Name: 哺乳动物原色素上皮细胞的分离、培养和基因工程用于非病毒基因治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学习从五种哺乳动物中分离和培养原代虹膜及视网膜色素上皮细胞的方法，利用非病毒SB100X转座子系统进行基因转染。该技术为眼部基因治疗研究提供了高细胞活力和高转染效率的可靠平台。

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感谢Gregg Sealy和Alain Conti提供的出色技术支持。本工作由欧盟第七框架计划、瑞士国家科学基金会以及Schmieder-Bohrisch基金会资助。Z.I.获得了欧洲研究理事会高级资助[ERC-2011-ADG 294742]的支持，B.M.W.获得了富布赖特研究奖学金和瑞士政府卓越奖学金的资助。

涉及动物的实验方案由经过认证的人员执行，并在获得瑞士日内瓦州安全、就业与健康部门（DSES）动物实验管理局批准后进行，同时遵循ARVO关于眼科与视觉研究中使用动物的声明（批准号：GE/94/17）。成年健康的Brown Norway大鼠、C57BL/6小鼠和新西兰白兔通过腹腔注射0.9% NaCl稀释的戊巴比妥钠（150 mg/kg）过量麻醉处死，牺牲后立即摘除眼球。猪眼和牛眼于屠宰后6小时内从当地屠宰场获取，并在冰上运输至实验室。
1. 准备前
<ol>
	<li>配制完全培养基（DMEM/Ham's F12，添加10%胎牛血清（FBS）、80 U/mL青霉素/80 µg/mL链霉素和2.5 µg/mL两性霉素B）。将培养基、1× PBS和0.25%胰蛋白酶（如需要）置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>在超净工作台内铺无菌巾，以准备无菌操作区域。将所有需要的无菌器械和材料放入超净工作台内。 
	&#8203;注意：仅眼球摘除以及去除残留的肌肉组织和皮肤的操作可在超净工作台外进行，其余所有步骤必须在超净工作台内完成。</li>
</ol>
2. 大鼠/小鼠腹膜腔细胞的分离
<ol>
	<li>动物安乐死后，使用弯剪和科利布里镊子摘除眼球。用剪刀和镊子（非无菌）清除眼球上残留的肌肉组织和皮肤。 
	&#8203;注意：用于摘除和清洁眼球的剪刀和镊子的尺寸取决于物种（例如，大鼠和小鼠所用器械将比猪和牛所用的更小&#160;）（见图S1）。
	<ol>
		<li>将眼球收集至装有非无菌PBS的50 mL离心管中，并将离心管转移至超净工作台。将眼球浸入碘溶液中消毒2分钟，然后转移至盛有无菌PBS的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开眼球
	<ol>
		<li>将眼球转移至无菌培养皿后，用科利布里镊子或尖头镊子牢固夹住靠近视神经的一侧。用18号针头在虹膜边缘附近（睫状体平坦部与锯齿缘之间）刺一个小孔。将小剪刀插入孔中，沿虹膜周围剪开。移除前段结构（角膜、晶状体和虹膜），并将其放入培养皿中。保留含有玻璃体的眼杯，直至完成视网膜色素上皮细胞的分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>虹膜色素上皮细胞（IPE）的分离
	<ol>
		<li>移除晶状体，并用精细镊子小心地拉出含有IPE细胞的虹膜。将虹膜置于培养皿中，用无菌PBS洗涤，并保留在PBS中，直至其他虹膜处理完毕。</li>
		<li>对当天需处理的所有眼球重复步骤2.2.1至2.3.1。</li>
		<li>每片虹膜加入50 µL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育10分钟。吸除胰蛋白酶，每片虹膜加入150 µL完全培养基，用扁平火焰抛光的巴斯德移液管轻轻刮取IPE细胞；使用精细镊子固定组织。收集细胞悬液并转移至1.5 mL离心管中。取10 µL细胞悬液，用台盼蓝按1:3稀释，在血细胞计数板中进行细胞计数34,35。</li>
		<li>若不立即转染，则将200,000个细胞/孔接种于24孔板中（100,000个细胞/cm2），每孔加入1 mL完全培养基（含10% FBS）（接种条件参见表1）。将培养板放入培养箱，在37 °C、5% CO2条件下培养。 
		NOTE: 可能需要合并多个眼球以获得足够的接种细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜色素上皮细胞（RPE）的分离
	<ol>
		<li>用细镊子去除后段的玻璃体和视网膜，注意避免损伤视网膜色素上皮层。</li>
		<li>使用#10手术刀将后段切成两半，使眼杯完全打开，并用无菌PBS洗涤。</li>
		<li>每只眼球加入50 µL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育10分钟。吸除胰蛋白酶，每只眼球加入150 µL完全培养基，用圆形手术刀轻轻刮取RPE细胞；使用精细镊子固定组织。收集细胞悬液并转移至1.5 mL离心管中。取10 µL细胞悬液，用台盼蓝按1:4稀释，在血细胞计数板中进行细胞计数。</li>
		<li>参见步骤2.3.4。 
		&#8203;NOTE: 可能需要合并多个眼球以获得足够的接种细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 兔PE细胞的分离
<ol>
	<li>按照步骤 2.1 至 2.1.1 所述进行清洁和消毒。</li>
	<li>将一只眼球置于无菌纱布上，紧靠视神经牢固固定。使用 #11 手术刀和剪刀在角膜缘下方约 2 mm 处切开眼球。移除前段结构（角膜、晶状体和虹膜），并将其放入培养皿中。保留含有玻璃体的眼杯，直至完成视网膜色素上皮（RPE）细胞的分离。</li>
	<li>虹膜色素上皮（IPE）细胞的分离
	<ol>
		<li>执行步骤 2.3.1。使用 #10 手术刀切除虹膜上的睫状体。</li>
		<li>制备完 2 个虹膜后，在 37 °C 下用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶孵育 10 分钟；在此期间可进行 RPE 细胞的分离（见步骤 3.4）。吸除胰蛋白酶，向虹膜中加入 1 mL 完全培养基，用经火焰抛光的平头巴斯德吸管轻轻刮取以分离细胞。轻柔吹打重悬细胞，并将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中。取 10 µL 细胞悬液，用台盼蓝按 1:3 稀释，在血细胞计数板中进行细胞计数。</li>
		<li>参见步骤 2.3.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜色素上皮（RPE）细胞的分离
	<ol>
		<li>执行步骤 2.4.1。</li>
		<li>将一块无菌纱布放入 12 孔板中，并将眼杯置于纱布上。</li>
		<li>用 PBS 洗涤，并执行步骤 2.4.3。 
		注意：使用经火焰抛光的弯头巴斯德吸管。</li>
		<li>以 120 × g 离心细胞 10 分钟。</li>
		<li>参见步骤 2.3.4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 猪PE细胞的分离
<ol>
	<li>按照步骤 2.1 中所述进行清洗。用 PBS 洗涤，并将眼睛浸入含碘溶液中 2 分钟以消毒，再用 PBS 冲洗。继续进行步骤 3.2。</li>
	<li>虹膜色素上皮（IPE）细胞的分离
	<ol>
		<li>执行步骤 3.3.1。在制备完 2 个虹膜后，加入 1 mL 完全培养基，用经过火焰抛光的平头巴斯德吸管轻轻刮取以分离细胞。将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中。取 10 µL 细胞悬液，用台盼蓝按 1:4 稀释，在血细胞计数板（Neubauer 计数室）中进行细胞计数。</li>
		<li>参见步骤 2.3.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜色素上皮（RPE）细胞的分离
	<ol>
		<li>执行步骤 2.4.1。将眼球置于培养皿中，用 PBS 洗涤。向眼球内加入 1 mL 完全培养基。</li>
		<li>使用经过火焰抛光的弯头巴斯德吸管，小心地去除 RPE 细胞。务必从底部向上刮取，以避免脉络膜-布鲁赫膜复合体滑脱。用 1,000 µL 移液器收集眼球内的细胞悬液，并转移至 1.5 mL 离心管中以重新悬浮。取 10 µL 细胞悬液，用台盼蓝按 1:8 稀释，在血细胞计数板（Neubauer 计数室）中进行细胞计数。</li>
		<li>参见步骤 2.3.4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 牛PE细胞的分离
<ol>
	<li>按照步骤 2.1 中所述进行清洗。用 PBS 洗涤，并将眼睛浸入碘溶液中 2 分钟以消毒，再用 PBS 冲洗。继续进行步骤 3.2。</li>
	<li>虹膜色素上皮（IPE）细胞的分离
	<ol>
		<li>执行步骤 3.3.1。在制备两份虹膜后，加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 10 分钟。在此期间，可同时进行视网膜色素上皮（RPE）细胞的分离（见步骤 5.3）。</li>
		<li>去除胰蛋白酶，向虹膜中加入 2 mL 完全培养基，用经火焰抛光的扁平巴斯德吸管轻轻刮取以分离细胞。将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。在 120 × g 条件下离心 10 分钟。取 10 µL 细胞悬液，用台盼蓝按 1:4 比例稀释，用于在血细胞计数板中进行细胞计数。</li>
		<li>若不立即进行转染，则将 320,000 个细胞接种于 6 孔板的每孔中，每孔加入 3 mL 完全培养基（含 10% FBS）（接种方法参见 表 1）。将培养板放入培养箱，在 37 °C、5% CO2 条件下进行培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜色素上皮（RPE）细胞的分离
	<ol>
		<li>按照步骤 2.4.1 操作。将眼球置于培养皿中，用 PBS 洗涤。在完成两个眼球的制备后，向眼球内注入约 ¾ 体积的胰蛋白酶，盖上培养皿盖子，于 37 °C 孵育 25 分钟。</li>
		<li>去除胰蛋白酶，加入 1 mL 完全培养基。执行步骤 4.3.2。在 120 × g 条件下离心细胞 10 分钟。</li>
		<li>参见步骤 5.2.3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 培养——更换培养基
<ol>
	<li>在含10% FBS、80 U/mL青霉素/80 µg/mL链霉素和2.5 µg/mL两性霉素B的DMEM/Ham's F12培养基中，于37°C、5% CO2的湿化培养箱中培养细胞。3-4天后，通过反复吹打收集非贴壁细胞，并将一半体积转移至另一孔中，用完全培养基补至1 mL。 
	注：此操作可提供足够大的表面积，使所有分离的细胞均能贴壁，从而最大化细胞产量。</li>
	<li>再过3-4天后重复细胞收集操作，但此次将两个孔中的非贴壁细胞合并至一个孔中（例如将A1和B1孔的细胞合并至C1孔）。向所有孔中添加培养基。观察细胞状态，并每周更换培养基两次（6孔板和24孔板每孔分别使用3 mL和1 mL培养基）。当细胞达到汇合状态时，更换为含1% FBS的完全培养基，或直接用于实验（如转染）。 
	&#8203;注：RPE细胞和IPE细胞分别在分离后3-4周和4-5周达到汇合状态。通过观察细胞形态（色素性细胞）及特异性标志物检测验证细胞培养纯度，具体方法参见Johnen等人的研究36。</li>
</ol>
7. 原代胸膜腔上皮细胞的电穿孔
<ol>
	<li>按照先前所述方法进行电穿孔1,37。</li>
	<li>根据转染的细胞数量，使用6孔、24孔或48孔板（见表2），将细胞接种于不含抗生素和抗真菌剂的培养基中。在接下来的2周内，每周两次添加含有青霉素（80 U/mL）、链霉素（80 µg/mL）和两性霉素B（2.5 µg/mL）的培养基。转染后2周完全更换培养基。</li>
	<li>为评估细胞生长、转染效率和蛋白分泌情况，需每周通过显微镜观察细胞，并通过Western blot分析细胞培养上清液。在结束培养前，收集24小时的细胞培养上清液，用于ELISA定量蛋白分泌量，同时计数细胞，根据制造商说明书（见材料表）采用基于成像的流式细胞术检测荧光（适用于Venus转染细胞），并收集细胞沉淀用于基于RT-qPCR的基因表达分析。 
	注意：由于本文目的并非详细阐述细胞分析方法，而是侧重其分离过程，因此未包含上述分析方法的具体细节。所有物种的细胞接种密度相同（100,000 cells/cm2），但由于分离获得的细胞数量不同，因此使用了不同的培养板。此外，对于小鼠、大鼠和兔，可能需要合并2-3只眼睛的细胞才能获得足够的接种细胞量。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物种</td>
			<td>胰蛋白酶处理</td>
			<td>N° IPE 细胞</td>
			<td>N° RPE 细胞</td>
			<td>用于接种的培养板（100,000 个细胞/cm²）2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠/大鼠</td>
			<td>是</td>
			<td>~50,000</td>
			<td>~150,000</td>
			<td>24孔板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>兔子</td>
			<td>是</td>
			<td>~350,000</td>
			<td>~2,500,000</td>
			<td>24孔板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>猪</td>
			<td>无</td>
			<td>~1,000,000</td>
			<td>~3,000,000</td>
			<td>24孔板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛</td>
			<td>是</td>
			<td>~1,700,000</td>
			<td>~5,000,000</td>
			<td>6孔板</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：从不同物种眼睛中分离的原代PE细胞数量。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>面积</td>
			<td>培养基体积</td>
			<td>胰蛋白酶</td>
			<td>终止胰蛋白酶作用的培养基体积</td>
			<td>接种密度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6孔板</td>
			<td>9.6 cm²</td>
			<td>3.0 mL</td>
			<td>0.5 mL</td>
			<td>1.0 mL</td>
			<td>3x105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24孔板</td>
			<td>2.0 cm²</td>
			<td>1.0 mL</td>
			<td>0.2 mL</td>
			<td>0.8 mL</td>
			<td>5x104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48孔板</td>
			<td>1.1 cm²</td>
			<td>0.5 mL</td>
			<td>0.1 mL</td>
			<td>0.4 mL</td>
			<td>0.5-1x104</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：细胞培养体积和接种密度。

作者无任何利益冲突需要披露。

建立标准化的PE细胞分离与培养方法，对于开发视网膜变性疾病的新疗法至关重要。通过本文所述的方案，可成功从不同物种中分离PE细胞，并进行长期培养（迄今为止，最长的培养时间已达2年1,38）；在此过程中观察到了典型的PE细胞形态、色素沉着及功能（图1，图2）。需注意的是，在进行纯RPE细胞培养时，必须彻底去除视网膜，以避免神经视网膜细胞的污染；而对于IPE细胞，则应按照方案所述，从虹膜上完全去除睫状体。细胞在相对较短的时间内即可达到汇合状态（约21天），此后即可用于治疗性基因转染或其他实验（如暴露于毒性物质、蛋白质等）。此外，这些方案不仅对临床前的体外和体内测试至关重要，也对人类临床应用具有重要意义，即验证经转染的PE细胞移植效果；特别是我们团队正在开发的针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的治疗方法，其中将从患者虹膜活检中分离IPE细胞，立即进行基因转染，并在同一手术过程中...

本研究团队致力于开发基于视网膜色素上皮细胞（RPE）和虹膜色素上皮细胞（IPE）的非病毒基因疗法，用于治疗神经视网膜退行性疾病，即年龄相关性黄斑变性（AMD）。此类疗法的临床前建立需要可转化至人类的体外模型。因此，本研究所提出的目标是提供原代RPE和IPE细胞的分离、培养及基因工程操作的技术方案。建立多种物种色素上皮（PE）细胞分离方法的科学依据在于，能够更可靠地验证该方法的安全性和有效性，并提高其可重复性与可转化性。目前可用的人RPE细胞系ARPE-19与原代细胞存在差异（例如色素含量较低），因此在临床前分析中的应用价值有限1。此外，非人哺乳动物细胞购买成本较低且可获得数量更大；人供体眼组织虽可从多家眼库获取，但来源有限且价格昂贵。最后，根据规定，新的先进治疗医药产品（ATMP，即细胞、组织或基因治疗医药&#160;产品）在用于患者之前，需在至少两种不同物种中进行测试，而这些体内研究需要制备同种异体细胞移植物。
视网膜神经退行性疾病是工业化国家致盲的首要原因，包括年龄相关性黄斑变性（AMD）等常见疾病以及视网膜色素变性等罕见疾病，这些疾病最终因视网膜细胞死亡而导致失明。在某些情况下，视网膜色素上皮细胞（RPE）、光感受器和视网膜神经节细胞（RGC）的损伤可以被延缓，但目前尚无治愈性疗法。先进治疗药物（ATMP）具有纠正基因缺陷、整合治疗性基因或替代退化细胞的潜力，从而为AMD等疾病开发再生性和治愈性疗法提供了可能；已有13种基因疗法获得上市批准，其中包括用于治疗RPE65基因突变相关视网膜变性的疗法2,3。在老年人群（&#62;60岁）中，全球约有3000万人受新生血管性（nvAMD）或非血管性（aAMD）AMD的影响4。这两种形式均由与年龄相关的诱因引发，包括氧化损伤、RPE细胞功能障碍和丢失，进而导致光感受器退化，以及其他因素（如遗传风险等位基因、吸烟、高血压）5,6。在nvAMD中，由于促血管生成与抗血管生成因子之间的失衡，倾向于促血管生成的血管内皮生长因子（VEGF），从而加剧了脉络膜新生血管（CNV）的形成。迄今为止，仅nvAMD可通过每月玻璃体内注射VEGF蛋白抑制剂来抑制CNV，而aAMD尚无有效治疗方法6,7。
多项研究评估了以细胞疗法替代抗VEGF治疗的可行性：Binder等人开展的研究将新鲜收获的自体视网膜色素上皮（RPE）细胞移植至nAMD患者，结果显示视力有所改善，但仅有少数患者最终视力达到可阅读水平8,9,10。最近，一项I期临床研究使用胚胎干细胞来源的RPE细胞片治疗AMD，取得了有前景的结果，即在10例接受治疗的患者中有2例在长达12个月内显示出RPE细胞片的有效性、稳定性和安全性11。此外，多个研究团队已发表研究，将自体RPE-布鲁赫膜-脉络膜片从周边视网膜获取并移植至黄斑区12,13,14，并利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生RPE细胞片用于移植15。对于aAMD，靶向补体通路的抗体已在临床试验中进行测试6,16，一项针对地图样萎缩（GA）患者使用编码CD59因子基因的腺相关病毒（AAV）载体（AAVCAGsCD59）单次玻璃体内注射的I期研究已完成17；II期研究 recently启动，计划招募132名晚期aAMD患者，并在干预后2年评估疗效18。最后，FocuS研究组已启动一项I/II期多中心临床试验，评估一种编码人源补体因子的重组非复制型AAV载体的安全性、剂量反应及疗效19。
再生性AMD治疗的主要目标是移植因损伤或丢失而缺失的功能性RPE细胞。然而，IPE细胞与RPE细胞在功能和遗传上具有许多相似之处（例如，吞噬作用和视黄醇代谢），并且由于IPE细胞更易于获取，因此已被提议作为RPE的替代物20。尽管先前已证明IPE细胞移植可在动物模型中延缓光感受器退化21,22，并在晚期nvAMD患者中稳定视觉功能，但这些患者并未观察到显著改善23。疗效不足可能归因于移植细胞数量较少和/或神经营养因子在视网膜中的失衡。另一种方法是移植经过基因转染、过表达神经营养因子的色素上皮细胞，以恢复视网膜稳态，维持残存的RPE细胞，并保护光感受器和RGCs免于退化。因此，我们提出一种新疗法，即移植经过基因工程改造、可分泌神经营养和抗血管生成蛋白（如PEDF、GM-CSF或类胰岛素生长因子（IGFs））的功能性RPE或IPE细胞。相较于仅使用细胞系、单一物种或人体组织，采用多种物种进行该方法的开发与分析具有以下优势：1）大量在不同实验室和不同物种中开展的研究表明，结果具有更高的可重复性和可转移性1,24,25；2）猪或牛细胞可方便地获取，且无需额外牺牲动物；3）猪和牛细胞的可获得性使得能够开展大规模测试，从而获得稳健的结果；4）掌握从常用模型中分离、培养和基因&#160;修饰&#160;细胞的技术，可实现多种物种的体内分析24,25,26，从而为首批接受治疗的患者提供更优的风险-效益比；5）本方案具有高度灵活性，适用于各种模型和实验设置，可用于所有眼部细胞治疗（无论是否涉及基因工程）。相比之下，细胞系或人体组织等替代技术在可转移性或可获取性方面均存在局限。例如ARPE-19&#160;等细胞系适用于初步实验；然而，其色素含量低、增殖能力强，与原代细胞存在显著差异1。从人供体组织中分离的RPE和IPE细胞是可转移的体外实验的宝贵资源；然而，我们所使用的人体组织来自美国的一家眼库，意味着组织在摘除后至少已有两天，并需经历漫长且昂贵的运输过程，而本地供体组织无法满足高效研究所需的数量。其他研究团队的多项研究已证实使用原代细胞的优势27,28。
用于开发基于细胞的非病毒基因治疗 SB100X 用于转染原代RPE和IPE细胞的转座子系统，分别携带编码PEDF和/或GM-CSF的基因，以治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性（nvAMD）和非新生血管性年龄相关性黄斑变性（aAMD）29,30,31,32，我们首先建立了ARPE-19细胞的转染方法1接下来，研究人员在易于获取的牛和猪的原代细胞中建立了分离与转染方案。目前，已成功建立从小型（如小鼠）到大型哺乳动物（如牛）共五种不同物种的原代RPE和IPE细胞的分离与转染方法。该方法已在来源于人供体眼球的原代RPE和IPE细胞中得到验证。30采用人供体组织验证了符合药品生产质量管理规范（GMP）的先进治疗 medicinal 产品（ATMP）的生产过程33最后，对该方法的安全性和效率进行了评估 体内 在三种已对该方案进行过优化的物种中：小鼠、大鼠和兔。在临床操作中，将从患者体内获取虹膜活检组织，在洁净室中分离并转染虹膜色素上皮（IPE）细胞，随后将细胞移植回同一患者的视网膜下腔。整个过程将在一次持续约60分钟的手术过程中完成。该治疗方法的开发及其疗效评估需要出色的 体外 和 离体 用于实施高效且稳定的基因递送方法，分析基因递送效率、治疗性蛋白表达及神经保护作用，并制备细胞移植材料以验证该策略 体内1,24,25,29,30值得一提的是，该疗法已获得瑞士日内瓦州科研伦理委员会（编号：2019-00250）批准，可开展临床Ib/IIa期试验，目前正依据本方案收集瑞士监管机构授权所需的最后一项临床前数据。在此方面，临床前 体内 数据表明，脉络膜新生血管（CNV）显著减少，且安全性良好24,25,31.
此处介绍了从牛、猪、兔、大鼠和小鼠中分离和培养视网膜色素上皮/虹膜色素上皮（RPE/IPE）细胞的方法，以及整合性应用 SB100X 转座子系统结合电穿孔作为一种高效的基因递送方法被描述。特别是，原代PE细胞被转染以过表达PEDF和GM-CSF。这些实验方案的整合使得 体外 和 在体 可在ATMP开发的所有临床前阶段进行研究。此外，该体系还有望针对其他目标基因和疾病进行适应性调整。

<table><tbody><tr><td>12孔板</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>48孔板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Greiner</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>贝塔碘</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bonn显微镊子（平头）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colibri镊子（无菌）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo细胞毒性检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>手术巾（无菌）</td><td>M&amp;ouml;lnlycke Health Care</td><td>800530</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔缓冲液3P.14</td><td>3P Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>镊子（不同规格）（无菌）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纱布敷料</td><td>PROMEDICAL AG</td><td>25403</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（0.9%）</td><td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td><td>1000090</td><td></td></tr><tr><td>针头（18G）&amp;nbsp;</td><td>Terumo</td><td>TER-NN1838R</td><td></td></tr><tr><td>Neon转染试剂盒10 &amp;micro;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Neon转染系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（Neubauer型）</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管（火焰抛光）</td><td>Witeg</td><td>4100150</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥（Thiopental Inresa）</td><td>Ospedalia AG</td><td>31408025</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-PEDF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-SB100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-Venus</td><td></td><td></td><td>Pastor等，2018年。由Scherman教授和Marie教授惠赠</td></tr><tr><td>pSB100X（250 ng/&amp;micro;L）</td><td></td><td></td><td>M&amp;aacute;t&amp;eacute;s等，2009年。由Izsvak教授提供</td></tr><tr><td>pT2-CAGGS-Venus</td><td></td><td></td><td>Johnen等，2012年</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His质粒DNA（250 ng/&amp;micro;L）</td><td></td><td></td><td>本实验室克隆</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-His质粒DNA（250 ng/&amp;micro;L）</td><td></td><td></td><td>Pastor等，2018年</td></tr><tr><td>10号手术刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>11号手术刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>尖-尖头弯型超细Bonn剪刀（无菌）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尖-尖头直型超细Bonn剪刀（无菌）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tali图像型细胞计数仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶0.25%&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25050014</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶5%/EDTA 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Vannas弹簧剪刀（弯型）（无菌）</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

分离、培养及遗传改造哺乳动物原代色素上皮细胞用于非病毒基因治疗

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致患者失明的最常见原因 &#62;60年，影响全球约3000万人。年龄相关性黄斑变性是一种受环境和遗传因素共同影响的多因素疾病，其特征是视网膜色素上皮（RPE）细胞退化，继而导致光感受器降解，最终引起视网膜功能障碍。理想的治疗方法包括移植能够分泌神经营养因子的健康RPE细胞，以防止RPE细胞死亡和光感受器退化。由于虹膜色素上皮（IPE）细胞在功能和遗传上与RPE细胞具有相似性，且可通过创伤较小的活检获取，因此IPE细胞移植被提出作为退化RPE细胞的替代治疗方案。通过将少量细胞移植至视网膜下腔，即可实现神经营养因子的分泌 睡美人 (SB100X) 转座子介导的转染，导入编码色素上皮衍生因子（PEDF）和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的基因。我们建立了细胞的分离、培养和 SB100X介导的转染方法用于转染来自多种物种（包括啮齿类、猪和牛）的视网膜色素上皮（RPE）细胞和虹膜色素上皮（IPE）细胞。眼球被摘除后，去除角膜和晶状体以暴露虹膜和视网膜。使用自制刮匙从分离的虹膜上剥离IPE细胞。收获RPE细胞时，根据物种不同可能需要胰蛋白酶孵育。随后使用专用于RPE的刮匙将细胞悬浮于培养基中。接种后，细胞每周监测两次，待达到汇合状态后通过电穿孔进行转染。通过qPCR、WB、ELISA、免疫荧光及功能检测验证了基因整合、表达、蛋白分泌及生物学功能。根据不同物种，每只眼球可分离获得3万至500万个RPE细胞和1万至150万个IPE细胞。经基因修饰的细胞表现出显著的PEDF/GM-CSF过表达，具有减轻氧化应激的能力，并提供了一个灵活的实验系统 离体&#160;分析和 体内 可转化至人类的研究，以开发眼部基因治疗策略。

从不同哺乳动物物种中分离PE细胞 
采用上述实验方案，已成功从五种不同物种中分离并培养了IPE和RPE细胞。每次实验所获得的细胞数量取决于物种及眼球大小（表1）。如图1所示，细胞呈现典型的PE细胞形态和色素沉积（所展示的兔源细胞除外，其来源于白化新西兰白兔（NZW））。在分离后21天，细胞达到汇合状态，可用于后续实验（例如转染）。需要注意的是，所有物种来源的细胞培养物均被持续监测和控制长达2年，证实其形态正常且外源基因表达稳定（数据未显示）。
通过RT-qPCR和免疫组织化学排除了去分化、细胞应激以及基因表达的变化。在转染的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19细胞）中分析了一组基因（VEGF、CRALBP、CATD、ZO-1、KRT8），证实其具有正常的视网膜色素上皮表达模式1；通过RPE65的免疫荧光染色也在原代牛虹膜色素上皮细胞中得到了验证（图2</stro...

本文介绍了一种从多种哺乳动物（小鼠、大鼠、兔、猪和牛）中分离并转染原代虹膜和视网膜色素上皮细胞的实验方案。该方法非常适用于在多种实验条件下开展眼部基因治疗的研究，可用于可转化至人类的离体&#160;分析以及&#160;在体研究。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是60岁以上患者失明的最常见原因，全球约有3000万人受其影响。AMD是一种……

该方案具有重要意义，因为它展示了从五种哺乳动物中分离并转染色素上皮细胞的方法，是研究多种条件下眼部基因治疗的理想体系。本方法的主要优势在于其灵活性、可转移性、高细胞得率、高存活率以及高转染效率，这得益于所采用的五种物种及非病毒性SB100X转座子系统。这些技术最初用于研究靶向视网膜和虹膜色素上皮细胞的基因治疗策略，而这些细胞正是本方案中所分离和转染的对象，但其同样适用于任何眼部相关研究。进行该操作演示的是来自实验室的技术员 Gregg Sealy。在处死动物后，使用弯头剪刀和蜂鸟镊子摘除眼球，然后清除眼球上残留的肌肉组织和皮肤。将眼球收集到一个装有非无菌 PBS 的 50 毫升离心管中，并将该管转移至超净工作台。将它们浸入含碘溶液中消毒两分钟，然后将眼球转移至装有无菌 PBS 的 50 毫升离心管中。取一只眼球置于无菌纱布上，牢固握住靠近视神经的眼球部位，然后使用 11 号手术刀在虹膜边缘附近进行切割。使用剪刀沿虹膜周围剪开，移除眼前段并将其放入培养皿中，保留含有玻璃体的眼球后段，直至分离视网膜色素上皮（RPE）细胞。为分离虹膜色素上皮（IPE）细胞，用精细镊子移除晶状体，并轻柔地取出含有 IPE 细胞的虹膜。将虹膜置于培养皿中，并用无菌 PBS 清洗。加入500 µL 0.25%胰蛋白酶，于37°C孵育10分钟。去除胰蛋白酶，加入500 µL完全培养基，用扁平、火焰抛光的巴斯德吸管轻轻刮取IPE。收集细胞悬液，置于1.5 mL离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，每孔接种20万个细胞至24孔板中，每孔加入1毫升完全培养基。将培养板放入培养箱中，在37°C及5%二氧化碳条件下进行培养。为分离视网膜色素上皮（RPE）细胞，使用细镊子从眼球后段去除玻璃体和视网膜。将眼球放入24孔板中，每眼加入500 µL 0.25%胰蛋白酶，于37°C孵育10分钟。吸除胰蛋白酶，每眼球加入500 µL完全培养基，用弯曲的火焰抛光巴斯德吸管轻轻刮取视网膜色素上皮（RPE）细胞。收集细胞悬液，转移至1.5 mL离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并按照先前所述方法接种细胞。将培养板放入培养箱中。清除眼球上残留的肌肉组织和皮肤，并用含碘溶液对眼球进行消毒，随后用PBS冲洗。为了分离IPE细胞，按先前所述方法去除晶状体并取出虹膜。制备两份虹膜后，加入1毫升完全培养基，用扁平的火焰抛光巴斯德吸管刮取细胞以进行分离，随后计数并接种细胞。将培养板放入培养箱中。为分离视网膜色素上皮（RPE）细胞，需从眼球后段去除玻璃体和视网膜，并将眼球置于培养皿中。向眼球内加入一毫升完全培养基。使用弯曲的火焰抛光巴斯德吸管，刮取RPE细胞。用1,000微升移液器收集球部内的细胞悬液，并转移至1.5毫升离心管中重悬。随后对细胞进行计数、接种，并按照之前所述方法培养培养板。清洗后，打开眼球，沿虹膜周围剪切以去除前段结构，然后放入培养皿中。将巩膜杯与玻璃体一起保留，直至视网膜色素上皮（RPE）细胞被分离。若前节附带晶状体，则需分离虹膜上皮（IPE）细胞时，先移除晶状体，然后用精细镊子轻柔地取出含有IPE细胞的虹膜。将虹膜置于培养皿中，并用无菌PBS洗涤。用10号手术刀切割睫状体。虹膜制备完成后，将其与2毫升0.25%胰蛋白酶在37°C下孵育10分钟。去除胰蛋白酶，加入2毫升完全培养基，然后用经火焰抛光的扁平巴斯德吸管刮取细胞以分离细胞。将细胞悬液转移至一个2毫升离心管中，在120 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，用2毫升完全培养基重悬细胞。在6孔板中每孔接种32万个细胞，每孔加入3毫升完全培养基。将培养板放入培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下培养。为了分离视网膜色素上皮（RPE）细胞，使用镊子从眼球后段去除玻璃体和视网膜，注意避免损伤视网膜色素上皮层。用PBS冲洗眼杯。双眼准备就绪后，用胰蛋白酶填充移液球约四分之三满，在37摄氏度下孵育25分钟，将培养皿盖盖在移液球上。吸除胰蛋白酶，加入一毫升完全培养基。使用弯曲且经火焰抛光的巴斯德移液管去除视网膜色素上皮（RPE）细胞。收集球状体内的细胞悬液，转移至1.5毫升离心管中以重新悬浮。在120 ×g 条件下离心细胞10分钟。在6孔板中每孔接种32万个细胞，每孔加入3毫升完全培养基。将培养板放入培养箱，在37°C及5% CO₂条件下培养。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中培养。培养三至四天后，用移液器吹打收集非贴壁细胞，并将一半体积的细胞转移至另一个孔中，再补充完全培养基至1毫升。再过三到四天后，重复进行细胞收集，此次将两个孔中的非贴壁细胞合并到一起。向所有孔中添加培养基。观察细胞，并每周更换两次培养基。当细胞达到汇合状态时，更换为含1%FBS的完全培养基。利用上述方案，已成功从五种不同物种中分离并培养了IPE细胞和RPE细胞。通过RPE65的免疫荧光染色，在原代牛IPE细胞中验证了RPE的表达模式。通过使用市售的细胞毒性检测试剂盒以及未进行电穿孔的对照组，研究了细胞活力以排除电穿孔缓冲液潜在的毒性作用。结果显示对细胞活力无影响。来自不同物种的预培养色素上皮细胞被转染了黄色荧光Venus蛋白。转染的RPE19细胞用作阳性对照。此处展示了预培养的猪RPE中转染效率的定量结果。 freshly isolated rabbit pigment epithelial cells用黄色荧光蛋白Venus进行转染，并通过显微镜进行观察。将色素上皮细胞转染色素上皮衍生因子，并通过蛋白质印迹法监测蛋白质分泌情况。在所研究的所有物种和时间点，转染细胞的信号均高于未转染细胞，且在此期间未观察到蛋白质分泌量下降。必须避免使用锋利工具刮擦细胞。此处使用火焰抛光的巴斯德移液管，但在小鼠的小眼球中必须使用圆形手术刀。色素上皮细胞可用于开发基因治疗策略以及模拟病理状态，例如氧化应激损伤。这些模型也可用于测试治疗性药物。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

哺乳动物原色素上皮细胞的分离、培养和基因工程用于非病毒基因治疗

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分离IPE和RPE细胞：一种从兔眼获取眼色素上皮细胞的技术

在本视频中，我们介绍了一种从猪眼分离虹膜和视网膜色素上皮细胞的技术，以获得这些细胞的原代培养物，用于体内和离体研究。这些色素细胞可进行基因改造，以研究治疗眼部疾病所需的再生医学方法。...

分离IPE和RPE细胞：一种从离体猪眼中获取色素上皮细胞的技术

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从牛眼分离视网膜色素上皮和虹膜色素上皮细胞：一种收获与培养牛原代色素上皮细胞的操作方法

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基于电穿孔技术利用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行遗传修饰

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原代小鼠视网膜色素上皮细胞的分离

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猪视网膜色素上皮细胞的原代培养

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本方案概述了从本地获取的猪眼分离和培养原代视网膜色素上皮（RPE）细胞的步骤。这些细胞可作为干细胞的高质量替代物，适用于 体外...

分离原代猪视网膜色素上皮细胞用于 体外 建模

视网膜色素上皮（RPE）在脉络膜和视网膜之间起着至关重要的屏障作用，有助于维持视网膜细胞类型（如光感受器细胞）的健康与功能。本文中，我们描述了一种简单且有效的成年小鼠RPE分离与培养方案。...

一种简化的小鼠成年视网膜色素上皮细胞分离与培养方法

学习从五种哺乳动物中分离和培养原代虹膜及视网膜色素上皮细胞的方法，利用非病毒SB100X转座子系统进行基因转染。该技术为眼部基因治疗研究提供了高细胞活力和高转染效率的可靠平台。

分离、培养及遗传改造哺乳动物原代色素上皮细胞用于非病毒基因治疗

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