限制性核酸内切酶介导的 DNA 切割的单分子停留时间分析
February 7th, 2021
利用量子点标记的DNA和全内反射荧光显微镜，我们可以研究使用未标记蛋白质时限制性核酸内切酶的反应机制。这种单分子技术允许对单个蛋白质-DNA相互作用进行大规模多路复用观察，并且可以合并数据以生成填充良好的停留时间分布。
通过该协议，我们可以在单分子水平上通过限制性核酸内切酶直接观察位点特异性DNA切割。我们的多路复用方法使我们能够测量数百个单独的 REase 完成催化循环所需的时间。多路复用使我们能够生成填充良好的停留时间到切割分布，我们可以将其与伽马概率分布拟合，从而深入了解 DNA 切割的机制。
首先，为每个重悬的寡核苷酸制备一个新鲜的试管，将 50 微升寡核苷酸和 50 微升新鲜制备的 DTT 溶液加入每个试管，上下移液以混合并在室温下孵育 30 分钟。将每种样品混合物的全部体积轻轻移液到准备好的柱上，并以 750G 离心两分钟。离心后，将任何不会立即使用的样品储存在 20 摄氏度下，以防止硫醇基团氧化和二硫键的形成。
将 50 微升量子点原液的等分试样移液到透析装置中，用于制备每种构建体，确保不要用移液器吸头接触膜。在100RPM下搅拌15分钟，对至少为样品体积1,000倍的CHES缓冲液进行透析。使用移液器，小心地从透析装置中取出悬浮的量子点，并将它们转移到含有等体积新鲜制备的Sulfo-SMCC溶液的新鲜管中，上下移液混合。
在室温下孵育 1 小时，以 1， 000 RPM 振荡，使 Sulfo-SMCC 与量子点上的伯胺反应。然后，使用移液器小心地将每个样本转移到新鲜的透析装置中。为了去除多余的Sulfo-SMCC，在搅拌15分钟的情况下，对至少是透析装置中所含体积的1,000倍的CHES缓冲液进行透析。
更换缓冲液两次，并用新鲜的CHES缓冲液进行透析，总共三次，每次更换缓冲液后允许透析进行15分钟。然后用PBS重复透析。使用移液器，小心地从透析装置中回收含有量子点的溶液，并将每个样品转移到含有等摩尔量的在PBS中稀释的扩张寡核苷酸的新鲜管中。
在室温下孵育 2 小时，以 1， 000 RPM 振荡。向每个样品中加入 BSA，最终浓度为 0.5 毫克/毫升。然后使用移液器小心地将每个样品转移到新鲜的透析装置中，并对储存缓冲液进行透析。
透析后，小心地回收每个样本并将其放入新鲜的试管中。将样品储存在 4 摄氏度下。将量子点标记的寡核苷酸样品与摩尔过量的生物素化寡核苷酸混合。
将加热块中的混合物加热至 75 摄氏度，并在该温度下保持 5 分钟。然后关闭加热块，让混合物慢慢冷却。将完成的结构储存在 4 摄氏度下 使用装有锥形金刚石尖轮钻头的手持式旋转多功能工具，在石英滑轨的相对角上钻两个孔，作为入口和出口。
确保将滑轨固定到位，润滑钻头并在钻孔时不断用水滑行。每次实验后，通过将用过的设备浸泡在丙酮中以溶解粘合剂和环氧树脂来恢复准备好的石英载玻片。丢弃剩余的组件。
将 25 微升链霉亲和素溶液与 80 微升 PBS 和 20 微升封闭缓冲液混合。用这种混合物涂在经过 PEG 处理的盖玻片上，并在潮湿环境中孵育 30 分钟。在盖玻片孵育期间，准备成像垫片以创建流道。
切割一块 1 英寸见方的成像垫片材料，然后标记一个 2 毫米宽的通道，与石英载玻片中钻出的孔的末端对齐。用手术刀从间隔材料中切出通道。用丙酮彻底清洁石英载玻片，以去除先前实验中残留的粘合剂。
从图像垫片上撕下背衬的一侧，然后小心地将其放在石英载玻片上，注意不要覆盖入口和出口孔。用水清洗盖玻片，并用压缩空气干燥。从成像垫片上取下背衬的另一侧，然后使用塑料镊子将其夹在石英载玻片和功能化链霉亲和素涂层的盖玻片之间，将组件压在一起并去除粘合剂上的气泡。
将管子的一端切成一定角度，以确保溶液自由流动。然后将 30 厘米长的聚乙烯管插入石英滑轨的每个孔中。用管架将管子固定到位，然后使用环氧树脂将管子密封到位和组装设备的边缘。
一旦环氧树脂凝固，将空注射器上的钝针插入设备的出口管中，并将入口管的末端浸入装有阻塞缓冲液的容器中。向后拉注射器柱塞，用阻塞缓冲液填充设备。然后在使用前将设备孵育至少 30 分钟。
用胶带将微流体装置连接到显微镜载物台板上。使物镜与设备底部接触，并放置物镜，使视场位于微流体通道内。将出口管连接到注射器泵后，拉回注射器柱塞，用新鲜的阻塞缓冲液冲洗微流体通道。
检查以确保管道或通道中没有气泡滞留。将 1 微升制备的 DNA 底物稀释到 1 毫升封闭缓冲液中。将入口管放入稀释的 DNA 底物中，并以每分钟 200 微升的速率流过通道，流出 800 微升的底物溶液。
流动停止后，让 DNA 溶液在通道中孵育 15 分钟。孵育后，以每分钟 200 微升的速度流过通道，将未结合的 DNA 从通道中冲洗出来。调整显微镜焦距，使表面拴住的量子点清晰可见。
用不含镁的800微升实验缓冲液以每分钟200微升的流速冲洗微流体装置。将 REase 加入不含镁的实验缓冲液的等分试样中，并通过移液轻轻混合。以每分钟 200 微升的流速将 800 微升/毫升 400 个单位的 EcoRV 流过通道。
通过以每分钟200微升的流速流出含有镁和荧光素的实验缓冲液来开始实验。启动注射泵后立即开始捕获数据。流过 800 微升缓冲液后停止数据采集。
在将 DNA 底物引入流通池并洗去多余的 DNA 和量子点后，视野中通常有数千个单独的量子点。它们稳定地附着在玻璃表面，在整个实验过程中不会发生明显的变暗或明显的漂白。当REase在没有镁的情况过通道时，在观察期结束时仍可以看到实验开始时存在的至少95%的量子点。
然而，当含镁的缓冲液在REase之后立即流动时，到观察期结束时，多达一半的量子点会消失，类似于当REase和镁一起流过通道时观察到的情况。量子点消失发生得很快，并导致强度轨迹急剧下降，从而清楚地表明了给定DNA分子被切割的时间。该实验是使用经过充分研究的 II 型 P REase EcoRV 进行的。
采用非线性最小二乘曲线拟合和最大似然参数估计方法从数据中提取n和beta的值。两种参数估计方法的一致性一致。使用非线性最小二乘拟合，n 为 3.52，beta 为 5.78 秒。
使用最大似然估计，n 为 3.41，beta 为 6.06 秒。该测定可以提供沿切割途径存在中间步骤的证据。在不断变化的反应条件下进行该测定有助于确定无法直接观察的反应中间体的性质。
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概述
本研究利用多重方法观察单分子水平上限制性内切酶对特定位点DNA的切割。通过使用量子点标记的DNA和全内反射荧光显微镜，研究调查了单个REases的催化循环。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分子生物学
- 单分子技术
背景
- 限制性内切酶是在特定位点切割DNA的酶。
- 了解它们的反应机制对于遗传学和分子生物学的各种应用至关重要。
- 单分子技术提供了大量测定可能忽略的见解。
- 多重分析允许同时观察多个相互作用。
研究目的
- 直接观察限制性内切酶的催化循环。
- 生成DNA切割事件的丰富停留时间分布。
- 深入了解DNA切割的机制。
使用的方法
- 使用DTT的硫醇保护剂来准备寡核苷酸溶液以防止氧化。
- 使用全内反射荧光显微镜进行观察。
- 对单个REase活性进行多重测量。
- 使用伽马概率分布进行数据拟合分析。
主要结果
- 成功观察到单分子水平上的特定位点DNA切割。
- 生成数百个REases的详细停留时间分布。
- 关于限制性内切酶催化机制的见解。
- 展示了在单分子研究中多重分析的有效性。
结论
- 该研究提供了一种新颖的方法来研究限制性内切酶。
- 研究结果有助于深入理解DNA切割机制。
- 多重分析增强了同时分析多个相互作用的能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
This single-molecule dwell-time analysis enables direct observation of restriction endonuclease catalytic cycles, providing mechanistic insights into DNA cleavage that are obscured in bulk assays. By quantifying intermediate steps in the cleavage pathway, the assay supports target validation and lead identification through enhanced predictive confidence in enzyme mechanism de-risking. The multiplexed format allows high-throughput generation of dwell-time distributions, facilitating scalable screening and assay development for nucleic acid-targeting therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing kinetic steps in DNA cleavage mechanisms that cannot be directly observed in ensemble measurements.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative dwell-time analysis of individual restriction endonuclease molecules.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing mechanistic de-risking data on nucleic acid-modifying enzymes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating well-populated dwell-time distributions from hundreds of single-molecule events.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through multiplexed measurement and gamma distribution fitting of cleavage kinetics.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by enabling pooled analysis across multiple experiments to increase statistical power.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by establishing dose- and condition-dependent changes in cleavage pathway intermediates.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by identifying rate-limiting steps and intermediates in DNA cleavage under varying reaction conditions.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development when linked to functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical work by providing quantitative, mechanism-resolved data on enzyme catalytic cycles.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving individual catalytic steps in restriction endonuclease-mediated DNA cleavage.
- Screening: Describes assay readiness through multiplexed single-molecule measurement and quantitative dwell-time outputs suitable for hit validation.
- Analytics: Highlights measurements and statistical outputs (gamma distribution fitting, n and beta parameters) that enable comparison of enzyme activity across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by establishing how reaction intermediates change with magnesium concentration or enzyme mutants.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for characterizing nucleic acid-processing enzymes across multiple targets and campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nucleic acid enzyme mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via multiplexed single-molecule imaging and pooled dwell-time analysis.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative cleavage pathway architecture.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy and microfluidic device preparation.
- Needs instrumentation for total internal reflection fluorescence imaging and syringe pump-controlled flow control.
- Demands cross-team standardization in quantum dot-DNA conjugate preparation and surface passivation protocols.
- Involves adaptation considerations for different restriction endonucleases or nucleic acid substrates.
- Includes practical limitations such as photobleaching of quantum dots and surface tethering efficiency affecting observation windows.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:31
Preparation of Quantum-Dot-Labeled DNA Substrate Materials
3:38
Microfluidic Device Construction
5:58
Surface Tethering of Quantum-Dot-Labeled DNA Substrate
7:07
REase-Mediated DNA Cleavage
7:51
Results: Single-Molecule TIRF Experiment for Parallelized Observations of DNA Cleavage Events
9:32
Conclusion
