利用GAL4-UAS系统在Anopheles gambiae中进行功能遗传学研究

双组分GAL4-UAS系统是一种多功能工具，可通过时空可控的方式对冈比亚按蚊中的基因表达进行遗传修饰，从而实现功能基因组学分析。该二元系统在转基因表达的表型鉴定实验设计中具有灵活性，即使存在严重的适合度代价也能应用。该系统可用于鉴定可能参与杀虫剂抗性、病原体传播相关基因的表型特征，或用于基因控制策略中的基因功能研究。

Fraser Coleman，一名研究技术员，将协助演示该实验步骤。首先，使用剪去末端的三毫升塑料巴斯德吸管，将蛹收集到一个透明的平底培养皿中，该培养皿适用于体视显微镜观察。小心移除蛹周围的大部分水分。打开荧光灯并预热。

在筛选荧光标记时，需考虑不同表型的表达及比值所预期产生的颜色时空分布模式。在荧光体视显微镜上选择所需的滤光片，并检查是否有可见的彩色光束照射到载物台板的中心位置。在白光下，将蛹置于视野中央，并调节至清晰对焦。

关闭白光，使用细调焦旋钮对携带目标表型且具有可见荧光模式的蛹进行对焦。用精细的细节画笔轻轻翻转蛹体，并移动肛鳍，以便识别外部生殖器。根据外部生殖器的显著特征对蛹进行分类。

雄性具有一根从最后一节背段伸出的长管，其长度约为肛门桨状结构的一半。雌性蛹的外生殖器明显较短且呈分叉状。将已区分性别的蛹按每组10只或更少的数量分装至透明的20毫升试管中，并加入水，用一团脱脂棉密封试管。

从试管中吸取所需数量的雄性和雌性成虫至饲养笼或小桶中，注意在此过程中避免损伤成虫。交配后维持培养5至7天，然后进行血液饲喂。次日可收集卵以研究胚胎发育。

组装产卵室，并小心地将10至15只吸血后的雌蚊引入其中。盖上产卵室，静置20分钟。小心地将50毫升聚丙烯管从产卵罐上取下，注意不要让蚊子逸出。

盖上锅盖，使卵发育至目标发育阶段。使用精细的细节画笔从锅中拾取卵，并将其放置在40平方毫米的凹槽玻璃块的水中。用微量移液器小心吸除玻璃块中的水，并加入500微升FAA固定液覆盖卵。

在室温下于摇床上轻轻振荡30分钟。用蒸馏水彻底冲洗卵子15次，以去除FAA溶液的所有残留。使用1000微升移液器，每次加入并移除1毫升蒸馏水，操作时注意不要损伤卵子。

用一毫升 Trpis 溶液覆盖固定的卵，在室温下孵育 30 分钟。孵育 5 分钟后，卵将开始出现浅色斑块，最终变得完全透明，呈乳白色。用蒸馏水彻底冲洗卵 15 次，以去除所有 Trpis 溶液的残留。

在冈比亚按蚊蛹的眼部和腹神经节中可观察到由3xP3启动子驱动的荧光标记表达。使用不同颜色的荧光标记可便于筛选和鉴定携带不同GAL4和UAS组分的基因修饰个体。在使用双组分GAL4-UAS系统时，必须将来自不同品系的雄性和雌性个体进行杂交，以获得同时携带GAL4和UAS组分的子代。

通过观察蛹期雌雄外生殖器的形态差异来进行性别鉴定。此处展示了一个无法辨别的蛹样例。如右侧所示，当蛹体内水分完全脱除后，肛叶会遮挡生殖器，增加性别鉴定的难度。

双组分GAL4-UAS系统能够以受控的时空方式调控基因表达。通过将表达GAL4的脂肪细胞特异性及泛表达驱动品系与报告基因UAS-mCherry品系杂交，可实现对该过程的可视化观察。使用双组分GAL4-UAS系统的一个重要优势在于，即使在胚胎阶段，也能方便地研究致死性表型。

为此，有必要对胚胎的内部形态进行观察。在完成胚胎透明化实验流程后，可观察到胚胎发育不同阶段（产卵后12、24和36小时）的正常形态学特征。在整个操作过程中，必须防止蛹和卵发生干燥。

因此，去除液体时必须迅速操作。GAL4-UAS 方法使我们能够对参与杀虫剂抗性的基因以及在基因驱动控制方法中具有潜在应用价值的基因进行功能表征。