位点导向 的φC31介导的疟疾 按蚊 载体中的整合和盒式交换

该协议支持表征蚊子基因在各种生理途径中的作用，例如，包括昆虫抗性和疟疾寄生虫的发展。该方法驱动转基因插入到单个预先表征的基因组位置，因此允许直接比较由替代转基因产生的表型，从而有效地避免了位置效应的问题。该方法可应用于各种具有公共卫生和农业重要性的昆虫物种，其应用范围从细菌延伸到哺乳动物细胞。

首先设计携带显性荧光标记、attB重组位点和所需转基因货物的 attB 供体质粒。使用单个attB位点整合携带转基因盒的整个质粒或两个倒置的attB位点进行盒交换。使用不含内毒素的纯化试剂盒纯化供体和辅助质粒。

将携带目标转基因的attB标记供体质粒和携带整合原的帮助质粒组合在一起，得到最终浓度为每微升供体质粒350纳克和辅助质粒每微升150纳克的混合物。通过加入0.1体积的三摩尔乙酸钠和2.5体积的冰冷100%乙醇沉淀DNA，然后涡旋。白色沉淀物应立即可见。

洗涤沉淀并将其重悬于注射缓冲液中，以达到每微升500纳克的总终浓度。然后准备每个10-15微升的等分试样，并将其储存在负20摄氏度。在微量注射前72小时，血液从所需的对接线和野生型蚊子中喂养四到七天大的蚊子。

通过以45度角靶向胚胎的后极，在25毫摩尔氯化钠中进行按蚊胚胎微量注射。通过以30度角靶向后极，在卤烃油中进行按蚊胚胎微量注射。注射后立即将鸡蛋转移到装满无菌蒸馏水的培养皿中，并将它们恢复到昆虫状态。

孵化后，每天将G0幼虫转移到装有盐渍蒸馏水的托盘中，并返回蛹。在立体镜下按性别对G0蛹进行排序。允许雄性以三到五组的组在单独的笼子中出现，并添加十倍以上的年龄匹配的野生型雌性。

允许雌性在单独的笼子中出现，每组10至15只，并添加相同数量的年龄匹配的野生型雄性。允许成年人交配四到五天，并为女性提供血餐。收集鸡蛋并培养新兴的下一代G1。

将 G1、L3 和 L4 幼虫收集在衬有湿滤纸的培养皿中或在显微镜载玻片上，并使用荧光立体镜筛选它们，以确定是否存在随 attB 标记的货物引入的标记物。对于单个 attB 设计，筛选是否存在新的和预先存在的标记。对于用于盒式磁带交换的双 attB 设计，筛选新标记的存在和先前存在的标记的丢失。

按性别对转化的G1蛹进行分类，并将其与异性年龄匹配的野生型个体集体交叉。允许成年人交配四到五天，并提供血餐。对于单次整合实验，直接从集体交叉收集卵子。

对于盒交换实验，从单个雌性收集卵子并保持后代分离，直到由于可能存在两个替代盒方向而完成分子评估。筛选G2后代是否存在荧光标记物，并留出G2阳性个体的子集进行分子分析。将其余的抚养到成年。

如文本手稿中所述，使用PCR对插入位点进行分子验证。对于单次整合，确保预测的插入位点携带原始的对接结构，以及两个杂交位点attL和attR之间的供体质粒的整个序列。对于盒式磁带交换，请确保预测的插入站点与坞站的插入站点相同，其中混合倒置 attL 站点替换原始倒置 attP 站点，交换模板替换它们之间最初存在的盒式磁带。

该协议用于在大约10周内产生稳定的按蚊转基因系。通过筛选由3xP3启动子调节的荧光标记物来执行转化的表型验证，如下所示。通过将DS红色标记的盒插入标有CFP的对接线中获得新的按蚊史蒂芬氏体线，这导致G1后代表达眼睛中的红色和蓝色荧光所指示的两种标记物。

盒式交换设计导致最初插入对接线的标记物与供体质粒的标记物的标记物的替换。这种标记交换在冈比亚按蚊对接线中得到了证明，其中CFP标记丢失并且YFP标记获得导致黄眼和神经索荧光。有时，RMCE可以导致单个整合事件，而不是交换所需的转基因盒，其中幼虫用原始CFP和新的YFP标记标记。

在筛选荧光标记物的存在时，将其信号与可能的背景自动荧光区分开来至关重要。增加放大倍率并聚焦于荧光预计将由启动子驱动的组织和器官对于识别真正的CFP阳性个体是必要的。还通过PCR对单个转化子进行分子评估，以确认预期的插入位点。

此处显示了交换冈比亚按蚊线的个体的PCR验证。即使是适当的微量注射技术，供体和辅助质粒的准确设计和制备，以及遵循适当的蚊子饲养方案是获得转基因个体的关键。该程序可用于插入导致基因过度表达或沉默的元素，例如GAL4 / UAS系统，以及用于蚊子遗传控制的基因驱动元件和抗病原体分子。