Name: 活生物库的创建和维护 - 我们如何做到这一点 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 了解如何创建和维护结直肠癌与胰腺癌的活体生物库，整合患者来源的原代肿瘤组织、血清、外周血淋巴细胞、PDX模型及癌细胞系。该方案支持精准医学的功能性临床前测试，保留活性样本并生成能准确重现患者肿瘤特征的模型。

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我们谨向我们的图形助理珍妮·伯迈斯特（Jenny Burmeister）致以诚挚感谢，她负责了视频的录制与编辑工作。此外，我们感谢外科与病理科的同事们长期以来的合作。我们还要感谢罗斯托克大学信息技术与媒体中心的制作经理马库斯·穆勒（Marcus Müller），他提供了录音设备并对音质进行了优化。
基金支持：德国癌症援助基金会（DKH e.V.）（资助编号 108446）以及梅克伦堡-前波美拉尼亚州（资助编号 TBI-V-1-241-VBW-084）部分资助了本研究。

本研究已获得罗斯托克大学医学中心机构审查委员会的批准（批准编号：II HV 43/2004、A 45/2007、A 2018-0054、A 2019-0187 和 A 2019-0222）。此外，所有与兽医相关的操作均已获得梅克伦堡-前波美拉尼亚州农业、食品安全与渔业局的批准，批准注册号为 LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 和 7221.3-1-007/19。
1. 实验先决条件
<ol>
	<li>建立和维护生物样本库需满足若干重要的框架条件。
	<ol>
		<li>应配备设有外科部门的临床机构，具备足够数量的肿瘤切除手术病例，同时拥有设备完善的实验室和充足的学术人员。良好的基础设施以及与合作病理科建立稳固的联系是进一步的前提条件。</li>
		<li>对于in vivo研究，应使用符合免疫缺陷小鼠饲养条件的动物实验设施。</li>
		<li>涉及患者来源材料的任何研究，须获得医疗卫生伦理委员会的授权；所有in vivo研究须根据当地法律法规，获得主管机构的批准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品采集
<ol>
	<li>手术前一天
	<ol>
		<li>对所有可切除的结直肠癌或胰腺癌患者及其相应转移灶进行生物样本库入组资格评估。避免纳入曾接受新辅助治疗、肿瘤体积过小、肿瘤性质不确定或此前已通过内镜部分切除的病例。</li>
		<li>在手术知情同意讨论过程中，获取患者书面参与同意书。及时通知所有相关外科医生、实验室团队以及病理科医生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本采集
	<ol>
		<li>在手术开始前，立即向手术室（OR）内所有在场人员说明将为生物样本库收集组织。 
		注意：组织绝对不可用福尔马林固定。一旦组织浸入福尔马林，将不再适用于整合性生物样本库保存。</li>
		<li>麻醉诱导后立即采集40 mL肝素抗凝血（使用2支20 mL注射器）以及一支标准7.5 mL血清管，并迅速转运至实验室用于外周血单个核细胞（PBL）分离和血清处理（见步骤3-4）。</li>
		<li>从手术台上直接获取切除标本，将其放入适当的容器中并送至病理科。记录标本离体时间、切除时间及到达病理科的时间。 
		注意：应由合作病理科医生评估标本是否适用于生物样本库保存，其需切取肿瘤组织及非恶性组织切片。切勿自行切除标本的任何部分，以免影响后续病理报告。</li>
		<li>将两份组织分别置于15至50 mL聚丙烯管中，每管加入10至30 mL组织保存液（或DPBS），并置于冰上。记录接收时间，并立即将样本转运至实验室。 
		注意：以下步骤3-6必须在层流柜内严格无菌条件下进行。所有液体均需使用室温状态。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 血清处理
<ol>
	<li>将7.5 mL血清管在预冷的离心机中于1128 × g、4 °C条件下离心15分钟。</li>
	<li>将1 mL血清分装至预先标记的冻存管中，并在液氮中速冻。</li>
</ol>
4. 通过密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞
注意：两个 20 mL 注射器需同时平行操作。
<ol>
	<li>将20 mL肝素抗凝血加入50 mL聚丙烯管中，并加入15 mL DPBS。</li>
	<li>用血清移液管吸取15 mL Pancoll，小心将移液管插至聚丙烯管底部，缓慢释放Pancoll，在血液/DPBS柱下方形成一层。</li>
	<li>以375 × g离心15分钟，不带刹车。</li>
	<li>吸取并转移两份样品中位于中上部之间的不透明中间层至新的50 mL聚丙烯管中，再用DPBS补至50 mL。</li>
	<li>以270 × g离心15分钟，带刹车。</li>
	<li>吸除并弃去上清液，将细胞沉淀重悬于4.5 mL冻存液中。</li>
	<li>将悬液按每管1.5 mL分装至冻存管，盖紧管盖，放入适用于程序性慢速冷冻的冻存盒中，于-80 °C保存。</li>
</ol>
5. 组织处理
注意：首先制备肿瘤组织和正常组织的速冻样本，以保持核酸的完整性。
<ol>
	<li>肿瘤组织样本
	<ol>
		<li>将数毫升组织保存液中的肿瘤样本从聚丙烯管转移至培养皿中。如有必要，用DPBS冲洗。避免直接接触样本，使用两把无菌手术刀操作组织。任何时候均应避免组织干燥。</li>
		<li>将肿瘤样本置于独立培养皿中，使用合适的天平称重，并记录组织重量。</li>
		<li>切割前评估肿瘤组织的大小、形状和组织质量。目标是至少获取一个针尖大小的组织块用于速冻，以及四个约30 mm3（边长3 × 3 × 3 mm）的组织块用于活性组织冷冻保存。尽可能多地制备成组的30 mm3组织块，每五组制备一个用于速冻的组织块。同时注意需切除坏死部分，确保所有组织块仅由活性组织构成。</li>
		<li>制备厚度为3 mm的组织切片。切除呈凝胶状或液态、可辨识的坏死部分，并将切片进一步切割为上述两种所需尺寸的组织块。 
		注意：此时不得丢弃任何组织。</li>
		<li>速冻处理
		<ol>
			<li>相应标记冻存管（参见步骤7.7）。</li>
			<li>每支预先标记的冻存管中放入一块小组织样本。将样本立即浸入液氮中数分钟，随后于-80 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>活性组织的冷冻保存
		<ol>
			<li>相应标记冻存管（参见步骤7.7），每管加入1.5 mL冻存液。将冻存容器放置在操作台旁。 
			注意：接下来的步骤应尽快完成。由于冻存液中的DMSO具有细胞毒性，组织在未充分冷却的情况下浸入冻存液的时间不得超过2分钟。</li>
			<li>将30 mm3的组织块以四块为一组进行排列。将坏死组织和其他残留物推至培养皿边缘，但不得丢弃。</li>
			<li>使用手术刀片舀取组织块，每支冻存管中放入四块组织。确保肿瘤组织完全浸没于冻存液中。盖紧管盖，将冻存管放入适用于程序性慢速冷冻的冻存容器中，并置于-80 °C冰箱中保存。</li>
			<li>将冻存管转移至合适的长期储存系统中，于-140 °C或更低温度下保存。必须在实验室库存管理系统中进行记录。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>健康组织样本：对健康组织样本重复步骤5.1.1至5.1.6.4。</li>
</ol>
6. 原代细胞培养
<ol>
	<li>用手术刀在培养皿中将肿瘤组织残余物（包括坏死碎片）切碎至尽可能小的块状。</li>
	<li>将一个无菌细胞筛网（孔径100 µm）置于50 mL聚丙烯管上方。</li>
	<li>使用移液管向培养皿中加入5–10 mL DPBS，漂浮组织残余物，并反复吹打以形成悬液。</li>
	<li>用移液管将悬液转移至细胞筛网上。</li>
	<li>重复步骤6.3–6.4，直至培养皿中所有组织残余物均被转移。</li>
	<li>使用一支20 mL一次性注射器的推杆，将细胞和组织悬液压过细胞筛网。</li>
	<li>用5–10 mL新鲜DPBS冲洗，弃去细胞筛网，并妥善盖紧管盖。</li>
	<li>将悬液在180 × g下离心5–10分钟。</li>
	<li>准备一株预先包被I型胶原蛋白的6孔板，每孔加入1.5 mL培养基。</li>
	<li>吸除并弃去上清液。将沉淀重悬于3 mL DPBS或培养基中，并将500 µL悬液加入每孔。将培养板放入培养箱（100%湿度，5% CO2，37 °C）。</li>
	<li>每日观察培养板中的细胞生长情况及有无污染。 
	注意：建立稳定细胞系之前的进一步细胞培养过程不在本文描述范围内。</li>
</ol>
7. PDX 模型的构建
<ol>
	<li>进行 in 体内 仅可由符合您所在司法管辖区主管机构要求的、具备相应资质的人员进行实验。</li>
	<li>在满足所用小鼠品系需求的无特定病原体（SPF）条件下饲养免疫缺陷小鼠。卫生措施包括使用独立通风笼具、经高压灭菌的食物、水和垫料，以及配备安全气锁和穿戴个人防护装备。</li>
	<li>提前对所有器械进行高压灭菌，并为每例肿瘤使用单独的一套器械，以避免交叉污染。尽可能无菌地处理肿瘤组织。下述所有塑料制品均应为无菌、一次性使用，并在每次手术后丢弃。 
	注意：根据每管冷冻保存四个肿瘤组织样本的方法，每个样本的PDX建模需使用两只小鼠，理想情况下可获得四个PDX肿瘤。</li>
	<li>通过实验室库存管理系统选择用于移植的所需原发性肿瘤，并将样本（活力保存的肿瘤组织）从主储存罐转移至便携式液氮容器（也可使用干冰在 -80 °C 下进行中期储存）。</li>
	<li>进入SPF区域前，穿戴个人防护装备（刷手服、木屐、围裙、头套、外科口罩和鞋套），并对双手及所有设备进行消毒。</li>
	<li>Matrigel 浸泡
	<ol>
		<li>从液氮容器中取出冻存管，等待样本解冻。</li>
		<li>标记一个50 mL聚丙烯管，并加入35 mL DPBS。</li>
		<li>将冻存管倾斜上下移动，待组织-培养基冰浆可移动时，立即转移至聚丙烯管中。轻柔冲洗肿瘤组织块，将管内大部分液体弃入单独容器中，盖上管盖并将管倒置，使四个组织块聚集在管盖内。</li>
		<li>将培养皿置于冷却蓄冷器上，在中央位置加入100 µL Matrigel，形成单个液滴。使用解剖镊将肿瘤组织块转移至Matrigel中，确保每个组织块完全被Matrigel覆盖。于4 °C孵育10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠麻醉（每份样本2只小鼠，平行操作）
	<ol>
		<li>配制氯胺酮（100 mg/mL）与赛拉嗪（20 mg/mL）麻醉剂溶液的3:1储备液。推荐剂量为每公斤体重90/6 mg。</li>
		<li>称量小鼠体重，并将所需麻醉剂溶液吸入一次性胰岛素注射器中。</li>
		<li>将小鼠置于笼具网格上，用一只手轻轻牵拉其尾巴以诱导其向前移动，同时用另一只手以指捏法抓握颈部。将小鼠从网格上提起，并翻转握持的手，使动物背部置于掌心。用小指固定其中一条后肢，进行腹腔注射麻醉药物。将小鼠放回笼中，等待麻醉起效。</li>
		<li>将麻醉后的小鼠置于加热板上，并用眼膏涂抹眼睛以防止角膜损伤。使用手术镊轻轻夹捏小鼠后肢足部，以评估麻醉深度。 
		注意：无运动反应表明已达到深度麻醉状态。若出现任何运动反应，则需延长麻醉时间以达到理想的麻醉深度，或追加麻醉剂剂量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作步骤
	<ol>
		<li>用镊子捏起小鼠颈部皮肤形成皮褶，然后使用注射器将微芯片皮下注射（编程细节见步骤9）</li>
		<li>如有需要，剃除小鼠 flank 部的毛发（NMRI）nu/nu 小鼠无需剃毛），用棉签涂抹聚维酮碘，并使用手术巾建立无菌区域。</li>
		<li>用手术镊提起侧腹部的皮肤，剪出一个约4 mm的小切口，然后用剪刀钝性分离形成一个小的皮下囊袋。</li>
		<li>将一块肿瘤组织放入每个口袋中，并置于后端。</li>
		<li>剪切100 µL吸头末端，吸取培养皿中剩余的Matrigel，并均匀注入每个皮肤袋中。</li>
		<li>用单纯间断缝合关闭伤口，并喷洒敷料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描微芯片，核对小鼠和肿瘤编号的有效性。</li>
	<li>准备一个新笼子，铺上新鲜垫料和筑巢材料，并放入一根啃咬棒。将一张 &#34;缓冲垫&#34; 用完纸巾后，将小鼠头部抬高，置于红外线加热灯下。</li>
	<li>将0.25 mL复方新诺明（400 mg/80 mg）与100 mL饮用水混合，通过饮水瓶给药。注意小鼠每日饮水量约为每公斤体重150 mL。 
	注意：由于皮下PDX模型不会引起术后疼痛，无论是在伤口愈合过程中还是在肿瘤生长期间，均无需使用术后镇痛。请注意，您所在机构/主管部门的动物福利指南可能有所不同。</li>
	<li>实验动物的监测
	<ol>
		<li>每天监测小鼠是否有痛苦迹象，此项工作可交由合格的动物饲养人员完成。</li>
		<li>术后继续使用上述剂量的抗生素治疗4周，每周更换抗生素混合液两次。</li>
		<li>每周至少测量一次肿瘤大小，最好每天测量，使用游标卡尺进行测量（肿瘤体积 = 0.52 × 长 × 宽 × 高 [mm3]）并记录在数据库中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 患者来源肿瘤异种移植模型的收获与处理
<ol>
	<li>当出现以下情况时，收获并处理PDX肿瘤： 
	肿瘤大小达到目标体积1.500 mm3。 
	荷瘤动物出现痛苦和/或疾病迹象，且治疗已无效果。 
	肿瘤发生溃烂或穿透小鼠皮肤。</li>
	<li>读取微芯片以确认正确的PDX编号。</li>
	<li>根据国家指南规定的合法方法实施安乐死，例如CO2窒息法，或注射氯胺酮/甲苯噻嗪后行颈椎脱位。</li>
	<li>用手术镊在小鼠侧腹部提起皮肤，使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum scissors）在距离肿瘤数毫米处进行切开。</li>
	<li>钝性分离肿瘤上方的皮肤，然后用解剖镊小心夹住肿瘤，将其从体表筋膜上分离下来。</li>
	<li>用DPBS冲洗肿瘤，将其放入培养皿中，并去除周围的结缔组织。</li>
	<li>此时执行以下操作之一：
	<ol>
		<li>切成30 mm3的组织块，用于建立新的PDX模型（继续执行第7.7.4步的方案）。</li>
		<li>将肿瘤切成组织切片，转移至组织学包埋盒中，用4%甲醛固定，以备后续石蜡包埋。</li>
		<li>将肿瘤保存于含组织保存液的管中，用于加入生物样本库（继续执行第3步的方案）和/或建立PDX来源的细胞系（继续执行第4步的方案）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 生物样本库与数据管理
<ol>
	<li>根据表1为每个肿瘤病例分配一个内部编号。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>实验室位置/名称</td>
			<td>癌症类型</td>
			<td>连续病例编号</td>
			<td>标本类型</td>
			<td>连续编号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>C=结直肠癌</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>_Met=转移灶</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P=胰腺癌</td>
			<td>_Tu=肿瘤组织</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">示例：HROC389_Met2 = 罗斯托克，结直肠癌，病例389，第二处转移灶</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：样本编号的定义。
<ol start="2">
	<li>将患者知情同意书以电子版和纸质版形式与肿瘤编号（tumor-ID）一同保存。</li>
	<li>尽可能收集完整的临床数据，并以匿名方式单独存储。</li>
	<li>使用数据管理软件（例如 Freezerworks）或其他系统，并与标签打印软件建立接口，以生成耐低温、自粘式的条形码标签。</li>
	<li>在数据管理软件中新增样本时，打开软件，定义标本类型，并记录以下信息：肿瘤编号（tumor ID）、组织类型、冷冻方法、日期、负责人员、传代次数、小鼠编号（mouse ID）和小鼠品系（mouse strain）。</li>
	<li>将样本分配至储存罐中的特定位置。</li>
	<li>人源肿瘤异种移植模型（PDX）的追踪与监测（适用于步骤 7–8）
	<ol>
		<li>使用便携式蓝牙设备（笔记本电脑或平板电脑）上的 MS Access 数据库（或类似系统），记录肿瘤编号（tumor ID）、移植日期、安乐死日期、小鼠年龄与品系，以及随时间变化的肿瘤生长情况。</li>
		<li>将微型芯片读取器连接至设备，并在移植前读取微型芯片信息。</li>
		<li>为每只小鼠分配一个特定编号；我们采用以下方案：（见下表 2）</li>
		<li>移植后，将编号连同小鼠特征一并录入数据库。</li>
		<li>重新读取微型芯片，核对芯片信息、数据库记录与冻存管标签内容是否一致。</li>
		<li>相应地为每只小鼠笼子制作标签。 
		注：为建立物理备份，将带有对应微型芯片编号的冻存管标签粘贴至手册中，并注明日期和小鼠品系。</li>
		<li>为监测各个PDX模型的肿瘤生长情况，使用连接至数据库设备的读取器扫描小鼠的微型芯片以进行识别，并每周记录一次游标卡尺测量的肿瘤尺寸。</li>
		<li>通过分析肿瘤生长曲线，规划PDX收获的最佳时间点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>肿瘤编号</td>
			<td>先前在N2 中保存（=f）</td>
			<td>传代（=T）次数</td>
			<td>连续移植小鼠（=M）编号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">示例：HROP12 fT0 M1 = 罗斯托克，胰腺癌，病例12，来源于冷冻原代组织，第一代传代，第一只小鼠。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：PDX编号的定义。

<ol><li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
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建立一个活体生物样本库除了需要遵守隐私、医疗法律和动物福利的法规外，还需要良好的基础设施和协调有序的团队。将部分外科医护人员直接纳入研究流程已被证明具有优势，因为他们能够较好地评估每位患者是否适合进行组织捐献。此外，当在手术知情同意讨论过程中获取患者的书面同意时，患者更倾向于同意生物样本库的储存。为了节省时间和资源，不应选择那些预计无法获得足够肿瘤组织量的病例进行生物样本库建设。在样本获取方面，应遵循以下原则 &#34;沟通至关重要&#34; 是一个简单但常常被忽视的事实。只需一名对流程不了解的手术室护士或外科同事，像往常一样操作，向切除标本中加入甲醛，就可能从最初阶段彻底破坏样本。因此，所有相关工作人员都必须熟悉生物样本库的标准操作程序（SOP），这是至关重要的。外科医生应在组织取样前一日以及手术开始时即被告知即将进行的组织采集安排。此外，应于电子手术室（OR）计划中明确标注出选定用于生物样本库的病例。手术标本的组织取样应由病理科医生执行。首先，这可确保组织取样不会干扰最终的病理报告；其次，这将提高获得足量活性癌组织的概率。尤其是在胰腺癌中，由于存在明显的间质纤维化反应及频繁出现的坏死区域，未经过训练的人员很难通过肉眼识别出活性组织区域。作为例外情况，较大的肝或肺转移灶组织块有时可由非病理科人员切除 &#34;背板操作&#34; 由外科医生在能够通过肉眼界定手术切缘的情况下进行。经全直肠系膜切除术（TME）切除的直肠癌标本可能不适合用于生物样本库，因为在石蜡包埋前对切除标本进行组织取材可能会影响TME质量评估。 alternatively，可用于生物样本库的组织可通过经肛门直肠癌活检获取。
源自原发肿瘤的原代细胞培养建立率通常较低。而源自PDX的继代细胞培养则更有可能成功建立。我们建议针对每个病例测试不同的培养基，并在最初几代培养中使用抗生素补充剂，以最大限度地减少污染，因为所获取的组织很少是无菌的。在成功扩增后，应通过FACS分析确认每个独立的细胞系为癌细胞系，并定期检测支原体污染。为排除交叉污染，建议定期进行STR分析。需要注意的是，原代和继代细胞系的建立方案始终处于持续优化过程中。有关各种培养基的具体成分及其建立成功率的详细信息显然超出了本研究的范围，将另行发表。
对于PDX移植，肿瘤组织可在切除后直接植入，或使用含10% DMSO的胎牛血清或类似的冷冻保存液进行冷冻保存，以备后续延迟植入。在肿瘤组织获取后立即进行植入会对物流和实验室人员造成较大压力，而冷冻保存后的异种移植结果完全不逊色于即时植入10。此外，在肿瘤植入前将组织在Matrigel中孵育，可显著提高移植成功率12。我们建议在获得明确的病理诊断结果后再进行延迟移植，并立即丢弃采集错误的组织样本。由于初次移植的成功率随受体小鼠免疫缺陷程度的增加而提高，我们通常在首次PDX传代时使用NSG小鼠。在首次成功建立PDX模型后，后续传代和组织扩增可且应使用NMRInu/nu小鼠。该品系相比NSG或其他免疫缺陷小鼠品系更为强健、成本更低且更易于繁殖，同时仍具有较为理想的移植成功率。此外，其无毛特性有利于植入操作及对肿瘤生长的监测。为了提高后续传代的移植成功率，我们建议尽可能将新鲜获取的PDX组织直接转移至宿主小鼠，尤其是对于生长缓慢的PDX模型或初次移植成功率较低的情况。Collins和Lang近期综述了14项关于结直肠癌PDX建模的研究，报道的移植成功率范围为14%至100%，中位建模成功率为68%，这与我们的研究结果一致13。与文献报道一致，我们观察到胰腺癌PDX的建模成功率低于结直肠癌PDX14。无论宿主小鼠品系和肿瘤类型如何，在植入部位出现人源EB病毒（EBV）相关B细胞淋巴瘤或小鼠源淋巴瘤均是一个重要的陷阱15,16。若未被识别，此类肿瘤可能&#34;污染&#34;后续传代，从而干扰连续实验结果。PDX异常快速生长以及颈部、腋窝和腹股沟淋巴结肿大是小鼠淋巴瘤生长的强烈提示信号，但仍建议定期进行PDX组织的组织学检查。此外，应通过STR分析定期检测PDX模型与其相应供体患者之间的遗传一致性。理想情况下，生物样本库应与包含患者特征（一般信息、生存情况、无复发生存期、治疗方案、继发性肿瘤等）的临床数据库相连接。由于隐私保护相关法律法规的限制以及缺乏此类匿名化数据库，我们的临床数据集目前由合作医生定期手动管理和更新。
传统的生物样本库仅限于观察性研究，而活体生物样本库则为体外（in vitro）和体内（in vivo）干预提供了可能。来源于患者的细胞系是基础研究、高通量药物筛选以及新药制剂评估的重要工具4。然而，相应的患者来源异种移植模型（PDX）正变得日益重要，因为它们能够高度还原原始肿瘤的组织学特征17,18，并在多次传代过程中表现出较高的遗传稳定性19,20。我们的PDX生物样本库已被证实是进行临床前研究和基础研究的优秀平台6,21。此外，由于大规模PDX样本库能够充分反映患者群体之间的个体异质性，PDX临床试验（PCT）方法（每种模型每种治疗方案使用一只动物）在药物开发中日益受到重视，因其能够准确预测新药及联合用药方案的临床疗效8。目前，我们也在小型PCT试验中评估新的实验性药物。
尽管这些结果令人鼓舞，但PDX模型平均12.2个月的建立周期，限制了其作为测试抗癌治疗方案的“&#34;替身小鼠&#34;”在临床上的应用，至少对于那些需要立即接受辅助治疗甚至新辅助治疗的患者而言是如此22。标准PDX模型的另一个缺点是由于宿主小鼠的免疫缺陷，无法用于免疫治疗的测试。为了克服这些局限性，已开发出多种“&#34;人源化&#34;”小鼠品系。这类小鼠具有严重的免疫缺陷，但在PDX组织长出后，可通过移植多种来源于人类骨髓的细胞或CD34+造血干细胞进行免疫系统重建23，从而实现对淋巴细胞介导的细胞毒性以及免疫检查点抑制剂治疗反应的评估24,25。
近年来，源自患者的类器官（PDO）作为一种重要的癌症模型，逐渐与PDX模型相抗衡。PDO由完整的肿瘤组织块衍生而来，并在细胞外基质支架中进行培养，形成能够高度模拟原始肿瘤组织学特征和遗传特性的三维结构。其具备长期扩增和冷冻保存的潜力，使其成为活体生物样本库的理想补充。26,27除了具有相对较高的建立率外，已有报道称PDO对多种肿瘤类型具有可靠的药物反应预测能力28此外，类器官还可由循环肿瘤细胞生成，并可同时从相应健康组织建立类器官，从而能够在个体化基础上评估治疗相关毒性29,30然而，与传统的二维细胞培养相比，类器官培养耗时较长且耗费资源较多，人工细胞外基质成分可能干扰某些分析步骤。31此外，癌性类器官容易被来自健康上皮、生长速度更快的非恶性类器官过度生长而占据优势30由于缺乏间质、血管和免疫细胞，类器官在抗血管生成免疫治疗药物的测试中大多不适用。然而，新的培养方法使得肿瘤微环境的建模成为可能。 体外，使PDO成为PDX模型的真正竞争者32在不久的将来，结合下一代测序等强大遗传学工具的患者个体化肿瘤模型，有望为实现真正的精准医学和个体化治疗策略铺平道路。

近年来，关于癌症形态学、临床特征和遗传特性的知识不断积累，使人们逐渐将癌症视为一种具有异质性的个体化疾病。因此，除了临床和病理特征外，肿瘤突变谱的表征在临床决策中的重要性日益凸显，针对多种分子改变的靶向治疗也相继被开发。例如，通过分析KRAS基因的突变状态，可预测西妥昔单抗在结直肠癌治疗中的疗效 KRAS 和 PIK3CA 突变状态1精准医学旨在采用个体化治疗策略，为每位患者提供最佳治疗反应，并避免无效治疗带来的毒性。2生物样本库包含癌症患者的组织、血液及其他生物材料，并与临床数据相关联，因此是转化癌症研究的有力工具。由于拥有大量临床样本，生物样本库有助于发现罕见但可能具有药物靶向性的突变，从而为个体患者提供新的治疗机会3.
为了尽可能广泛地覆盖肿瘤学研究领域，我们的工作不仅限于样本采集，还着重于建立患者来源的癌细胞系和异种移植模型（PDX）。传统的二维（2D）细胞系仍然是 体外 研究的首选，适用于大规模药物筛选4,5此外，细胞系分析通常更简便、成本更低且更容易获得。另外，由于可获取患者来源的外周血淋巴细胞（PBL），也可用于肿瘤免疫学的研究。 体外6然而，大多数新开发的药物在基于细胞的临床前研究中虽表现出良好的有效性， 体外 或 体内 实验在临床试验中显示出令人失望的结果7相比之下，基于PDX的临床前研究 体内 研究已更加真实地反映了抗肿瘤药物的临床疗效8由于PDX组织能高度还原供体肿瘤的组织学和分子特征，PDX模型是扩增通常极为有限的可存活肿瘤组织的有效方法，有助于维持生物样本库的完整性，并促进研究团队和机构之间的样本共享。此外，相较于原代肿瘤细胞系，源自PDX组织的肿瘤细胞系的建立显著更为容易。9近年来，我们的研究团队通过逐步标准化和优化所涉所有生物样本的工作流程，建立了一个全面整合的结直肠癌和胰腺癌生物样本库。图1).
<img alt="组织样本处理流程图；手术、病理、离心机、细胞培养、生物样本库、动物实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：生物样本库的工作流程与组织架构 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Bacillol&amp;reg; 心房颤动；一线治疗</td><td>博德，哈特曼</td><td>参考编号 973380</td><td>消毒</td></tr><tr><td>聚丙烯离心管，15 ml；无菌</td><td>Greiner Bio One</td><td>GBO 货号：188271</td><td>离心管</td></tr><tr><td>50 ml 无菌聚丙烯离心管</td><td>Sarstedt</td><td>订单编号：62.547.254</td><td>离心管</td></tr><tr><td>BD Discardit&lt;sup&gt;TM &lt;/sup&gt;20毫升注射器</td><td>BD</td><td>REF 300296</td><td>血液采集</td></tr><tr><td>血清 7.5 ml Sarstedt Monovette</td><td>Sarstedt</td><td>编号：01.1601</td><td>血液采集</td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>REF 86.1254.001</td><td>液体转移</td></tr><tr><td>Pipetboy ratiolab&amp;reg; Accupetta</td><td>Ratiolab</td><td>货号：RL3200300</td><td>液体转移</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>VWR 货号：613-4438</td><td>液体转移</td></tr><tr><td>DPBS；无 Ca &amp;和 Mg</td><td>Pan Biotech</td><td>货号：P04-36500</td><td>洗涤</td></tr><tr><td>Pancoll 人</td><td>Pan Biotech</td><td>货号：P04-60500</td><td>密度梯度离心</td></tr><tr><td>DMEM/F12（Dulbecco）&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基)</td><td>PAN Biotech</td><td>货号：P04-41500</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>FBS Good Forte（过滤牛血清）</td><td>PAN Biotech</td><td>货号：P40-47500</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>PAN Biotech</td><td>货号：P04-80100</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>货号：P10-023100</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>DMSO（细胞培养用二甲基亚砜）</td><td>PanReac AppliChem</td><td>VWR 货号：A3672.0250</td><td>细胞冻存</td></tr><tr><td>冻存液（含10% DMSO的FCS）</td><td>自制</td><td>---</td><td>细胞冻存</td></tr><tr><td>冻存管 - CryoPure 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>细胞冻存</td></tr><tr><td>6孔细胞培养板；无菌；带盖</td><td>Greiner bio-one</td><td>货号：657 160</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>培养皿 92 x 16 mm，聚苯乙烯材质，无卡扣</td><td>Sarstedt</td><td>货号：82.1472.001</td><td>组织制备</td></tr><tr><td>无菌手术刀片</td><td>B.Braun（Aesculap）</td><td>REF BB510</td><td>组织制备</td></tr><tr><td>BD Discardit&lt;sup&gt;TM &lt;/sup&gt;2号注射器 10 ml</td><td>BD</td><td>REF 309110</td><td>组织制备</td></tr><tr><td>细胞滤网；黄色；100&amp;micro;m</td><td>Falcon</td><td>REF 352360</td><td>组织制备</td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Biocision</td><td>货号：210004</td><td>带有 -1 的冷却容器&amp;deg;℃/min</td></tr><tr><td>Dewar&amp;nbsp;2 型运输容器 B，2 升，138 毫米</td><td>KGW</td><td>货号：HT39.1</td><td>转运系统</td></tr><tr><td>200 微升移液器吸头&amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.760.002</td><td>液体转移</td></tr><tr><td>滤芯吸头 1000&amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.762.411</td><td>液体转移</td></tr><tr><td>移液200&amp;micro;l，黄色</td><td>Eppendorf</td><td>货号：3121 000.082</td><td>液体转移</td></tr><tr><td>移液器 1000&amp;micro;l，蓝色</td><td>Eppendorf</td><td>货号：3121 000.120</td><td>液体转移</td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp; BB 6220 CU</td><td>Heraeus</td><td>货号：51012839</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>加热板 PR&amp;Auml;ZITHERM</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>---</td><td>加热</td></tr><tr><td>显微镜 Zeiss Primo Vert</td><td>卡尔·蔡司显微成像有限公司</td><td>序列号。3842000839</td><td>成像细胞培养物</td></tr><tr><td>无菌操作台 Safe flow 1.8 nunc</td><td>nunc GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>---</td><td>无菌操作台</td></tr><tr><td>-80 冰箱&amp;deg;C</td><td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td><td>---</td><td>样品储存</td></tr><tr><td>电子天平 MP-300</td><td>Chyo</td><td>---</td><td>比例尺</td></tr><tr><td>BD 微细，U100 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>参考编号 324826</td><td>注射麻醉剂</td></tr><tr><td>隆朋 2%；25 ml</td><td>拜耳</td><td>批准编号：6293841.00.00</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>氯胺酮 100 mg/ml，25 ml</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>批准编号：401650.00.00</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>GES3S 读取器</td><td>Datamars</td><td>暂无内容</td><td>射频识别读取器</td></tr><tr><td>ISO-Transponder FDX-B（1.4×8 mm）</td><td>Peddymark</td><td>---</td><td>RFID芯片</td></tr><tr><td>Cotrim-ratiopharm&amp;reg;&amp;nbsp;SF 480安瓿瓶&amp;nbsp;毫克/5&amp;nbsp;毫升</td><td>Ratiopharm</td><td>PZN-03928197</td><td>抗生素饮水</td></tr><tr><td>加热板 #FM-20 42x28 cm</td><td>龙</td><td>---</td><td>加热</td></tr><tr><td>加热灯</td><td>佩特拉电气公司，布尔高</td><td>---</td><td>加热</td></tr><tr><td>用于眼部和鼻部的软膏（5% 泛醇）Bepanthen</td><td>拜耳</td><td>PZN-01578675</td><td>眼部防护</td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD21 或</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>手术镊</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD50 1 R</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BC05 6R</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>针&amp;nbsp;支架</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BH1 1 或</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>XN8870.P32</td><td>外科缝合材料</td></tr><tr><td>Opsite 水汽通透性喷雾敷料</td><td>Smith&amp;安普&内夫</td><td>REF 66004978，PZN-02063507</td><td>外科缝合材料</td></tr><tr><td>粘性开口巾</td><td>屏障</td><td>REF 904622</td><td>无菌眼杯组织</td></tr><tr><td>纱布更换 Gazin&amp;reg;；灭菌；10 cm × 10 cm</td><td>Lohmann&amp;amp;Rauscher</td><td>参考文献 18506</td><td>无菌眼杯组织</td></tr><tr><td>Raucotupf 棉签</td><td>Lohmann&amp;amp;Rauscher</td><td>参考文献 11969</td><td>施用器</td></tr><tr><td>康宁&amp;reg; Matrigel 基底膜基质</td><td>康宁</td><td>货号：354234</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>碘溶液 Braunol（7.5 g 聚维酮碘）</td><td>B.Braun Melsungen AG</td><td>项目编号：18839</td><td>消毒</td></tr><tr><td>磁珠分选&amp;reg; 组织保存液</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>货号：130-100-008</td><td>储存溶液</td></tr><tr><td>Formafix 4%</td><td>Grimm med. Logistik GmbH</td><td>货号：F10010G</td><td>固定液</td></tr><tr><td>软件 FreezerworksBasic</td><td>Dataworks Development, Inc</td><td>---</td><td>样本处理</td></tr><tr><td>Zebra TLP 2844 打印机</td><td>斑马</td><td>---</td><td>标签打印机</td></tr></tbody></table>

创建与维护活体生物样本库——我们的实践方法

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

鉴于人们对癌症个体间特性及异质性认识的不断深入，个性化医学这一新兴领域迫切需要一个用于临床前研究的平台。近年来，我们建立了一个包含结直肠癌和胰腺癌的生物样本库，其中涵盖原发性肿瘤组织、正常组织、血清、分离的外周血淋巴细胞（PBL）、患者来源的异种移植瘤（PDX），以及原代和继代癌细胞系。由于原始肿瘤组织来源有限，且原代癌细胞系的建立成功率仍然相对较低，PDX模型不仅有助于生物样本库的保存与扩展，还可用于生成继代癌细胞系。此外，PDX模型已被证实是临床前药物测试的理想体内模型。然而，生物样本库的建设需要周密的准备、严格的规范以及高度协调的基础设施。结肠切除术、胰十二指肠切除术或切除的转移灶标本在术后立即采集，并迅速转移至病理科。在确保不影响病理医师进行无偏倚组织病理学诊断的前提下，由负责解剖的病理医师酌情采集小块肿瘤组织及非肿瘤组织。
坏死部分被弃去，剩余的肿瘤组织被切成大小相同的小块，并冷冻保存以备后续使用。此外，取少量肿瘤组织进行研磨和过滤，用于原代癌细胞培养。同时，采集患者术前和术后的血液样本，经处理后分离血清和外周血淋巴细胞（PBLs）。对于PDX移植，将冷冻保存的标本解冻后皮下植入免疫缺陷小鼠的侧 flank 部位。所建立的PDX模型在组织学上高度再现了“供体”肿瘤的特征，可用于后续的异种移植实验，也可再次冷冻保存以备将来使用。在本研究中，我们详细描述了结直肠癌和胰腺癌大型生物样本库的建立、维护与管理过程，并强调了生物样本库建设中的关键细节和注意事项。

在我们实验室，原代细胞培养的建立率（图2A &amp; B) 在一个大样本系列中为12.9%9从新鲜手术切除标本中分离可扩增肿瘤细胞的大多数尝试均因缺乏细胞迁移生长或早期污染而失败。在标准培养条件（DMEM，10% FCS，标准培养器皿）下，经连续三代培养后细胞保持稳定生长，并通过FACS分析验证上皮细胞分化特征，方可认定细胞系建立成功。10源自PDX肿瘤的细胞系（图 2C &amp; D)的建立率为23.6%，显著更高，这同样归因于相较于原发切除肿瘤可进行重复尝试的可能性9然而，一些混合培养物（图2E）无法摆脱成纤维细胞生长，甚至因成纤维细胞过度生长而丢失（图2F).
<img alt="细胞培养显微图像、干细胞分化阶段、实验结果，比例尺：100μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：细胞培养。源自结肠癌病例 HROC313 转移灶的原代癌细胞系，第 21 代（A）；胰腺癌病例 HROP88 的原代癌细胞系，第 5 代（B）。源自结肠癌 PDX 模型 HROC285 T0 M2 的 PDX 来源癌细胞系（D），以及源自胰腺癌 PDX 模型 HROP10 T5 M2 的 PDX 来源癌细胞系，第 4 代（E）。胰腺癌 HROP75 的成纤维细胞与癌细胞混合培养物，第 8 代（C），以及成纤维细胞过度生长（F）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
考虑到PDX建模方案、使用的小鼠品系、实验人员在多年间的变动，以及可用于移植的肿瘤组织量存在较大差异，因此很难给出PDX建模的整体成功率。在两位研究人员（S.M. 和 F.B.）近期开展的一系列PDX建模实验中，结直肠癌PDX的原代成瘤率为63%（代表性组织学图像可从 图 3A）以及胰腺PDX的48%图3B在植入部位观察到小鼠或人类淋巴瘤的生长相对罕见，但可能模拟PDX成功生长的现象。图3C）。除了组织病理学检查外，还通过短串联重复序列（STR）分析定期验证PDX模型与其供体患者之间的一致性（图3D至今，该生物样本库包含 &gt;50个初级和 &gt;50种结直肠癌继代细胞系、3种胰腺癌原代细胞系和6种胰腺癌继代细胞系 &gt;150个结直肠癌和19个胰腺癌PDX模型。
<img alt="经H&amp;E染色的组织样本的组织学图像A-C；D显示遗传分析电泳图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：结直肠癌（A）和胰腺癌PDX（B）的代表性组织学比较。移植部位的人类淋巴瘤模拟PDX生长（C）。通过短串联重复序列（STR）分析对PDX模型（HROC430 T1 M2）与原始患者肿瘤组织（HROC430Tu）进行遗传身份鉴定。采用多重PCR结合荧光标记引物，经毛细管电泳后，比较9个STR位点vWA、THO1、TPOX、CSF1PO（FAM染料）以及D5S818、D13S317、D7S820、D16S539（HEX染料），证实了PDX模型与供体肿瘤之间的遗传一致性（D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

在以下工作中，我们描述了建立结直肠癌和胰腺癌大型生物样本库所需的连续步骤。

鉴于人们对癌症个体间特性及异质性的认识不断深入，个性化医学这一新兴领域需要……

活体生物样本库的建立与维护：我们的实践方法。引言。传统的生物样本库通常包含无活性的组织和血液样本。尽管这些样本能够充分反映癌症患者群体的多样性，并可用于遗传学和组织学分析，但它们不适合用于评估治疗策略的临床前试验。整合患者来源模型的生物样本库可克服这些局限性，从而实现精准医学的功能性检测。样本采集。对于结直肠癌和胰腺癌的生物样本库保存，必须选择经确诊且肿瘤大小足够的病例，且患者知情同意为强制性要求。手术开始前，使用肝素化注射器抽取20 ml血液，另用血清单管抽取7.5 ml血液。进行血清处理和外周血淋巴细胞（PBL）分离。在4摄氏度下以1,128 RCF离心15分钟后，将血清分装至预先标记的冻存管中，并立即浸入液氮中。将肝素抗凝血转移至聚丙烯管中，并用15 ml PBS稀释。使用刻度移液管缓慢地将15 ml Pancoll溶液加入混合液下方。经密度梯度离心后，用血清移液管吸取含有单个核细胞的不透明层，并转移至新的聚丙烯（PP）管中。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤单个核细胞，并通过离心形成细胞沉淀后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于冷冻保存液中，分装至预先标记的冻存管内。将冻存管放入适用于慢速冷冻（每分钟降低1°C）的降温容器中，暂时储存于-80°C条件下。组织处理。一旦外科医生切除组织标本，立即将其放入合适的容器中。务必避免组织被福尔马林覆盖。尽快将标本运送至病理科，以切除与切除边缘病理学评估无关的肿瘤组织。肿瘤组织应尽可能保持无菌操作。此外，取一份健康组织样本，并将两者分别置于预装有组织保存液并置于冰上的独立试管中。立即返回实验室，在无菌条件下开始组织处理。将组织块置于盛有组织保存液的无菌塑料培养皿中，以防止干燥。首先，根据所获取组织标本的大小，切取一个或多个针尖大小的组织块用于速冻。将原代组织放入预先标记的冻存管中，并立即浸入液氮中。将剩余组织切成3×3×3立方毫米的组织块。注意坏死组织必须完全分离，但不应丢弃。将细胞分装成四联组，以确定活性保存所需的分装份数。标记足够数量的冻存管，并预先在每管中加入1.5 ml冻存液。由于冻存液中的DMSO具有细胞毒性，后续步骤应迅速且连续地进行。使用手术刀片将每管收集四块组织。确保所有组织块完全浸没在冻存液中，最好位于管底，然后使用冻存盒快速冷冻各管。对健康组织标本以相同方法进行处理。长期保存时，将所有分装样品存放在液氮罐中。细胞培养。用手术刀片将肿瘤组织处理后的残留物（包括坏死部分）尽可能切碎。将细胞筛置于无菌聚丙烯管顶部，用血清移液管吸取悬液，使其通过细胞筛。使用一次性注射器的推杆将组织残余物压过细胞筛，以制备单细胞悬液。用 PBS 冲洗，并重复上述步骤，直至无残留物为止。去除细胞滤网，将悬液在180 RCF下离心7分钟。在此期间，准备不同培养基成分的胶原预包被六孔板，以提高肿瘤生长的可能性。弃去上清液，将沉淀用PBS重悬，并每孔加入500微升。随后，将培养板放入标准培养箱中。建立患者来源的异种移植模型。在免疫缺陷小鼠中建立患者来源的异种移植模型时，动物应饲养在特定病原体-free环境中。穿戴个人防护装备，包括刷手服、围裙、口罩、头罩和手套。整理好工作区域后，从液氮容器中取出所需的肿瘤样本。用35 ml PBS填充一个全新的聚丙烯管，然后仔细清洗解冻过程中的样本，轻轻上下摇动冻存管。当内容物变为泥状时，立即倒入 PBS 中并冲洗肿瘤组织块。弃去大部分 PBS，将组织块转移至盖子中。将无菌塑料培养皿置于冰袋上，并加入 100 微升 Matrigel 液滴。用镊子将肿瘤组织块放入 Matrigel 中，孵育 10 分钟。在此期间，麻醉两只小鼠。通过轻捏动物足部检查麻醉深度。任何运动均表明麻醉不充分，需要等待一段时间或追加给药。涂抹眼膏，捏住小鼠颈部皮肤并皮下注射植入微芯片。以下步骤可同时进行。对小鼠 flank 部位进行消毒，使用条纹 Metzenbaum 剪刀做一小切口，并通过钝性分离形成皮下 pocket。使用解剖镊将肿瘤组织块插入皮下 pocket 中，确保组织块置于皮下 pocket 的后端。吸净残留的Matrigel，并均匀分配至全部四个囊袋。待凝胶固化后，使用单纽扣缝合法关闭皮肤，注意缝合时避免缝针损伤肿瘤组织。将线头在打结后尽可能剪短，并喷洒喷雾敷料，以防止缝线刺激周围组织。扫描微芯片并将肿瘤信息添加到数据库中，以便后续识别动物。准备一个带有新鲜垫料和筑巢材料的笼子，将小鼠放在红外灯前，并监测动物直至麻醉作用消退。PDX的取出。当PDX肿瘤达到所需大小后，采用CO2窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。仔细剥离肿瘤周围的皮肤，完整切除PDX肿瘤。代表性结果。将肿瘤置于无菌塑料培养皿上，使用无菌手术刀片进行后续处理。用组织切片打孔，将切片放入组织学盒中，并浸入福尔马林溶液，以制备石蜡包埋标本，供后续组织学评估。将剩余肿瘤组织转移至组织保存液中，制备新的活体保存和速冻标本，用于生物样本库。此外，可利用与原代细胞培养类似的PDX肿瘤残留组织建立二代肿瘤细胞系。为进一步获得PDX模型，可将两块或更多带有Matrigel的肿瘤组织移植至新的受体小鼠体内，操作方法如前所述。结论：通过本方案，我们迄今已成功建立了9个胰腺癌和100多个结直肠癌患者来源的癌细胞系，以及19个胰腺癌和150多个结直肠癌PDX模型。

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创建与维护活体生物样本库——我们的实践方法

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