上，并选择具有强 TH 染色的部分。点击收购面板上的实时直播。
在通道面板中，将激光强度和增益设置为最大化信号和限制背景噪音的水平。使用范围指示器确保信号不会过度暴露。使用多个幻灯片重复此步骤。
在收购选项卡上检查位置框。要开始成像，请使用眼片并选择显示正 TH 染色的第一部分。然后将焦点设置在兴趣点，并将舞台移到部分的中线。
这样可以保存 X、Y 和 Z 轴中的位置，并将对捕获整个部分的瓷砖扫描进行成像。对于所有其他幻灯片（包括未注入的站点）重复此步骤。使用适当的软件将图像文件单独导入自动图像分析软件。
通过选择笔注释工具来在基坦蒂亚尼格拉平价紧凑物周围绘制注释，从而定义感兴趣的区域。移动到分析选项卡，并从下拉分析菜单中选择实时调整。这将打开部分图像上的单独窗口，以便实时修改分析参数。
在分析放大部分下选择合适的图像变焦。在细胞检测部分下选择核染料作为用于TH染色的染料。调整核对比阈值、最低核强度、核分割侵略性和核大小设置，同时仔细观察时间调整窗口。
使用多个示例重复此过程。一旦采样了适当数量的图像，并相应地调整了实时调整，将"设置"中的分析设置保存在"下拉"菜单中。选择要分析的所有图像并单击分析。
选择刚刚保存的分析设置，并在分析窗口区域检查注释层框，然后检查第一层并单击分析。完成导出所有部分的汇总分析数据后，选择导出对象分析数据的选项。此数据集可用于检查细胞大小的变化，以响应毒素或治疗。
腺相关病毒或 AAV 注射六周后，AAV 向大鼠大脑中的亚坦蒂亚尼格拉注射表达突变 A53T 阿尔法核糖核素的立体定向注射，导致多巴明神经元的密度显著降低。与注射AAV空向量的老鼠相比，注射AAV-A35T的老鼠的亚坦蒂亚尼格拉每毫米TH正神经元的平均数量显著减少。类似的观察也使用公正的立体学。
当尝试此协议时，请记住，软件只有经过培训才能使用。因此，必须花时间和照顾，以确保一个单元格被确定为单个细胞。该软件可以适应测量其他感兴趣的蛋白质的荧光强度，如α-核素，以确定治疗是否可以调节蛋白质水平。
这项技术在测试多种潜在治疗方法对多巴明神经元密度的影响时，效率更高。
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概览
本研究提出了一种用于大鼠黑质致密部多巴胺能神经元数量半定量测定的自动化方法。该协议显著减少了工作量，并在估计神经元数量时提高了准确性，这对帕金森病研究至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 精神病学
- 细胞生物学
背景
- 估算多巴胺能神经元数量对帕金森病研究至关重要。
- 传统方法可能耗时且不够准确。
- 自动化方法可以提供时间效率和成本优势。
- 神经元数量的定量变化可以评估治疗效果。
研究目的
- 提出一种高效准确检测多巴胺能神经元数量的方法。
- 使研究人员能够分析由于各种干预而导致的神经元数量变化。
- 简化多巴胺能神经元的成像和数据分析过程。
使用的方法
- 使用共聚焦显微镜的自动化成像方法。
- 关注大鼠模型中的黑质致密部。
- 协议包括以10倍放大倍数和特定成像设置捕获免疫组织化学图像。
- 通过自动化软件实时调整和分析神经元图像。
- 包括干预后神经元密度变化的数据分析。
主要结果
- 该方法显示出在注射表达A53T突变体α-突触核蛋白的AAV后TH阳性神经元密度显著降低。
- 结果表明与对照组相比，多巴胺能神经元数量减少。
- 利用无偏立体学来验证发现。
- 能够检测出对治疗干预的形态学变化响应。
结论
- 该研究验证了一种高效的多巴胺能神经元定量方法。
- 该技术增强了对帕金森病模型中神经元损失的理解。
- 所呈现的方法可以促进对神经元密度的治疗影响的探索。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
