限制性内切酶介导的DNA切割单分子停留时间分析

通过本方案，我们能够在单分子水平上直接观察限制性内切酶对特定位点DNA的切割过程。我们的多重化方法使我们能够测量数百个单个限制性内切酶完成催化循环所需的时间。多重化技术使我们能够获得分布充分的切割前停留时间数据，这些数据可通过伽马概率分布进行拟合，从而深入理解DNA切割的机制。

为每种重悬的寡核苷酸准备一个新离心管，向每管中加入50 µL寡核苷酸和50 µL新配制的DTT溶液，用移液器吹打混匀，室温孵育30分钟。将每份样品混合物的全部液体轻柔地移入已准备好的层析柱中，在750 × g下离心2分钟。离心后，将不立即使用的样品置于20 °C保存，以防止巯基氧化及二硫键的形成。

为每种待制备的构建体，用移液器吸取50微升量子点储备液至透析装置中，注意移液枪头勿接触膜。用至少为样品体积1,000倍的CHES缓冲液，在100 RPM搅拌条件下透析15分钟。使用移液器小心从透析装置中回收悬浮的量子点，并转移至含有等体积新鲜配制的Sulfo-SMCC溶液的新鲜离心管中，上下吹打混匀。

室温下以 1,000 RPM 振荡孵育 1 小时，使 Sulfo-SMCC 与量子点上的伯胺发生反应。然后，使用移液器小心地将每个样品转移至新的透析装置中。为去除过量的 Sulfo-SMCC，加入至少为透析装置内体积 1,000 倍的 CHES 缓冲液，并在搅拌条件下透析 15 分钟。

更换缓冲液两次，并用新鲜的 CHES 缓冲液总共透析三次，每次缓冲液更换后继续透析 15 分钟。然后使用 PBS 重复透析。使用移液器小心地从透析装置中回收含有量子点的溶液，并将每个样品转移至含有等摩尔量用 PBS 稀释的扩增寡核苷酸的新离心管中。

在室温下以 1,000 RPM 振荡孵育 2 小时。向每个样品中加入 BSA，使其终浓度为 0.5 毫克/毫升。然后使用移液器将每个样品小心转移至新的透析装置中，并用储存缓冲液进行透析。

透析后，小心回收每个样品，并将其放入新的离心管中。将样品储存在 4 摄氏度条件下。取一份量子点标记的寡核苷酸样品，与十倍摩尔过量的生物素化寡核苷酸混合。

将混合物置于加热块中，加热至75摄氏度，并在此温度下保持5分钟。随后关闭加热块，使混合物缓慢冷却。将完成的构建物在4摄氏度下保存。使用装有锥形金刚石点轮钻头的手持式旋转多用工具，在石英载玻片的对角角落钻两个孔，作为进样口和出样口。

务必固定好载玻片，钻孔时持续用水润滑钻头和载玻片。每次实验后，将使用过的装置浸泡在丙酮中以溶解粘合剂和环氧树脂，从而回收制备好的石英载玻片。丢弃其余组件。

将25微升链霉亲和素溶液与80微升PBS和20微升封闭缓冲液混合。用该混合液包被经PEG处理的盖玻片，并在湿润环境中孵育30分钟。在盖玻片孵育期间，制备成像间隔片以构建流动通道。

裁剪一块1英寸见方的成像间隔材料，然后标记出一条2毫米宽的通道，使其与石英载玻片上已钻孔的末端对齐。使用手术刀将通道从间隔材料中切割出来。用丙酮彻底清洗石英载玻片，以去除先前实验残留的任何粘合剂。

从成像间隔片的一侧撕下背衬，小心地将其放置到石英载玻片上，注意不要覆盖进样口和出样口。用水清洗盖玻片，并用压缩空气吹干。撕下成像间隔片另一侧的背衬，使用塑料镊子将功能化链霉亲和素包被的盖玻片与石英载玻片夹住间隔片，压合组装件以排除粘合剂中的气泡。

将管子末端斜向剪切，以确保溶液自由流动。然后将30厘米长的聚乙烯管插入石英片上的每个孔中。用试管架固定管子，再使用环氧树脂将管子密封固定，并密封组装装置的边缘。

环氧树脂固化后，将空注射器上的钝头针插入装置的出口管，并将入口管末端浸入装有封闭缓冲液的容器中。回拉注射器活塞，使装置内充满封闭缓冲液。随后将装置放置，孵育至少30分钟后再使用。

用胶带将微流控装置固定在显微镜载物台板上。使物镜与装置底部接触，并调整物镜位置，使视野位于微流控通道内。将出口管路连接至注射泵后，通过回拉注射器活塞，用新鲜的封闭缓冲液冲洗微流控通道。

检查以确保管路或通道内无气泡残留。将1微升制备好的DNA底物加入1毫升封闭缓冲液中进行稀释。将进样管插入稀释后的DNA底物中，并以每分钟200微升的流速将800微升底物溶液注入通道。

停止流动后，让DNA溶液在通道内孵育15分钟。孵育结束后，以每分钟200微升的流速向通道内至少注入800微升封闭缓冲液，以洗去未结合的DNA。调节显微镜焦距，使表面固定的量子点清晰可见。

以每分钟 200 微升的流速，用 800 微升不含镁的实验缓冲液冲洗微流控装置。将限制性内切酶加入一份不含镁的实验缓冲液中，并通过移液轻轻混匀。以每分钟 200 微升的流速，将 800 微升浓度为每毫升 400 单位的 EcoRV 流经通道。

以每分钟200微升的流速注入含有镁和荧光素的实验缓冲液，开始实验。启动注射泵后立即开始采集数据。缓冲液流过800微升后，停止数据采集。

在将DNA底物引入流动池并洗去多余的DNA和量子点后，通常在视野中可观察到数千个单独的量子点。这些量子点稳定地附着在玻璃表面，在整个实验过程中不会出现明显的亮度下降或显著的漂白现象。当限制性内切酶（REase）在无镁离子条件下流经通道时，在观察期结束时仍可检测到实验开始时95%以上的量子点。

然而，当在限制性内切酶作用后立即流加含镁缓冲液时，到观察期结束时，多达一半的量子点会消失，这与同时流加限制性内切酶和镁离子时观察到的现象类似。量子点的消失发生得非常迅速，并导致荧光强度轨迹急剧下降，从而清晰地指示出特定DNA分子被切割的时刻。本实验使用了已被广泛研究的II型P类限制性内切酶EcoRV进行。

采用非线性最小二乘曲线拟合和最大似然参数估计两种方法从数据中提取 n 和 beta 的值。两种参数估计方法的结果一致。通过非线性最小二乘拟合，n 为 3.52，beta 为 5.78 秒。

通过最大似然估计法，n 值为 3.41，beta 值为 6.06 秒。该检测方法可提供切割通路中存在中间步骤的证据。在不同反应条件下进行该检测有助于确定无法直接观察到的反应中间体的性质。