Name: 使用荧光标记肉瘤蛋白缩短多能干细胞衍生心肌细胞的肉瘤。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 了解使用荧光标记肉瘤蛋白评估多能干细胞衍生心肌细胞肉瘤缩短的方法。该技术可在体外可视化肉瘤功能，适用于患者来源诱导多能干细胞的心肌病治疗研究。

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我们谨向日本医科大学再生医学系的所有实验室成员致以诚挚感谢，感谢他们提供的有益讨论和技术支持。本研究得到了日本医疗研究开发机构（AMED；JP18bm0704012&#160;和 JP20bm0804018）、日本学术振兴会（JSPS；JP19KK0219）以及日本循环器学会（基础研究资助）向 H.U. 提供的资助。

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<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li>
<li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li>
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<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
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<li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).</li>
<li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).</li>
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<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
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</ol>

H.U. 已就本手稿提交了专利申请。

PSC-CMs 具有巨大的潜力，可作为&#160;体外平台用于模拟心脏疾病并测试药物的作用。然而，必须首先建立一种准确且统一的方法来评估 PSC-CMs 的功能。目前大多数功能检测方法均可应用于 PSC-CMs，例如电生理学、钙瞬变和代谢分析26，其中最早的一项基于患者来源的 PSC-CM 研究即针对长QT综合征27。然而，收缩力作为心肌细胞最重要的功能之一，仍难以准确评估。对于成年心肌细胞，通常广泛采用肌节缩短检测方法。相比之下，由于 PSC-CMs 的肌节发育不成熟且结构紊乱，标准的肌节缩短检测方法并不适用于这类细胞。因此，我们提出了一种替代方法，即利用荧光标记的肌节蛋白来检测 PSC-CMs 中的肌节缩短。如研究所示，可将定位于M线（MYOM2）或Z线（ACTN2、TCAP 和 PDLIM3）的蛋白与荧光蛋白融合，用于该方法。我们还证明，荧光标记蛋白可通过内源性位点或腺相关病毒（AAV）进行表达。相较于内源性位点，AAV 在表达荧光标记蛋白方面更具灵活性，因其可应用于任何类型的患者来源的 PSC-CMs。相反，通过内源...

心血管疾病是全球范围内导致死亡的首要原因1 心肌病是心脏相关死亡的第三大原因2心肌病是一类影响心肌的疾病总称。近年来，诱导性多能干细胞（iPS细胞）的发展以及将iPS细胞定向分化为心肌细胞（PSC-CMs）的技术进步，为利用患者基因组研究心肌细胞开辟了新途径 体外 心肌病模型。这些细胞可用于理解心脏疾病的病理生理学，阐明其分子机制，并测试不同的治疗候选药物。3因此，人们对此产生了极大的兴趣，已生成了患者来源的诱导多能干细胞（例如，肥厚型心肌病 [HCM]）4,5致心律失常性右室心肌病 [ARVC]6扩张型心肌病 [DCM]7以及线粒体相关性心肌病8,9由于心肌病的特征之一是肌节功能障碍和结构破坏，因此需要一种能够均匀测量肌节功能的有效工具。
肌节缩短是评估来自动物模型和人类的成年心肌细胞中肌节功能及收缩力最常用的技术。进行肌节缩短实验需要具有清晰可见的、在相差显微镜下可观察到的良好发育肌节结构。然而，培养的PSC-CMs 体外 表现出发育不全且结构紊乱的肌节，因此无法用于准确测量肌节缩短10这种难以准确评估PSC-CMs收缩力的问题，限制了其作为心脏功能评估平台的应用。 体外为间接评估PSC-CMs的收缩力，已采用原子力显微镜、微柱阵列、牵引力显微镜以及阻抗测量技术来检测这些细胞运动对其周围环境产生的影响11,12,13更复杂且侵入性更小的活细胞运动视频显微记录技术（例如 SONY 的 SI8000）可用于间接评估细胞收缩性，但该方法无法直接测量肌节运动或力生成动力学14.
为了直接测量PSC-CMs中的肌节运动，一些新方法正在出现，例如对肌节蛋白进行荧光标记。例如，Lifeact可用于标记丝状肌动蛋白（F-actin）以测量肌节运动15,16。另一种选择是使用经基因修饰的iPS细胞，通过荧光蛋白标记肌节蛋白（如α-肌动蛋白结合蛋白[ACTN2]和肌小节蛋白-2[MYOM2]）17,18,19。
本文中，我们描述了如何利用Myom2-TagRFP（小鼠胚胎干细胞[ES细胞]）和ACTN2-mCherry（人诱导多能干细胞）进行时间延时成像，以测量肌节缩短。我们还展示了图案化培养有助于肌节的排列。此外，我们介绍了一种使用腺相关病毒（AAV）标记肌节的替代方法，该方法可广泛应用于患者来源的诱导多能干细胞。

<table><tbody><tr><td>1-巯基甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（55 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱（MPC）聚合物，</td><td>NOF Corp.</td><td>LIPIDURE-CM5206</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>富士胶片和光</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>带聚合物盖玻片的35 mm成像培养皿（&amp;micro;- 培养皿（35 mm，高）</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>AAVproR 无辅助系统（AAV6）&lt;br/&gt; （载体；pHelper、pRC6、pAAV-CMV-载体）</td><td>Takara</td><td>6651</td><td></td></tr><tr><td>ACTN2-mCherry（AR12，AR21）hiPSCs</td><td>N.A.</td><td></td><td>我们在610B1 hiPSC细胞系中，将IRES-嘌呤霉素抗性盒插入TNNT2基因座的3'非翻译区，并在ACTN2终止密码子附近插入mCherry，具体方法参照 elsewhere（Anzai, Methods Mol Biol, in press）所述</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（50倍浓缩，无血清）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含胰岛素）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂（50倍浓度），不含维生素A</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase（25 U/&amp;micro;L)</td><td>默克密理博</td><td>70746</td><td></td></tr><tr><td>盐酸博莱霉素 S</td><td>富士胶片和光</td><td>029-18701</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4，人，重组</td><td>R&amp;amp;D Systems, Inc.</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-100g</td><td></td></tr><tr><td>C59，Wnt 拮抗剂（WntC59）</td><td>abcam</td><td>ab142216</td><td></td></tr><tr><td>CAD 绘图软件，</td><td>Robert McNeel and Associates, WA, 美国</td><td>Rhinoceros 6.0</td><td></td></tr><tr><td>超滤离心单元（100 k MWCO），Vivaspin-20</td><td>赛多利斯</td><td>VS2042</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>铬蚀刻剂</td><td>日本化学产业株式会社，日本</td><td>N14B</td><td></td></tr><tr><td>涂覆AZP1350的铬掩模</td><td>日本 Clean Surface Technology 公司</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE 沉淀载体（20 mg/mL 甘油，3 M 醋酸钠（pH 5.2））</td><td>Takara</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）- 高糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）— 高糖，不含丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（99.5）</td><td>富士胶片和光</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Moregate</td><td>59301104</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10，人源，重组</td><td>R&amp;amp;D Systems, Inc.</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子，人，重组</td><td>富士胶片和光</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100g</td><td></td></tr><tr><td>格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154-500</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P24G-1.5-13-F/H</td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-062</td><td></td></tr><tr><td>Iscove改良型Dulbecco培养基（IMDM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12440-061</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMAX 补充剂，200 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-抗坏血酸钠盐</td><td>富士胶片和光</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白-511 E8 片段（LN511-E8，iMatrix-511）</td><td>Nippi</td><td>892012</td><td></td></tr><tr><td>掩模对准器</td><td>日本Union Optical Co., Ltd.</td><td>PEM-800</td><td></td></tr><tr><td>无掩模光刻工具</td><td>NanoSystem Solutions, Inc.，日本</td><td>D-Light DL-1000</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV 注射器滤器单元，0.45 &amp;micro;微米，PVDF（0.45-&amp;micro;m 滤光片</td><td>默克密理博</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Myom2-RFP（SMM18）</td><td>N.A.</td><td></td><td>在我们之前的研究论文中开发（Chanthra, Sci Rep, 2020）</td></tr><tr><td>N-2 Supplement（100倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 数字CMOS相机</td><td>滨松</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006-10</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sansei Medical Co. Ltd</td><td>01-004</td><td></td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体</td><td>美国密歇根州陶氏康宁公司</td><td>SILPOT 184</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺 MAX（分子量 40,000）</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>正性光刻胶显影液</td><td>东京应化工业株式会社，日本</td><td>NMD-3</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Takara</td><td>9034</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>富士胶片和光</td><td>166-23153</td><td></td></tr><tr><td>重组人/小鼠/大鼠 Activin A 蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems, Inc.</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>重组类胰蛋白酶（rTrypsin；TrypLE express）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>日本松崎制作所有限公司</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>旋转涂布机</td><td>Mikasa Co., Ltd.，日本</td><td>MS-A100</td><td></td></tr><tr><td>旋转共聚焦显微镜</td><td>Oxford Instruments</td><td>Andor Dragonfly 旋转盘系统</td><td></td></tr><tr><td>StemSure LIF，小鼠，重组，溶液（10^6U）</td><td>富士胶片和光</td><td>195-16053</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3010</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc.，马萨诸塞州，美国</td><td>SU-8 3010</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc.，马萨诸塞州，美国</td><td>SU-8 显影液</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td></td></tr><tr><td>血管内皮生长因子-A165（VEGF），人，重组</td><td>富士胶片和光</td><td>226-01781</td><td></td></tr></tbody></table>

利用荧光标记的肌节蛋白检测多能干细胞来源心肌细胞的肌节缩短

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

多能干细胞来源的心肌细胞（PSC-CMs）可由胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（ES/iPS细胞）分化获得。这些细胞为心脏疾病建模提供了极具前景的细胞来源。在心肌病研究中，肌节缩短是评估成年心肌细胞疾病表型的标准生理学检测指标之一。然而，现有的方法并不适用于评估PSC-CMs的收缩功能，因为这些细胞的肌节发育尚不成熟，在相差显微镜下无法观察到。为解决这一问题并实现对PSC-CMs的肌节缩短分析，本研究采用了荧光标记的肌节蛋白结合活细胞成像技术。肌节两端为细小的Z线，中心为M线。Z线蛋白——α-辅肌动蛋白（ACTN2）、连接蛋白（TCAP）和肌动蛋白相关LIM蛋白（PDLIM3）——以及一种M线蛋白——肌球蛋白结合蛋白-2（Myom2）——均被标记上荧光蛋白。这些标记蛋白可通过基因敲入方式在内源等位基因位点表达，也可通过腺相关病毒（AAVs）进行外源表达。本文介绍了将小鼠和人类多能干细胞分化为心肌细胞、制备腺相关病毒（AAVs）、实施并分析活细胞成像的实验方法。此外，还描述了制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）印模的方法，用于实现PSC-CMs的图案化培养，从而促进带有荧光标记蛋白的肌节缩短分析。为评估肌节缩短情况，在电刺激（0.5–1 Hz）条件下，以高帧率（每秒50–100帧）记录跳动细胞的时间序列图像。为分析细胞收缩过程中肌节长度的变化，将所记录的时间序列图像导入SarcOptiM插件（ImageJ/Fiji平台）进行分析。本策略为研究PSC-CMs中的心脏疾病表型提供了一个简便的实验平台。

利用基因敲入的PSC-CMs报告细胞系测量肌节缩短。 使用标记了肌节的PSC-CMs来测量肌节缩短。这些细胞系在内源性位点表达Myom2-RFP和ACTN2-mCherry。TagRFP被插入到Myom2基因中，该基因编码定位于M线的M蛋白；而mCherry则被敲入到ACTN2基因中，该基因编码定位于Z线的α-辅肌动蛋白18,25。通过获取并分析延时图像来确定肌节缩短，结果如图1、图2以及视频1-3所示。
为了克服PSC-CMs中肌节排列紊乱的问题，使用特定的PDMS印章将PSC-CMs以条带模式进行培养。与非图案区域培养的细胞相比，这种图案化培养促进了细胞形态的伸长...

该方法可用于利用带有荧光标记的肌节蛋白的多能干细胞衍生心肌细胞，检测肌节缩短。

由多能干细胞衍生的心肌细胞（PSC-CMs）可来源于胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（ES/iPS细胞）。这些细胞……

由于多能干细胞来源的心肌细胞中肌节发育不成熟且结构紊乱，因此很难评估其肌节功能。通过使用荧光标记的肌节蛋白，我们现在能够检测肌节的缩短情况。利用干细胞来源的心肌细胞和荧光标记的肌节蛋白，我们可以在体外对肌节进行可视化并评估其功能。利用基于 AAV 的转导技术，我们可以将该方法拓展至任何患者来源的诱导性多能干细胞。该方法还可进一步应用于心肌病治疗的开发，因为它可用于在体外直接评估与疾病相关的肌节功能障碍。该方法在心脏病学领域具有重要应用价值，包括小儿心脏病学研究。然而，该方法也可应用于骨骼肌功能障碍（如肌病）的研究。在诱导分化前第4天，用PBS稀释的层粘连蛋白-511 E8片段以每平方厘米0.5微克的浓度包被六孔板，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。接近孵育结束时，在37摄氏度下用重组胰蛋白酶处理人诱导性多能干细胞3分钟。待细胞脱落后，将细胞收集至含有10% FBS的培养基中用于计数，经离心后，将细胞重悬于含有层粘连蛋白-511 E8和ROCK抑制剂的AK02N培养基中，接种密度为每2毫升含1.25 × 10⁵个细胞。接着，吸除六孔板各孔中的包被液，每孔接种2毫升细胞悬液。将培养板放回细胞培养孵箱中继续培养。培养四天后，细胞达到约80%融合度。每孔加入两毫升含GSK-3抑制剂的RPMI加B27（不含胰岛素）培养基，替换原有上清液，以诱导细胞分化。分化两天后，轻轻更换培养基，每孔加入两毫升含porcupine抑制剂的RPMI加B27（不含胰岛素）培养基。细胞应已达到100%融合度。在分化第四天，轻轻将上清液更换为每孔2毫升含B27但不含胰岛素的RPMI培养基。细胞应保持高密度状态，部分细胞可能已开始漂浮。在分化第7天和第9天，将每孔中的上清液更换为2毫升含胰岛素的RPMI加B27培养基，并补充嘌呤霉素，用于选择性培养多能干细胞来源的心肌细胞。此时，应在培养物中观察到搏动的细胞。为建立图案化多能干细胞来源的心肌细胞培养体系，首先使用修补胶带清除定制PDMS印章表面的灰尘，然后将印章短暂浸入70%乙醇中。使用气吹清除印章表面的乙醇，并用5至10微升0.5% MPC聚合物乙醇溶液处理表面。待聚合物完全干燥后，将印章置于35毫米成像培养皿中的聚合物盖玻片上，并在印章上放置一个重物。10分钟后，使用光学显微镜确认图案已成功转移至盖玻片上，随后用PBS洗涤培养皿和盖玻片两次。第二次洗涤后，在室温下用0.1%明胶稀释的每平方厘米0.5至1微克层粘连蛋白-511 E8处理盖玻片，孵育2至4小时。分化第10天，用PBS洗涤细胞两次，随后每孔加入1毫升重组胰蛋白酶，在37摄氏度处理3至5分钟。计数后，将细胞重悬于RPMI加B27（含胰岛素）培养基中，细胞密度为每毫升2.5×10⁵至5×10⁵个细胞，并补充嘌呤霉素至相应浓度，每孔接种1毫升细胞，于37摄氏度过夜孵育。次日早晨，将上清液更换为新鲜的含胰岛素的RPMI加B27培养基，并补充嘌呤霉素，然后将细胞放回细胞培养孵箱中，每周更换培养基两到三次，持续至第21至28天进行成像。为对PCCSM培养物中的肌节缩短进行延时成像，需在荧光共聚焦显微镜的100倍物镜上滴加镜油，并在配套软件中选择活细胞成像条件。为获得具有良好代表性的数据，应选择最高的帧率，设置快门常开，并在采集区域的裁剪范围内应用4×4像素合并，以在延时成像过程中实现图像间的最短时间间隔。如果细胞搏动频率较低，可通过电场刺激激发细胞，然后开始延时成像记录，并注意保持成像视野在整个成像过程中始终处于焦点。成像结束后，将延时图像保存至适当的文件夹中。为分析延时图像，将一系列延时图像导入ImageJ软件，并调节图像的亮度和对比度，直至肌节结构清晰可见。在“更多工具”菜单中选择 SarcOptiM，然后按 Control Shift P 并点击工具栏上的 1 微米按钮，按照说明校准程序。接着在待测肌节缩短区域上画一条线，点击“单细胞 AVI”以开始肌节缩短分析。通过时间推移成像技术，可对标记了肌节的、经图案化培养的多能干细胞来源心肌细胞在不同时间点的肌节缩短进行测量。为克服在图案化多能干细胞来源的心肌细胞培养中通常观察到的肌节紊乱现象，可使用特定的PDMS印章将多能干细胞来源的心肌细胞以条带状图案进行培养，这能促进细胞呈现细长形态，并使肌节排列比在非图案化区域培养的细胞更加有序。与非图案化培养的细胞相比，图案化培养还能促进更好的细胞收缩，并提供更平滑的肌节长度分布。经AAV转导的图案化多能干细胞来源的心肌细胞在转导后三天即可沿细胞呈现肌节GFP信号，也可用于测量肌节收缩曲线。此外，在转导过程中加入杀稻瘟菌素抗性基因，也可用于实现图案化多能干细胞来源心肌细胞的筛选，纯度可超过90%。为了便于进行更简便且高质量的图像分析，必须识别出具有线性运动肌节的区域，并以最高帧率获取图像。利用该方法，我们可评估成熟度在肌节蛋白中的作用，从而研究由疾病特异性患者来源的iPS细胞所衍生的心肌细胞中肌节功能障碍。

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使用荧光标记肉瘤蛋白缩短多能干细胞衍生心肌细胞的肉瘤。

成年心肌细胞是从动物心脏中分离并可培养数天的原代细胞。在此培养期间，可利用腺病毒基因转导表达基因编码的生物传感器（GEBs）或荧光融合蛋白。这两种方法均可通过共聚焦显微镜进行细胞水平的研究。...

成年心肌细胞的分离与遗传操作用于共聚焦成像

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

导致先天性心脏缺陷的突变需要在发育过程中对心脏结构进行体内研究，但在小鼠胚胎心脏中开展高分辨率的结构研究在技术上具有挑战性。本文介绍了一种可靠的免疫荧光与图像分析方法，用于评估发育中小鼠心脏中心肌细胞特异性结构。...

小鼠胚胎心脏中心肌细胞发育的免疫荧光分析

为了区分心肌细胞的细胞分裂与细胞周期变化，我们提供了使用两种转基因小鼠品系的实验方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；以及 CAG-eGFP-anillin...

出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。...

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用。本文介绍了一种利用钙成像系统评估心肌细胞肌浆网Ca2+储备能力及舒张期钙离子清除功能的实验方案。...

离体心室心肌细胞肌浆网钙储备及细胞内舒张期钙清除的评估

本文介绍一种光学成像技术，用于特异性检测心室样诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中的动作电位。该方法基于启动子驱动的电压敏感型荧光蛋白表达。...

人诱导性多能干细胞来源的心室样心肌细胞中亚型特异性光学动作电位记录

形成正确的肌节网络对于诱导多能干细胞来源的心肌细胞的成熟至关重要。我们提出了一种基于超分辨率成像的方法，可对干细胞来源心肌细胞的结构成熟度进行定量评估，从而优化促进心脏发育的培养条件。...

利用单分子定位显微镜分析人iPSC来源心肌细胞中的α-肌动蛋白结合蛋白网络

本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

了解使用荧光标记肉瘤蛋白评估多能干细胞衍生心肌细胞肉瘤缩短的方法。该技术可在体外可视化肉瘤功能，适用于患者来源诱导多能干细胞的心肌病治疗研究。

利用荧光标记的肌节蛋白检测多能干细胞来源心肌细胞的肌节缩短

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