Name: 使用GAL4-UAS系统在冈比亚按蚊的功能遗传学中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学习使用GAL4-UAS系统在冈比亚按蚊中进行功能遗传学研究，通过时空特异性基因表达控制实现表型分析。该方法支持杀虫剂抗性和遗传控制策略相关基因的功能表征。

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我们衷心感谢LSTM和IVCC（Adriana Adolfi）、BBSRC（新研究者奖，AL）、MRC（BCP博士生奖学金：MR/P016197/1）以及Wellcome（Sir Henry Wellcome博士后奖学金，LG：215894/Z/19/Z）提供的资助，这些资助项目均在提案中纳入了Gal4UAS分析。

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<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+validation+of+key+genes+conferring+insecticide+resistance+in+the+major+African+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

了解蚊子基因功能对于开发控制&#160;Anopheles&#160;并影响疟疾传播的新方法至关重要。本文所述的GAL4-UAS系统是一种多功能且强大的候选基因功能分析工具，迄今为止，我们已利用该系统研究了杀虫剂抗性的遗传基础17&#160;以及表皮碳氢化合物的产生15,23，同时还实现了对不同蚊子细胞群体的荧光标记8。目前，响应子构建体主要通过限制性内切酶克隆方法插入含有多个克隆位点的质粒中，该位点位于UAS下游（图1、表1）。然而，由于这些构建体具有模块化特征，包含多个元件（attB位点、&#160;3xP3-YFP和gypsy绝缘子序列），因此可采用更为现代的技术来构建新的响应子质粒。通常，过表达序列可通过PCR从cDNA或gDNA中扩增获得，但商业合成有时可减少构建新载体所需的人力和时间。在...

双组分GAL4-UAS系统是昆虫模式生物Drosophila melanogaster1,2,3中基因功能鉴定的主要工具。使用GAL4-UAS系统时，将携带酵母转录因子GAL4的转基因驱动品系（其表达受特定调控序列控制）与响应品系（携带由GAL4识别的上游激活序列（UAS）控制的目的基因或RNA干扰（RNAi）构建体）进行杂交。该杂交后代中，目的转基因的表达模式由驱动GAL4表达的启动子决定，呈现特定的时空表达特征（图1）。通过分析驱动品系与响应品系杂交后代所表现出的表型，可揭示候选基因的功能。尽管D. melanogaster已被用于研究其他生物的基因4,5,6,7，但目前GAL4-UAS系统已拓展应用于具有医学和农业重要性的其他昆虫物种，以实现对目标物种的直接功能分析8,9,10,11,12,13,14。
在非洲疟疾按蚊Anopheles gambiae中，GAL4-UAS系统最初通过细胞系共转染实验进行了测试9。研究人员对多种构建体在不同成对组合中的效率进行了检测，发现当与一系列GAL4驱动子联合使用时，含有14个串联重复UAS并添加一个小的人工内含子（UAS-14i）的构建体表现出最广泛的激活潜力。为验证该系统在体内的功能，随后利用PiggyBac转化技术8构建了两个独立的转基因An. gambiae品系：一个驱动品系，其GAL4由中肠特异性启动子驱动；另一个响应品系，其萤光素酶和增强型黄色荧光蛋白（eYFP）基因均受UAS序列调控。子代中肠特异性的萤光素酶活性和荧光信号表明，该系统在Anopheles中具有高效性。此后，研究人员已构建出在其他与媒介能力及杀虫剂抗性相关的重要组织中表达转基因的驱动品系，包括oenocytes15和血细胞16，以及接近泛组织表达的品系10。同时，还构建了大量UAS响应品系，用于检测参与代谢与隔离介导的杀虫剂抗性、表皮碳氢化合物合成的基因，并对不同细胞和组织类型进行荧光标记（表1）。对于响应品系，目前通过ΦC31介导的重组盒交换技术实现转基因的定点整合17,18，以固定UAS调控基因的基因组环境。该方法可消除基因组插入位点对表达水平的影响，从而更准确地比较不同候选基因的表型效应。
目前已创建的响应品系旨在通过RNA干扰（RNAi）实现外源基因的高水平表达或降低特定基因的表达。 通常将cDNA克隆与UAS序列融合以构建合适的表达质粒，但若全基因组序列长度适合克隆，也可使用。为构建沉默结构，我们采用了三种不同方法获得可形成发夹双链RNA（dsRNA）并诱导RNAi的串联反向序列，包括融合PCR、不对称PCR以及发夹结构的商业合成。这些方法的共同点是在反向重复序列之间插入一段内含子序列，以提高克隆的稳定性。现已开发出可插入目的基因或RNAi结构的响应质粒15。这些质粒还含有进行RMCE所必需的ΦC31 attB位点（详见Adolfi在JoVE上发表的配套论文，该论文详细描述了RMCE技术）。本文包含了在选择用于过表达的插入序列时所需关键步骤的操作方案。此外，还描述并图示了两种构建RNAi发夹结构的实验方案。
在创建新品系时，鉴定稀有的转基因个体至关重要，这是建立和维持转基因品系的基础。对于GAL4-UAS系统而言，最关键的是要能够区分应答子（responder）和驱动子（driver）品系，以便设计杂交实验，并鉴定出同时携带两种转基因的后代个体。这一目标通过在驱动子和应答子载体上连接不同的显性可筛选标记基因来实现。最常用的是荧光标记基因，它们可通过光学滤光片清晰区分（例如 eYFP、eCFP、dsRed）。标记基因的表达需具有已知且稳定的时空模式，这有助于更容易地识别异常情况和污染。荧光标记基因的表达通常由合成的3xP3启动子调控，该启动子在An. gambiae发育的各个阶段均特异性地驱动眼部和腹神经节的表达19。本文所描述的所有转化质粒均包含由3xP3调控的荧光标记基因。此处提供了一套详细的实验方案，用于筛选荧光标记的An. gambiae蛹期GAL4-UAS品系。
GAL4-UAS 系统的一个关键要素是必须将带有不同标记的驱动系和响应系进行杂交。为此，在交配前需将各品系的雄性和雌性个体分开。成虫可通过外观轻易区分，但在建立遗传杂交时，为确保交配尚未发生，宜在成虫羽化前即进行性别分离。雄性和雌性之间普遍存在体型差异 An. gambiae 蛹的形态变异过大，无法作为高效且可靠的性别鉴定方法20. 相反，外生殖器存在明显的形态学差异，可作为性别鉴定的可靠依据 An. gambiae. 本文中，我们描述了一种可靠的性别鉴定方法 An. gambiae 蛹以建立适当的杂交组合。
<img alt="利用RNAi发夹结构、克隆、杂交及昆虫模型中表型分析的基因编辑过程示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62131/62131fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1 —在冈比亚按蚊中使用双组分GAL4-UAS系统流程的示意图。（A）展示了一个示例载体（pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]）的主要组成部分，详细标明了多克隆位点内可用于插入目标基因发夹结构或编码序列的限制性酶切位点（EcoRI、NheI、XhoI 和 NcoI）。图中还展示了整合位点品系的结构。（B）展示了杂交步骤，使用驱动品系的雄性个体（携带由目标启动子驱动的GAL4以及由3xP3启动子驱动的eCFP）与响应品系的雌性个体（携带由UAS启动子控制的目标基因或发夹结构，以及由3xP3启动子控制的eYFP标记）进行交配。（C）图示说明了在B步骤杂交后代中，GAL4驱动目标基因表达的情况，以及部分常规检测的表型列表。缩写：多克隆位点（MCS）、重组酶介导的盒式交换（RMCE）、上游激活序列（UAS）、增强型黄色荧光蛋白（eYFP）、增强型青色荧光蛋白（eCFP）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62131/62131fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
正是杂交的使用赋予了GAL4-UAS系统双组分的特性，使其相较于更为线性的方法具有显著优势。例如，通过该系统可评估的驱动系与响应系组合数量远超每种启动子/基因组合均需独立构建并维持一个转基因品系的线性方法所能实现的范围。更重要的是，该系统使得研究人员能够分析那些在表达受到干扰时导致致死或不育表型的基因，而这类基因在线性系统中难以构建和维持。此类致死表型可能在发育的各个阶段出现，具体取决于基因功能及其时空表达模式，但最常在胚胎发育期间被观察到。要观察蚊子胚胎的发育过程，需去除覆盖在卵表面的不透明卵壳。我们参照Trpiš（1970）21和Kaiser等（2014）22所描述的方法，介绍了我们在保持胚胎结构完整性的前提下进行固定以及漂白以去除内卵壳、从而实现显微观察与成像的实验方案。

<table><tbody><tr><td>100 x 15 mm 塑料培养皿</td><td>SLS</td><td>2175546</td><td>每包 10 个</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L Gilson 移液器</td><td>Gilson</td><td>F144059P</td><td></td></tr><tr><td>20/25 mL 通用管</td><td>Starlab</td><td>E1412-3020</td><td>每包 400 个</td></tr><tr><td>3 mL 巴斯德吸管</td><td>SLS</td><td>G612398</td><td>Greiner 3 mL 无菌独立包装巴斯德吸管</td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>11512303</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>SLS</td><td>45726-1L-F</td><td>1 L</td></tr><tr><td>饲养笼</td><td>SLS</td><td>E6099</td><td>30x30x30 带筛网接口</td></tr><tr><td>细毛画笔</td><td>Amazon</td><td>UKDPB66</td><td>KOLAMOON 9 件套细节绘画笔套装，适用于水彩、丙烯、油画（酒红色）</td></tr><tr><td>鱼食</td><td>Amazon</td><td></td><td>Tetra Min 鱼食，适用于所有热带鱼的全面营养食品，促进健康、体色和活力，10 L&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>口吸管</td><td>John Hock</td><td>612</td><td></td></tr><tr><td>池塘盐</td><td>Amazon</td><td></td><td>Blagdon Guardian 池塘保健盐，用于鱼类健康、水质调节、通用补剂、pH 缓冲，9.08 kg，可处理 9,092 L 水量&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蛹盒</td><td>Cater4you</td><td>SP8OZ</td><td>250 个带盖蛹盒</td></tr><tr><td>小型塑料桶</td><td>Amazon</td><td></td><td>2.5 L 白色塑料桶，配白色盖（每包 10 个）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25552</td><td></td></tr></tbody></table>

利用gal4-uas系统在anopheles gambiae中进行功能遗传学研究

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

双组分 GAL4-UAS 系统是一种多功能且强大的功能遗传学分析工具。该系统的核心在于将转基因“驱动”品系与转基因“响应”品系进行杂交：驱动品系以组织特异性方式表达酵母转录因子 GAL4，而响应品系携带一个候选基因或 RNA 干扰结构，其表达受上游激活序列（UAS）控制，而 UAS 可与 GAL4 结合。在杂交后代中，目标基因或基因沉默结构便按照预设的时空模式表达，从而可对所产生的表型进行检测，并据此推断基因功能。该双元系统使实验设计具有高度灵活性，能够在多种组织特异性表达模式下筛选转基因表达所引发的表型，即使这些表型伴随严重的适合度代价亦可进行。我们已将此系统应用于非洲主要疟疾传播媒介——Anopheles gambiae。
本文介绍了一些在 GAL4-UAS 分析过程中常用的实验方法。我们描述了已建立的冈比亚按蚊（An. gambiae）GAL4-UAS 品系，以及用于基因上调和 RNAi 沉默的新效应子载体的克隆方法。我们提供了按蚊蛹期性别鉴定的逐步操作指南，以建立遗传杂交，并包括对后代进行筛选，以追踪标记驱动子和效应子插入的荧光基因标记的遗传情况。此外，我们还介绍了一种用于透明化冈比亚按蚊（An. gambiae）胚胎以研究胚胎发育的实验方案。最后，我们提出了通过 CRISPR/Cas9 技术将 GAL4 插入目标基因下游以构建驱动子品系的潜在改进方法。

3xP3 启动子驱动的 eYFP、dsRed 和 eCFP 表达可在An. gambiae蛹的眼部和腹神经节中产生可靠且易于区分的标记，从而准确识别携带这些标记基因的个体（图3）。雄性和雌性外部生殖器在形态上的差异可用于性别鉴定，图4展示了这一特征及一个无法识别性别的蛹样例。去除蛹体表面所有水分会增加性别鉴定难度，因为肛门桨状结构会遮挡生殖器的观察（图4D、E）。双组分GAL4-UAS系统可实现基因表达的时空特异性调控，通过将泛表达驱动系（图6A、C）和油胞细胞特异性驱动系（图6B、D）与响应子品系UAS-mCD8:mCherry10杂交，可直观观察到基因表达...

双组分GAL4-UAS系统是一种多功能工具，可用于在可控的时空条件下调控基因表达，从而在Anopheles gambiae中进行功能性遗传学分析。本文所述该系统的使用方法包括半标准化的克隆策略、基于荧光蛋白标记对蛹进行性别鉴定和筛选，以及胚胎固定。

利用GAL4-UAS系统在Anopheles gambiae中进行功能遗传学研究

双组分 GAL4-UAS 系统是一种多功能且强大的功能遗传学分析工具。该系统的核心在于将转基因“驱动”品系与转基因“效应”品系进行杂交……

双组分GAL4-UAS系统是一种多功能工具，可通过时空可控的方式对冈比亚按蚊中的基因表达进行遗传修饰，从而实现功能基因组学分析。该二元系统在转基因表达的表型鉴定实验设计中具有灵活性，即使存在严重的适合度代价也能应用。该系统可用于鉴定可能参与杀虫剂抗性、病原体传播相关基因的表型特征，或用于基因控制策略中的基因功能研究。Fraser Coleman，一名研究技术员，将协助演示该实验步骤。首先，使用剪去末端的三毫升塑料巴斯德吸管，将蛹收集到一个透明的平底培养皿中，该培养皿适用于体视显微镜观察。小心移除蛹周围的大部分水分。打开荧光灯并预热。在筛选荧光标记时，需考虑不同表型的表达及比值所预期产生的颜色时空分布模式。在荧光体视显微镜上选择所需的滤光片，并检查是否有可见的彩色光束照射到载物台板的中心位置。在白光下，将蛹置于视野中央，并调节至清晰对焦。关闭白光，使用细调焦旋钮对携带目标表型且具有可见荧光模式的蛹进行对焦。用精细的细节画笔轻轻翻转蛹体，并移动肛鳍，以便识别外部生殖器。根据外部生殖器的显著特征对蛹进行分类。雄性具有一根从最后一节背段伸出的长管，其长度约为肛门桨状结构的一半。雌性蛹的外生殖器明显较短且呈分叉状。将已区分性别的蛹按每组10只或更少的数量分装至透明的20毫升试管中，并加入水，用一团脱脂棉密封试管。从试管中吸取所需数量的雄性和雌性成虫至饲养笼或小桶中，注意在此过程中避免损伤成虫。交配后维持培养5至7天，然后进行血液饲喂。次日可收集卵以研究胚胎发育。组装产卵室，并小心地将10至15只吸血后的雌蚊引入其中。盖上产卵室，静置20分钟。小心地将50毫升聚丙烯管从产卵罐上取下，注意不要让蚊子逸出。盖上锅盖，使卵发育至目标发育阶段。使用精细的细节画笔从锅中拾取卵，并将其放置在40平方毫米的凹槽玻璃块的水中。用微量移液器小心吸除玻璃块中的水，并加入500微升FAA固定液覆盖卵。在室温下于摇床上轻轻振荡30分钟。用蒸馏水彻底冲洗卵子15次，以去除FAA溶液的所有残留。使用1000微升移液器，每次加入并移除1毫升蒸馏水，操作时注意不要损伤卵子。用一毫升 Trpis 溶液覆盖固定的卵，在室温下孵育 30 分钟。孵育 5 分钟后，卵将开始出现浅色斑块，最终变得完全透明，呈乳白色。用蒸馏水彻底冲洗卵 15 次，以去除所有 Trpis 溶液的残留。在冈比亚按蚊蛹的眼部和腹神经节中可观察到由3xP3启动子驱动的荧光标记表达。使用不同颜色的荧光标记可便于筛选和鉴定携带不同GAL4和UAS组分的基因修饰个体。在使用双组分GAL4-UAS系统时，必须将来自不同品系的雄性和雌性个体进行杂交，以获得同时携带GAL4和UAS组分的子代。通过观察蛹期雌雄外生殖器的形态差异来进行性别鉴定。此处展示了一个无法辨别的蛹样例。如右侧所示，当蛹体内水分完全脱除后，肛叶会遮挡生殖器，增加性别鉴定的难度。双组分GAL4-UAS系统能够以受控的时空方式调控基因表达。通过将表达GAL4的脂肪细胞特异性及泛表达驱动品系与报告基因UAS-mCherry品系杂交，可实现对该过程的可视化观察。使用双组分GAL4-UAS系统的一个重要优势在于，即使在胚胎阶段，也能方便地研究致死性表型。为此，有必要对胚胎的内部形态进行观察。在完成胚胎透明化实验流程后，可观察到胚胎发育不同阶段（产卵后12、24和36小时）的正常形态学特征。在整个操作过程中，必须防止蛹和卵发生干燥。因此，去除液体时必须迅速操作。GAL4-UAS 方法使我们能够对参与杀虫剂抗性的基因以及在基因驱动控制方法中具有潜在应用价值的基因进行功能表征。

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科研

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Genetics

遗传学

使用GAL4-UAS系统在冈比亚按蚊的功能遗传学中

我们描述了一种由翻转酶诱导的交叉Gal80/Gal4抑制（FINGR）方法，该方法利用组织特异性的FLP来决定Gal80的表达模式。在Gal4与FLP表达重叠的区域，Gal4的表达将被开启（Gal80被翻出）或关闭（Gal80被翻入）。FINGR方法在克隆分析和神经环路图谱绘制中具有广泛的适用性。...

幼虫和成体中增强子捕获型Flippase表达的定位与应用 果蝇 中枢神经系统

基于大规模并行DNA测序技术的基因组组装通常具有高度片段化的特点。物理染色体图谱的构建有望改善基因组组装的质量。本文中，我们展示了染色体制备、荧光原位杂交以及成像方面的创新方法，可显著提高物理图谱构建的通量。...

高通量染色体物理图谱构建的自动化方法 原位 杂交

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蚊虫胚胎显微注射：一种将外源DNA递送至胚胎卵黄的技术 Anopheles gambiae 生成生殖系突变

本方案描述了在斑马鱼中利用Gal4-VP16作为主要报告基因、GFP/RFP作为次要报告基因进行基因捕获插入突变的方法。大约每十尾高表达的F0代鱼中，就有一尾能够产生同时表达GFP和RFP的基因捕获后代。该筛选流程可轻松扩展，以适应进行插入突变筛选实验的实验室规模。...

利用Gal4在斑马鱼中进行基因捕获

在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱腹状态对成年果蝇Drosophila...

一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

RNA干扰（RNAi）是揭示基因功能的极为重要的工具。然而，在主要的人类疟疾传播媒介冈比亚按蚊（Anopheles...

向Anopheles gambiae蛹体内递送RNAi触发物

本实验方案的目的是概述在Drosophila...

利用Drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究

该方案描述了如何在基因组中实现定点修饰 按蚊属 疟疾蚊子使用 φC31 系统。所描述的修饰包括基因组中转基因盒的整合与置换...

定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

显微注射技术对于将外源基因导入蚊子基因组至关重要。本方案介绍了James实验室用于向Anopheles...

Anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

通过细菌产生的双链RNA（dsRNA）进行口服给药，是一种常用于Caenorhabditis...

有效的口服RNA干扰（RNAi）给药至成年Anopheles gambiae蚊子

Drosophila 转基因的胚胎显微注射

学习使用GAL4-UAS系统在冈比亚按蚊中进行功能遗传学研究，通过时空特异性基因表达控制实现表型分析。该方法支持杀虫剂抗性和遗传控制策略相关基因的功能表征。

利用GAL4-UAS系统在Anopheles gambiae中进行功能遗传学研究

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