Name: 限制性核酸内切酶介导的 DNA 切割的单分子停留时间分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 了解限制性核酸内切酶介导的DNA切割的单分子停留时间分析方法。本研究利用量子点标记DNA和全内反射荧光显微镜技术，通过多重检测手段直接观察数百个REase的催化循环过程，生成详细的停留时间分布数据，为深入理解DNA切割机制提供重要依据。

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本研究工作获得了美国国家普通医学科学研究所授予 CME 的 K12GM074869 项目资助。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家普通医学科学研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 一般信息
<ol>
	<li>寡核苷酸设计 
	注意：60 个碱基对（bp）长的 DNA 底物由一对互补寡核苷酸组成，在 100 mM NaCl 条件下其双链熔解温度为 75 °C。
	<ol>
		<li>订购一条在 5' 端带有单个生物素修饰、另一条在 5' 端带有硫醇修饰（含六碳间隔基）的寡核苷酸。将识别位点置于双链区域的中央。 
		注意：以下显示了用于 EcoRV 的寡核苷酸序列（识别位点以粗体标出）。 
		5' 生物素 - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3' 
		5' 硫醇 - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有步骤均使用电阻率为 18 MΩ·cm 的超纯水。</li>
	<li>所有含量子点的溶液均需避光保存，以防光漂白。</li>
	<li>本实验方案需使用压缩空气源完成。</li>
</ol>
2. 量子点标记的DNA底物材料的制备
注意：除上述寡核苷酸外，制备量子点标记的DNA底物所需的其他材料见材料表，所需缓冲液见表1。
<ol>
	<li>将要与量子点偶联的寡核苷酸上的5'硫醇基团进行还原。
	<ol>
		<li>将每种巯基化寡核苷酸重悬于水中，浓度为100 µM。</li>
		<li>将 650 µL 水加入每个寡核苷酸样品的尺寸排阻离心柱中，涡旋混匀约 15 秒。静置离心柱 30 分钟使其充分装填。</li>
		<li>每次使用前立即配制新鲜的100 mM二硫苏糖醇（DTT）溶液，因为DTT在溶液中会迅速降解。小心打开一支含有7.7 mg DTT的小瓶，加入500 µL磷酸钠缓冲液，涡旋振荡以充分混匀。</li>
		<li>对于每种重悬的寡核苷酸，准备一支新的离心管，向管中加入 50 µL 寡核苷酸和 50 µL DTT 溶液。用移液器吹打混匀。室温孵育 30 分钟，以还原寡核苷酸 5' 端氧化硫醇基团之间的二硫键。</li>
		<li>取下离心柱盖，将每根离心柱放入收集管中。以750 × g 2 分钟，弃去洗脱液。</li>
		<li>将离心柱转移至新的离心管中。用移液器将一份DNA/DTT混合液的全部体积（100 µL）轻轻加至每个已准备好的柱子上。在750 × g 2分钟，测定洗脱液在260 nm处的吸光度，以确认浓度约为40 µM。</li>
		<li>将不立即使用的样品于 -20 °C 保存，以防止巯基氧化和二硫键形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA与量子点的偶联
	<ol>
		<li>将每种构建所需的50 µL量子点储备液用移液器移取一份至透析装置中，注意移液枪头勿接触膜。用一定体积的溶液进行透析 N-cyclohexyl-2-氨基乙烷磺酸（CHES）缓冲液，体积至少为样品体积的1000倍，于约100 rpm条件下搅拌15分钟。</li>
		<li>配制新鲜的6 mM磺基琥珀酰亚胺基-4-(N在每次使用前，立即将 CHES 缓冲液中的磺基-SMCC（sulfo-SMCC）溶解。小心打开一支含有 2 mg 磺基-SMCC 的小瓶，加入 800 µL CHES 缓冲液，涡旋振荡以充分混匀。</li>
		<li>使用移液器小心地从透析装置中取出悬浮的量子点，并转移至含有等体积磺基-SMCC（sulfo-SMCC）溶液的新离心管中；上下吹打混匀。室温下以1000 rpm振荡孵育1小时，使磺基-SMCC与量子点表面的伯胺发生反应。</li>
		<li>使用移液器将每份样品小心转移至新的透析装置中。为去除过量的 sulfo-SMCC，在搅拌条件下，用至少为透析装置内体积1000倍的 CHES 缓冲液进行透析，持续15分钟。更换缓冲液两次，共使用新鲜 CHES 缓冲液透析三次，每次更换缓冲液后继续透析15分钟。</li>
		<li>为进行第二次反应前的缓冲液置换，将透析装置转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯中，PBS 体积至少为装置内体积的 1000 倍。在搅拌条件下透析 15 分钟，更换缓冲液 2 次，并总共使用新鲜 PBS 透析 3 次，每次更换缓冲液后透析持续 15 分钟。</li>
		<li>使用移液器小心地从透析装置中回收含有量子点的溶液，并将每个样品转移至含有等摩尔量巯基化寡核苷酸（溶于PBS）的新鲜离心管中。加入等体积的PBS和1/10体积的th 还原并纯化的寡核苷酸样品体积（浓度约为40 µM），此时量子点浓度约为4 µM。室温下孵育2小时，以1000 rpm振荡。</li>
		<li>向每个样品中加入牛血清白蛋白（BSA，10 mg/mL），使最终BSA浓度为0.5 mg/mL。使用移液器将每个样品小心转移至新的透析装置中，用至少为透析装置内体积1000倍的储存缓冲液进行透析。缓冲液更换2次，共使用新鲜储存缓冲液透析3次，每次缓冲液更换后透析持续15分钟。</li>
		<li>使用移液器小心回收每个样品，放入新离心管中，并于4 °C保存。 
		注意：切勿在 -20 °C 下保存，因为量子点会因冷冻而受损。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>量子点标记的寡核苷酸与生物素化寡核苷酸的退火
	<ol>
		<li>将每种生物素标记的寡核苷酸重悬于储存缓冲液中，浓度为100 µM。未使用的样品储存于-20 °C。</li>
		<li>将量子点标记的寡核苷酸样品与10倍摩尔过量的生物素化寡核苷酸混合。由于量子点标记样品中DNA的估计浓度为2 µM，因此每10 µL该样品中加入0.2 µL的生物素化寡核苷酸。</li>
		<li>将混合物置于加热金属块中，在75 °C（互补区域的熔解温度）下加热，保持该温度5分钟。关闭加热金属块，使其缓慢冷却。将完成的构建体储存于4 °C，切勿冷冻。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 盖玻片的表面功能化
注意：此过程此前已在其他 JoVE 视频方案中描述过16,17。本方案描述了该操作步骤的改进版本，进行了少量修改以适配更小的玻璃载片。有关盖玻片表面功能化的其他所需材料，请参见材料表。
<ol>
	<li>将5个盖玻片放入每个盖玻片架中，注意每对盖玻片之间需空出一个位置，以防止彼此粘连。将装有盖玻片的架放入带盖的玻璃瓶中，加入乙醇至完全浸没盖玻片，然后拧紧瓶盖。将整个玻璃瓶置于水浴超声仪中，注意不要完全浸入水中，超声处理30分钟。</li>
	<li>将超纯水倒入洁净的烧杯或玻璃瓶中。使用金属镊子将载玻片连同其支架从乙醇中取出，浸入水中清洗。随后，将载玻片及其支架转移至盛有1 M氢氧化钾（KOH）溶液的玻璃瓶中。拧紧瓶盖，将玻璃瓶放入超声波清洗仪中，超声处理30分钟。 
	注意：氢氧化钾溶液具有腐蚀性和刺激性，操作时需小心。</li>
	<li>在每一步之间，按上述方法用水冲洗盖玻片，然后重复在乙醇和KOH溶液中超声处理。</li>
	<li>将载玻片连同其支架转移至一个装有纯丙酮的洁净玻璃瓶中。按照上述方法超声处理30分钟以完成清洗。此步骤后无需用水冲洗。</li>
	<li>使用金属镊子将载玻片连同其支架转移至一个洁净的100 mL烧杯中，烧杯内含80 mL新鲜丙酮和一根微型搅拌子。将烧杯置于磁力搅拌器上，转速设定为至少1,000 rpm。在丙酮剧烈搅拌的同时，用移液器向烧杯中加入1.6 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），配制成2%（v/v）的溶液。 
	注意：移液 APTES 时需小心，因其具有腐蚀性。</li>
	<li>让盖玻片在溶液中孵育 2 min，然后用金属镊子将带盖玻片的支架转移至盛有水的烧杯中，以终止反应。再用烧杯中的水冲洗盖玻片两次，每次均更换烧杯中的水。</li>
	<li>将硅烷化处理的玻璃载片置于烘箱中，在 120 °C 下固化 75 分钟。若不能立即进行下一步操作，可将盖玻片在真空条件下保存，最多数天。</li>
	<li>溶解 N100 mM 碳酸氢钠（pH 8.2）溶液中使用 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯衍生物化的聚乙二醇（PEG），甲氧基封端 PEG 与生物素封端 PEG 的比例为 10:1，甲氧基封端 PEG 浓度约为 100 mg/mL。</li>
	<li>将100 µL PEG溶液移液至半数干燥的硅烷化盖玻片上，每片盖上另一张盖玻片。在每个角落放置小块Parafilm作为间隔物，防止盖玻片相互粘连。</li>
	<li>在湿润环境中孵育盖玻片 3.5 h。分离盖玻片夹心结构，使用洗瓶以大量水冲洗每片盖玻片，并用压缩空气吹干。</li>
	<li>将功能化盖玻片置于真空条件下保存。确保聚乙二醇（PEG）处理面朝上，因为另一面无法捕获DNA底物。</li>
</ol>
4. 微流控装置的构建
注意：有关构建微流控装置所需的其他材料，请参见材料表。
<ol>
	<li>使用装有锥形金刚石点轮钻头的手持式旋转多用工具，在石英载片的对角位置钻两个孔，分别作为进样口和出样口。钻孔时务必固定好载片，对钻头进行润滑，并持续用水冷却。每次实验结束后，将使用过的装置浸泡在丙酮中以溶解胶粘剂和环氧树脂，回收制备好的石英载片以供重复使用；其余部件予以丢弃。 
	注意：钻孔可手动操作，但使用带压力装置的多用工具支架可使操作更简便。</li>
	<li>将25 µL链霉亲和素溶液与80 µL PBS和20 µL封闭缓冲液混合。用该混合液包被经PEG处理的盖玻片，并在湿润环境中孵育30分钟。</li>
	<li>在盖玻片孵育期间，准备成像间隔层以构建流动通道。裁剪一块1英寸见方的成像间隔层材料，然后标记一条宽2 mm的通道，使其与石英载片上所钻孔的位置对齐（图2）。使用手术刀将通道从间隔层材料中切割出来。</li>
	<li>剥离成像间隔层一侧的背衬，小心地将其贴附到石英载片上，注意不要覆盖进样口和出样口。务必用丙酮彻底清洁石英载片，以去除先前实验残留的胶粘剂。</li>
	<li>用水清洗盖玻片，并用压缩空气吹干。移除成像间隔层另一侧的背衬，将其夹在石英载片与已功能化并包被链霉亲和素的盖玻片之间，使用塑料镊子压紧组件，以排除胶粘剂中的气泡。</li>
	<li>将两根长度为30 cm的聚乙烯管分别插入石英载片的两个孔中。务必将管子末端斜切，以确保溶液流动顺畅。使用试管架或其他支撑装置固定管子，并用环氧树脂密封管子接口及组装装置的边缘。 
	注意：在一块Parafilm膜上构建装置效果较好，待环氧树脂固化后可轻松将其从底部剥离。</li>
	<li>待环氧树脂固化后，将空注射器上的钝针插入装置的出样管，将进样管末端浸入盛有封闭缓冲液的容器中。回拉注射器活塞，使装置内部充满封闭缓冲液。使用前至少孵育30分钟。</li>
</ol>
5. 量子点标记DNA底物的表面固定
注意：除了上述的微流控装置、DNA底物和封闭缓冲液外，参见材料表以获取其他材料，参见表1以获取用于表面固定量子点标记DNA底物所需的缓冲液。
<ol>
	<li>用胶带将微流控装置固定在显微镜载物台板上，使物镜接触装置底部，并调整物镜位置，使视野位于微流控通道内。</li>
	<li>将出口管路连接至注射泵后，回拉注射器活塞，用新鲜封闭缓冲液冲洗微流控通道。检查管路和通道内是否残留气泡。 
	注意：自此步骤起，务必确保进样管路始终浸没在液体中，以避免向装置内引入气泡。</li>
	<li>将1 µL已制备的DNA底物稀释至1 mL封闭缓冲液中。将进样管插入稀释后的DNA底物溶液，以200 µL/min的流速将800 µL底物溶液注入通道。停止流动后，让DNA溶液在通道中静置孵育15分钟。</li>
	<li>以200 µL/min的流速向通道内注入至少800 µL封闭缓冲液，以洗去未结合的DNA。</li>
	<li>调节激光功率、显微镜焦距和全内反射角（TIRF），使表面固定的量子点清晰可见。 
	注意：尽管量子点不易快速漂白，但仍建议尽可能降低激光功率，以减少闪烁现象。</li>
</ol>
6. 限制性内切酶介导的 DNA 切割
注意：有关用于限制性内切酶介导的DNA切割的材料和缓冲液，请参见材料表和表1。
<ol>
	<li>确保相机已冷却至最佳工作温度，并设置为高速流式成像模式，曝光时间为 0.10 s。准备采集约 4 分钟的数据。</li>
	<li>以 200 µL/min 的流速，用 800 µL 不含镁的实验缓冲液冲洗微流控装置。</li>
	<li>将限制性内切酶（REase）加入一份 1 mL 不含镁的实验缓冲液中，通过移液轻轻混匀。使用 4 µL 浓度为 100,000 单位/mL 的储备液，相当于终浓度为 400 单位/mL 的 EcoRV。以 200 µL/min 的流速将 800 µL 稀释后的酶溶液流过通道。</li>
	<li>通过以 200 µL/min 的流速引入含有镁和荧光素的实验缓冲液来启动实验。在启动注射泵后立即开始采集数据。缓冲液流动 800 µL 后，停止数据采集。</li>
</ol>
7. 数据分析
注意：有关本实验方案所用数据分析软件，请参见材料表；若使用其他分析平台，请相应调整。
<ol>
	<li>零时间点的确定
	<ol>
		<li>使用imtophat函数（图像处理工具箱中的内置形态学顶帽滤波函数），对实验视频的每一帧进行背景荧光扣除。选择半径为三像素的圆盘作为结构元素。通过从原始图像中减去滤波后的图像，获得背景强度。 
		注意：该滤波器仅保留比背景更亮且小于结构元素的图像特征。</li>
		<li>对每帧视频图像中扣除的背景值进行平均，并利用该数值的轨迹确定实验的零时间点（图3A）。通过查找变化速率首次超过死体积流动期间变化速率标准差3倍的帧，确定起始时间。 
		注意：每帧视频图像中扣除背景的平均值变化率出现急剧上升，表明含有示踪染料的最终实验缓冲液进入流动池的时间点（图3B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>量子点强度轨迹的计算与分析
	<ol>
		<li>对示踪染料到达前记录的经背景校正的视频帧集合，计算最大强度投影。在该投影图像中，使用如pkfnd之类的峰值检测函数，将量子点的位置确定到单像素精度。</li>
		<li>通过计算围绕峰值检测函数返回位置、边长为三像素的方形区域内每一帧视频图像的平均强度，生成单个量子点的强度轨迹。 
		注意：上述背景校正可消除示踪染料引入的伪影。所得强度轨迹应相对平稳，但仍包含自然发生的强度波动（图4）。</li>
		<li>通过强度轨迹的统计分析识别量子点消失事件。对每个量子点的强度轨迹，根据轨迹中观察到的噪声水平，计算一个阈值强度，该阈值高于最小值，其超出量为该轨迹最大值与最小值之差的适当比例。 
		注意：量子点的强度波动通常远大于背景波动。可通过比较这两类波动来确定合适的阈值：所选阈值必须高于最高背景值，但理想情况下应低于量子点荧光的最低值。对于本研究所呈现的数据，阈值设定为每个轨迹的最小值加上该轨迹最大值与最小值之差的三分之一。当量子点所在位置的观测强度最后一次高于此阈值时，即可判定其消失。</li>
		<li>确认疑似消失事件。仅当在消失时间点之前的超过一半视频帧中，观测强度持续高于该轨迹最小值与最大值中点，并且事件发生后强度轨迹的标准差下降时，才将该事件纳入最终分析。 
		注意：可采用其他统计检验方法，以确保仅记录有效的消失事件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+restriction+enzymes+became+the+workhorses+of+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).</li>
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<li>Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated%2C+Au%2FAg+striped+nanowires+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis.</a> Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突

本实验所用的DNA底物通过两步反应方案使用磺基-SMCC标记量子点。这种双功能交联剂包含一个可与伯胺反应的NHS酯基团和一个可与巯基反应的马来酰亚胺基团20。用于制备底物的巯基化寡核苷酸以氧化形式提供。在进行偶联反应前，必须按照所述方法对其进行还原和纯化，否则偶联反应效率会降低。DTT和磺基-SMCC溶液必须在使用前新鲜配制，因为这些分子在水溶液中会迅速水解。转移溶液进出透析装置时需格外小心——若移液器吸头接触膜，会导致膜破裂，造成样品丢失。建议连续完成第2节中的所有步骤，以避免样品损失。
用于生成量子点标记寡核苷酸的偶联反应效率较低。在将量子点标记的寡核苷酸与生物素化寡核苷酸混合并退火后，制备的底物样品中会存在过量未标记的DNA。尽管这些物质能够结合到功能化表面，但在推荐的成像条件下不可见，也不会对实验读数产生影响。为了验证完整结构的切割会导致量子点从表面释放，需按照方案第5节所述进行表面固定，并对表面的一个区域成像，以确定存在的量子点数量。随后，将800 µL含有10 U/mL DNase I的DNase缓冲液（2.5 mM Mg...

限制性内切核酸酶（REases）是一类能够在DNA中特异性序列位置引起双链断裂的酶。20世纪70年代限制性内切酶的发现推动了重组DNA技术的发展，如今这些酶已成为遗传修饰与操作中不可或缺的实验工具1。其中，II型限制性内切酶是该类酶中应用最广泛的一类，因其可在识别序列内部或附近特定位置切割DNA。然而，II型限制性内切酶之间存在显著差异，其分类主要依据特定的酶学特性，而非进化关系。在各个亚型中，分类体系常存在诸多例外情况，且许多酶可同时归属于多个亚型2。目前已鉴定出数千种II型限制性内切酶，其中数百种已实现商业化供应。
然而，尽管II型限制性内切酶具有多样性，但被深入研究的限制性内切酶却非常少。根据由理查德·罗伯茨爵士于1975年建立的限制性内切酶数据库REBASE3，目前仅有不到20种酶具有已发表的动力学数据。此外，虽然已有部分限制性内切酶在单分子水平上被直接观察到在扩散并沿DNA移动、直至遇到并结合其识别序列的过程4,5,6,7，但针对其切割反应动力学的单分子研究仍极为有限。现有研究要么未提供足够的统计学数据，无法对单个切割事件发生时间的变异进行详细分析8,9,10，要么无法完整捕捉切割时间的全部分布情况11。此类分析可揭示相对长寿命的动力学中间态的存在，并有助于更深入理解限制性内切酶介导的DNA切割机制。
在单分子水平上，生化过程具有随机性——某一过程发生所需的时间（即等待时间 τ）是可变的。然而，对大量 τ 的测量值预期会服从某种概率分布 p(τ)，该分布可反映所发生过程的类型。例如，一个单步过程（如产物分子从酶上释放）服从泊松统计规律，其 p(τ) 呈负指数分布形式：
<img alt="指数衰减的概率密度函数方程；公式：p(τ)=(1/β)e^(-τ/β)。" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1">
其中 β 为平均等待时间。注意，该过程的速率 k 等于 1/β，即平均等待时间的倒数。对于需要多个步骤的过程，p(τ) 将是各个单独步骤的单指数分布的卷积。当 N 个单指数衰减函数具有相同的平均等待时间 β 时，其卷积的通解为伽马概率分布：
<img alt="伽马概率分布；用于统计建模的方程；p(τ)=1/Γ(N)βⁿτⁿ⁻¹e⁻ᵗ/ᵦ。" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 2">
其中 Γ(N) 是伽马函数，用于描述对 N-1 的阶乘在 N 取非整数值时的插值。尽管当各个步骤的平均等待时间相近时，该通解可作为近似使用，但必须认识到，相对较快的步骤会被等待时间显著更长的步骤所掩盖。换句话说，N 的值代表了步骤数目的下限12。在获得足够数量的等待时间测量数据后，可通过将事件分箱并拟合伽马分布到所得直方图，或采用最大似然估计法，来估算参数 β 和 N。因此，此类分析能够揭示在整体实验中难以分辨的动力学步骤，但需要大量观测数据才能准确估计参数12,13。
本文介绍了一种利用量子点标记的DNA和全内反射荧光（TIRF）显微镜并行观测数百个限制性内切酶（REase）介导的DNA切割事件的方法。该实验设计使得多个实验的结果可以合并分析，从而生成包含数千个事件的停留时间分布图。量子点具有高光稳定性和高亮度，可在不牺牲对实验开始后数分钟内发生的切割事件观测能力的前提下，实现10 Hz的时间分辨率。良好的时间分辨率、宽动态范围以及获取大量数据集的能力，使得能够精确表征停留时间分布，揭示REase切割通路中存在的多个动力学步骤，这些REase的转换速率在每分钟1次（1 min-1）的范围内。以EcoRV为例，可分辨出三个动力学步骤，这些步骤均已通过其他方法得到确认，表明该检测方法能够灵敏地检测到此类动力学步骤的存在。
通过将带有生物素标记的寡核苷酸与一条互补链退火，形成包含目标识别序列的双链DNA底物，该互补链上共价连接有一个半导体纳米晶体量子点。这些底物被引入到构建在玻璃盖玻片表面的流动通道中，盖玻片表面共价固定有一层高分子量的聚乙二醇（PEG）分子。部分PEG分子的游离端带有生物素，可通过生物素-链霉亲和素-生物素连接方式捕获DNA底物。在全内反射荧光显微镜（TIRF）中，由玻璃-液体界面产生的指数衰减的隐逝波提供照明，其穿透深度约为所用光波长的数量级。在此条件下，只有通过被功能化玻璃表面捕获的DNA分子 tethered 在表面的量子点才会被激发。溶液中自由扩散的量子点无法被限制在照明区域内，因此不会发光。如果将量子点 tethered 至表面的DNA被切断，该量子点将可自由扩散离开表面，从而在荧光图像中消失。
尽管已知许多II型限制性内切酶（REases）在无镁离子的条件下也能结合DNA14，但所有这类酶均需镁离子介导DNA的切割反应15。这些限制性内切酶可在无镁离子条件下结合固定于表面的DNA。当含镁离子的缓冲液流经已预先结合REase的DNA通道时，切割反应立即开始，表现为量子点信号的消失。通过预先结合REase分子，再通过引入镁离子启动DNA切割，可实现反应的同步化，从而在实验所观察的酶分子群体中，独立测量每个分子完成DNA切割所需的滞后时间。在含镁缓冲液中加入荧光素作为示踪染料，用于指示镁离子进入视野的时间。由于含镁缓冲液中不含任何酶，因此从含镁缓冲液到达至每个量子点消失之间的滞后时间，反映了已结合在DNA上的REase完成DNA切割并使量子点从玻璃表面释放所需的时间。量子点的消失过程迅速，导致荧光强度轨迹出现急剧下降，从而清晰地标记出特定DNA分子被切割的时刻。事件发生时间通过数学方法分析强度轨迹确定，典型实验可获得数百个可识别的切割事件。多个实验的结果可合并分析，以获得足够的统计量，进而通过非线性最小二乘法或最大似然法估算参数N和β。

<table><tbody><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td>存放于干燥器中</td></tr><tr><td>5分钟环氧树脂胶</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td>用于密封微流控装置</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Pharmco</td><td>329000ACS</td><td>用于清洗盖玻片</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPXH Model 2800</td><td>目录号 15-337-410</td></tr><tr><td>玻璃烧杯，100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（分子量 5,000）</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-SVA-5K</td><td>琥珀酰亚胺戊酸酯的半衰期比琥珀酰亚胺碳酸酯更长</td></tr><tr><td>生物素化寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制——设计注意事项参见实验方案</td><td>要求进行5'端生物素修饰并采用HPLC纯化</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>VWR</td><td>0903-5G</td><td>配制10 mg/mL的水溶液，使用前加热至95 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Centri-Spin-10 尺寸排阻离心柱</td><td>Princeton Separations</td><td>CS-100 或 CS-101</td><td>用于还原二硫键后纯化巯基化寡核苷酸</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1英寸方形玻璃盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>金刚石刻划轮</td><td>Dremel</td><td>7134</td><td>用于在石英流动池盖板上钻孔</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td>无需称量形式，每瓶7.7 mg</td></tr><tr><td>台式钻床旋转工具工作台支架</td><td>Dremel</td><td>220-01</td><td>便于石英材料钻孔</td></tr><tr><td>EcoRV（用于生成示例数据的限制性内切酶）</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195T 或 R0195M</td><td>使用100,000单位/mL的储备液以避免添加过量甘油；查阅REBASE获取其他限制性内切酶供应商信息</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>多种品牌</td><td>CAS 64-17-5</td><td>变性乙醇或95%乙醇均可，用于清洗盖玻片</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>BioUltra级，无水，存放于干燥器中</td></tr><tr><td>Flea Micro Spinbar 搅拌子</td><td>Fisherbrand</td><td>14-513-65</td><td>尺寸为3 mm × 10 mm，可置于盖玻片架下方</td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Acros Organics</td><td>17324</td><td>用于配制实验缓冲液</td></tr><tr><td>重力对流烘箱</td><td>Binder</td><td>9010-0131</td><td></td></tr><tr><td>手持式多功能旋转工具</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>用于在石英流动池盖板上钻孔</td></tr><tr><td>ImagEM X2 EM-CCD 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-23B</td><td>本实验中空气冷却已足够，使用HCImage软件或类似软件进行控制</td></tr><tr><td>双面粘附成像垫片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带螺口盖的玻璃广口瓶（直径约50 mm，高约50 mm）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP214-500</td><td>用于配制含镁的实验缓冲液</td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td></td><td></td><td>数据分析</td></tr><tr><td>金属镊子</td><td>Fisher Brand</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（分子量 5,000）</td><td>Laysan Bio</td><td>M-SVA-5K</td><td>两种聚乙二醇应具有相同的NHS酯基团，以确保反应速率一致</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>多位置磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>12621-022</td><td></td></tr><tr><td>N-环己基-2-氨基乙磺酸 (CHES)</td><td>Acros Organics</td><td>AC20818</td><td>CAS 103-47-9，用于配制CHES缓冲液</td></tr><tr><td>适用于微量离心管的轨道摇床及加热装置</td><td>Q Instruments</td><td>1808-0506</td><td>配备1808-1061适配器，适用于24 × 2.0 mL或15 × 0.5 mL离心管</td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE60聚乙烯管（内径0.76 mm，外径1.22 mm）</td><td>Intramedic</td><td>6258917</td><td>22 G钝头针与此管径匹配良好</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) 10x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7059</td><td>使用时稀释至1x浓度</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9262</td><td>使用1 M溶液清洗盖玻片</td></tr><tr><td>Qdot 655 ITK 氨基（PEG）量子点</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>石英载玻片，1英寸方形，厚度1 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72250-10</td><td>需在四角钻孔以便插入进样和出样管路</td></tr><tr><td>增强型塑料镊子</td><td>Rubis</td><td>K35a</td><td>用于操作盖玻片及组装微流控装置</td></tr><tr><td>SecureSeal 粘附片</td><td>Grace Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td>裁剪后作为微流控装置的垫片</td></tr><tr><td>单通道微流控注射泵</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-1002X-US</td><td>配备50 mL注射器和22 G钝头针</td></tr><tr><td>Slide-a-Lyzer MINI 透析装置，10 kDa 截留分子量，0.1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570 或 69572</td><td>用于量子点与DNA偶联过程中的缓冲液置换</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0320</td><td>用于配制表面功能化缓冲液；100 mM，pH 8</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Macron</td><td>7581-12</td><td>用于配制实验缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠溶液（BioUltra级，水中0.5 M）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94046</td><td>用于配制100 mM磷酸钠缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠溶液（BioUltra级，水中5 M）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74092</td><td>用于调节100 mM磷酸钠缓冲液的pH值</td></tr><tr><td>链霉亲和素（来自 &lt;em&gt;Streptomyces avidinii&lt;/em&gt;）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4762</td><td>溶解至1 mg/mL，分装25 mL后于-20 ?保存</td></tr><tr><td>磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯 (sulfo-SMCC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39268</td><td>无需称量形式，每瓶2 mg</td></tr><tr><td>配备21 G钝头针的注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>巯基化寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制——设计注意事项参见实验方案</td><td>要求进行5'端硫醇修饰C6 S-S并采用HPLC纯化</td></tr><tr><td>配备488 nm激光照明的全内反射荧光（TIRF）成像系统</td><td>多种品牌</td><td></td><td>定制组装</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Research Products International</td><td>T60050</td><td>用于配制实验缓冲液</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>JT Baker</td><td>4101</td><td>用于配制实验缓冲液</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>用于配制封闭缓冲液</td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>10153-842</td><td></td></tr><tr><td>Wash-N-Dry 盖玻片架</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70366-16</td><td>用于盖玻片的表面功能化处理</td></tr></tbody></table>

限制性内切酶介导的dna切割单分子停留时间分析

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

本研究建立了一种基于全内反射荧光显微镜的新型检测方法，可在单次实验中同时测量数百个单个限制性内切酶（REase）分子催化循环的持续时间。该检测方法无需对蛋白质进行标记，且仅需使用单一成像通道即可完成。此外，多个独立实验的结果可合并分析，以获得数据点丰富的停留时间分布。对所得停留时间分布的分析有助于揭示无法直接观察到的动力学步骤，从而阐明DNA切割机制。利用该方法对已被广泛研究的限制性内切酶EcoRV（一种二聚体IIP型限制性内切酶，可切割回文序列GAT↓ATC，其中↓表示切割位点）进行检测所获得的示例数据与先前研究结果一致。这些结果表明，在EcoRV结合DNA后，通过引入镁离子启动DNA切割过程的反应路径中至少包含三个步骤，每个步骤的平均速率为0.17 s-1。

流动池直接连接至倒置显微镜上一个高数值孔径的60倍油浸物镜，该显微镜配备激光光源，用于通过物镜进行全内反射荧光（TIRF）成像（图5A）。在引入DNA底物并洗去多余的DNA和量子点后，视野中通常存在数千个单独的量子点（图5B）。这些量子点稳定地附着在玻璃表面，在实验时间尺度内不会出现明显的荧光减弱或显著的漂白现象。然而，若将含有镁离子和适当限制性内切酶（REase）的缓冲液流经流动通道，在典型的四分钟观察期结束时，实验开始时存在的量子点中至少有30%会从视野中消失。为验证镁离子的必要性，当在无镁离子条件下将限制性内切酶流经通道时，实验结束时仍可观察到95%以上的初始量子点（图5C）。然而，若先在无镁离子条件下使限制性内切酶结合到固定于表面的DNA上，随后立即引入含镁离子的缓冲液，则在观察期结束时，最多可有半数量子点消失（图5D），该结果与同时流经限制性内切酶和镁离子时所观察到的现象相似。具体反应事件的...

利用量子点标记的DNA和全内反射荧光显微镜，我们可以在使用未标记蛋白质的情况下研究限制性内切酶的反应机制。这种单分子技术能够大规模多重观测单个蛋白质-DNA相互作用，并可将数据汇总以生成具有充分统计量的停留时间分布。

限制性内切酶介导的DNA切割单分子停留时间分析

这种基于全内反射荧光显微镜的新型检测方法可实现对催化循环长度的同时测量，用于……

通过本方案，我们能够在单分子水平上直接观察限制性内切酶对特定位点DNA的切割过程。我们的多重化方法使我们能够测量数百个单个限制性内切酶完成催化循环所需的时间。多重化技术使我们能够获得分布充分的切割前停留时间数据，这些数据可通过伽马概率分布进行拟合，从而深入理解DNA切割的机制。为每种重悬的寡核苷酸准备一个新离心管，向每管中加入50 µL寡核苷酸和50 µL新配制的DTT溶液，用移液器吹打混匀，室温孵育30分钟。将每份样品混合物的全部液体轻柔地移入已准备好的层析柱中，在750 × g下离心2分钟。离心后，将不立即使用的样品置于20 °C保存，以防止巯基氧化及二硫键的形成。为每种待制备的构建体，用移液器吸取50微升量子点储备液至透析装置中，注意移液枪头勿接触膜。用至少为样品体积1,000倍的CHES缓冲液，在100 RPM搅拌条件下透析15分钟。使用移液器小心从透析装置中回收悬浮的量子点，并转移至含有等体积新鲜配制的Sulfo-SMCC溶液的新鲜离心管中，上下吹打混匀。室温下以 1,000 RPM 振荡孵育 1 小时，使 Sulfo-SMCC 与量子点上的伯胺发生反应。然后，使用移液器小心地将每个样品转移至新的透析装置中。为去除过量的 Sulfo-SMCC，加入至少为透析装置内体积 1,000 倍的 CHES 缓冲液，并在搅拌条件下透析 15 分钟。更换缓冲液两次，并用新鲜的 CHES 缓冲液总共透析三次，每次缓冲液更换后继续透析 15 分钟。然后使用 PBS 重复透析。使用移液器小心地从透析装置中回收含有量子点的溶液，并将每个样品转移至含有等摩尔量用 PBS 稀释的扩增寡核苷酸的新离心管中。在室温下以 1,000 RPM 振荡孵育 2 小时。向每个样品中加入 BSA，使其终浓度为 0.5 毫克/毫升。然后使用移液器将每个样品小心转移至新的透析装置中，并用储存缓冲液进行透析。透析后，小心回收每个样品，并将其放入新的离心管中。将样品储存在 4 摄氏度条件下。取一份量子点标记的寡核苷酸样品，与十倍摩尔过量的生物素化寡核苷酸混合。将混合物置于加热块中，加热至75摄氏度，并在此温度下保持5分钟。随后关闭加热块，使混合物缓慢冷却。将完成的构建物在4摄氏度下保存。使用装有锥形金刚石点轮钻头的手持式旋转多用工具，在石英载玻片的对角角落钻两个孔，作为进样口和出样口。务必固定好载玻片，钻孔时持续用水润滑钻头和载玻片。每次实验后，将使用过的装置浸泡在丙酮中以溶解粘合剂和环氧树脂，从而回收制备好的石英载玻片。丢弃其余组件。将25微升链霉亲和素溶液与80微升PBS和20微升封闭缓冲液混合。用该混合液包被经PEG处理的盖玻片，并在湿润环境中孵育30分钟。在盖玻片孵育期间，制备成像间隔片以构建流动通道。裁剪一块1英寸见方的成像间隔材料，然后标记出一条2毫米宽的通道，使其与石英载玻片上已钻孔的末端对齐。使用手术刀将通道从间隔材料中切割出来。用丙酮彻底清洗石英载玻片，以去除先前实验残留的任何粘合剂。从成像间隔片的一侧撕下背衬，小心地将其放置到石英载玻片上，注意不要覆盖进样口和出样口。用水清洗盖玻片，并用压缩空气吹干。撕下成像间隔片另一侧的背衬，使用塑料镊子将功能化链霉亲和素包被的盖玻片与石英载玻片夹住间隔片，压合组装件以排除粘合剂中的气泡。将管子末端斜向剪切，以确保溶液自由流动。然后将30厘米长的聚乙烯管插入石英片上的每个孔中。用试管架固定管子，再使用环氧树脂将管子密封固定，并密封组装装置的边缘。环氧树脂固化后，将空注射器上的钝头针插入装置的出口管，并将入口管末端浸入装有封闭缓冲液的容器中。回拉注射器活塞，使装置内充满封闭缓冲液。随后将装置放置，孵育至少30分钟后再使用。用胶带将微流控装置固定在显微镜载物台板上。使物镜与装置底部接触，并调整物镜位置，使视野位于微流控通道内。将出口管路连接至注射泵后，通过回拉注射器活塞，用新鲜的封闭缓冲液冲洗微流控通道。检查以确保管路或通道内无气泡残留。将1微升制备好的DNA底物加入1毫升封闭缓冲液中进行稀释。将进样管插入稀释后的DNA底物中，并以每分钟200微升的流速将800微升底物溶液注入通道。停止流动后，让DNA溶液在通道内孵育15分钟。孵育结束后，以每分钟200微升的流速向通道内至少注入800微升封闭缓冲液，以洗去未结合的DNA。调节显微镜焦距，使表面固定的量子点清晰可见。以每分钟 200 微升的流速，用 800 微升不含镁的实验缓冲液冲洗微流控装置。将限制性内切酶加入一份不含镁的实验缓冲液中，并通过移液轻轻混匀。以每分钟 200 微升的流速，将 800 微升浓度为每毫升 400 单位的 EcoRV 流经通道。以每分钟200微升的流速注入含有镁和荧光素的实验缓冲液，开始实验。启动注射泵后立即开始采集数据。缓冲液流过800微升后，停止数据采集。在将DNA底物引入流动池并洗去多余的DNA和量子点后，通常在视野中可观察到数千个单独的量子点。这些量子点稳定地附着在玻璃表面，在整个实验过程中不会出现明显的亮度下降或显著的漂白现象。当限制性内切酶（REase）在无镁离子条件下流经通道时，在观察期结束时仍可检测到实验开始时95%以上的量子点。然而，当在限制性内切酶作用后立即流加含镁缓冲液时，到观察期结束时，多达一半的量子点会消失，这与同时流加限制性内切酶和镁离子时观察到的现象类似。量子点的消失发生得非常迅速，并导致荧光强度轨迹急剧下降，从而清晰地指示出特定DNA分子被切割的时刻。本实验使用了已被广泛研究的II型P类限制性内切酶EcoRV进行。采用非线性最小二乘曲线拟合和最大似然参数估计两种方法从数据中提取 n 和 beta 的值。两种参数估计方法的结果一致。通过非线性最小二乘拟合，n 为 3.52，beta 为 5.78 秒。通过最大似然估计法，n 值为 3.41，beta 值为 6.06 秒。该检测方法可提供切割通路中存在中间步骤的证据。在不同反应条件下进行该检测有助于确定无法直接观察到的反应中间体的性质。

single-molecule-dwell-time-analysis-restriction-endonuclease-mediated

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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本方案介绍了一种基于荧光显微镜的单分子DNA复制检测方法，可实现实时观察DNA聚合酶与G-四链体结构等障碍物之间的相互作用。...

单分子荧光成像观察DNA聚合酶在G-四链体上的动态行为

了解限制性核酸内切酶介导的DNA切割的单分子停留时间分析方法。本研究利用量子点标记DNA和全内反射荧光显微镜技术，通过多重检测手段直接观察数百个REase的催化循环过程，生成详细的停留时间分布数据，为深入理解DNA切割机制提供重要依据。

限制性内切酶介导的DNA切割单分子停留时间分析

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