Name: 位点导向 的φC31介导的疟疾 按蚊 载体中的整合和盒式交换 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 了解利用φC31系统对按蚊进行位点导向基因组修饰的方法，通过微注射胚胎实现转基因盒整合与交换，可在约10周内获得稳定转基因品系，用于研究疟疾抗性相关基因功能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Kiona Parker（加州大学欧文分校）提供了转基因斯氏按蚊（An. stephensi）幼虫的图像，感谢 Fraser Colman（利物浦热带医学院）和 Beth Poulton（利物浦热带医学院）提供了转基因冈比亚按蚊（An. gambiae）幼虫。Beth Poulton（利物浦热带医学院）在对冈比亚按蚊（An. gambiae）幼虫进行成像过程中也提供了宝贵帮助。本研究由遗传与社会塔塔研究所（TIGS）以及授予 A.A. 的利物浦热带医学院主任催化剂基金（DCF2014AA）资助。A.A.J. 是加州大学欧文分校的 Donald Bren 教授。

注：图示方案的示意图工作流程如图所示 图2.
1. 设计带有φC31 attB 标签的质粒（图3）
<ol>
	<li>创建 attB 携带以下必需元件的供体质粒
	<ol>
		<li>显性荧光标记
		<ol>
			<li>选择一个启动子以驱动荧光标记物的表达。 
			注意：对于 按蚊属 转基因，荧光标记通常受以下调控 3xP3 启动子39，可在眼睛和神经索中驱动表达。或者， PUBc 启动子5 当需要在多种组织中表达时可使用此方法。本实验方案中用作示例的供体质粒和对接品系以 3xP3 启动子</li>
			<li>选择一种与受体对接细胞系所用荧光蛋白（FP）相兼容的荧光蛋白，以便能够清晰区分。 
			注意：不要使用与对接位点标记相同的标记物，避免同时使用 GFP（绿色）/YFP（黄色）与 GFP（绿色）/CFP（青色），因为它们极难可靠区分。本方案中用作示例的供体质粒使用 DsRed 或 YFP 标记，因其将被整合到带有 CFP 标记的对接位点中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>attB 重组位点
		<ol>
			<li>使用一个 单个 attB 用于转基因盒（单个）整合的位点attB 设计）（图3A).</li>
			<li>使用 两个倒置的 attB 用于RMCE的位点（双-attB 设计）中，这些位点相互倒置排列，并包围供体DNA模板（图3B). 
			注意：该方向的 attB 位点必须与该位点相容 attP 对接系中存在的位点。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>目的转基因载体
		<ol>
			<li>根据实验的具体目的，使用任何其他希望整合到蚊子基因组中的特征。在此，我们描述了一种抗疟疾效应分子在蚊子基因组中的整合方法。 An. stephensi 以及GAL4/UAS系统各组分的整合 An. gambiae 蚊子。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>质粒骨架组件
		<ol>
			<li>除质粒在细菌中复制所需的其他必需元件外，还包括一种用于体外质粒筛选的标记（即., 一种抗生素抗性基因）。 
			注意：质粒骨架将整合到蚊子基因组的单个位点中。attB 设计用于整合（图 3A），而不会插入双-attB RMCE设计（图3B).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备显微注射混合物所需的质粒
注意：本方案中使用的载体包含两个质粒：一个携带目的转基因且带有attB标签的供体质粒，以及一个表达φC31整合酶的辅助质粒，该整合酶在Drosophila Hsp70启动子调控下表达40。
<ol>
	<li>使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化供体质粒和辅助质粒。 
	注意：对用于注射的最终质粒制备物进行测序，以验证所有组分的完整性。</li>
	<li>将两种质粒按适当比例混合，使其在注射缓冲液中重悬后，供体质粒终浓度为 350 ng/µL，辅助质粒终浓度为 150 ng/µL。 
	注意：计算所需混合物体积时，应考虑到每天计划注射使用 10–15 µL 即可；DNA 可预先配制并储存于 -20 °C。已有文献报道整合酶辅助质粒浓度范围为 60–500 ng/µL，供体质粒浓度范围为 85–200 ng/µL21,22,26,41。</li>
	<li>加入 0.1 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 2.5 体积的冰冻 100% EtOH 沉淀 DNA，并涡旋混匀。应立即可见白色沉淀。初始质粒制备物浓度较高（即约 ~1 µg/µL）可提高沉淀效率。 
	注意：可在此处暂停——沉淀物可在 -20 °C 下保存过夜。</li>
	<li>在 4 °C 下以 15,000 x g 离心 20 分钟，弃去上清液，并用 1 mL 冰冻 70% EtOH 洗涤沉淀。</li>
	<li>用 1 mL 冰冻 70% EtOH 再次洗涤沉淀，并在室温下以 15,000 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液时避免扰动沉淀，然后空气干燥。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1x 注射缓冲液（0.1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7.2, 0.22 µm 滤膜过滤除菌）中，使总终浓度达到 500 ng/µL。 
	注意：假设在沉淀过程中会损失部分 DNA；因此，应先加入较少体积的注射缓冲液，用分光光度计（如 Nanodrop）检测浓度，再加入适量缓冲液调整至 500 ng/µL。</li>
	<li>确保 DNA 完全重悬，分装成每管 10–15 µL，储存于 -20 °C。</li>
	<li>注射当天，取出一份分装样品解冻，并在 15,000 x g 下离心 5 分钟，以去除任何颗粒残留物。 
	​注意：去除颗粒物的另一种方法是通过 0.22 µm 滤膜过滤溶液。应避免注射混合液中存在颗粒残留物，因其会导致胚胎显微注射过程中针头堵塞。</li>
</ol>
3. 来自于一个的胚胎显微注射 按蚊属 系泊绳
<ol>
	<li>在显微注射前72小时，对4至7日龄的所需品系蚊虫进行血液饲喂（例如，若在周一和周二进行注射，则在前一周的周五对雌蚊进行饲喂；若在周四和周五注射，则在当周周一进行雌蚊饲喂）。</li>
	<li>同一天对野生型（WT）蚊子（即与整合位点品系基因组背景相同的蚊子）进行血液饲喂，用于后续的杂交实验。 
	注意：血液餐的体积和质量会影响卵的质量，因此建议始终使用新鲜血液（即., 7天内采集的血液）。使用人臂喂血或小鼠喂血可能提高卵子的质量和数量，但不建议采用这些方法。如需使用人类或动物，必须具备特定的批准方案。</li>
	<li>进行胚胎显微注射
	<ol>
		<li>执行 An. gambiae 在25 mM NaCl中进行胚胎显微注射42 通过以45度角对准胚胎的后极进行。有关胚胎收集、排列和显微注射的详细方案，请参见Pondeville等人的文献。43 和 Lobo 等人44.</li>
		<li>执行 An. stephensi 在卤代烃油700:27（2:1）中进行胚胎显微注射，注射角度为30度，靶向胚胎后极。有关胚胎收集、排列和显微注射的详细方案可参见Terenius等人的研究。45 和 Lobo 等人44.</li>
		<li>注射后立即将卵转移至含有无菌蒸馏水（pH 7.2）的培养皿中，并放回昆虫饲养环境。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵化后，转移 G0 每天将幼虫转移至含有盐蒸馏水（0.1% 张力盐）的培养皿中，饲养至化蛹。</li>
	<li>记录孵化率（即., 孵化幼虫数/注射胚胎数 
	注意：胚胎运动有助于孵化，因此轻柔摇晃是可取的。孵化应在注射后约48小时开始。由于注射可能导致轻微的发育延迟，建议持续监测晚孵化的幼体3至4天。</li>
</ol>
4. 转化个体的杂交与筛选
<ol>
	<li>[可选步骤] 筛选 G0 （注射）1st 或 2nd 龄幼虫（L1-2用于荧光标记物的瞬时表达。
	<ol>
		<li>使用细尖玻璃移液管转移 G0 L1-2 将幼虫移至带孔的载玻片上，每个孔中放置一只幼虫。</li>
		<li>使用配备合适滤光片的荧光体视显微镜，检测荧光标记物的瞬时表达情况。 
		注意：瞬时表达的模式由所使用的启动子决定。当使用 3xP3 启动子，荧光标记物的瞬时表达在肛乳头中可见（参见 图6 在 Pondeville 等人中43)</li>
		<li>后部0 阳性个体分别处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分选 G0 在体视显微镜下按性别分离蛹52.</li>
	<li>将雄性个体以每组3-5只（奠基者家系）分别置于不同笼中饲养，并加入过量10倍的同龄野生型雌性个体。 
	注意：由于雄性可多次交配，提供过量的野生型雌性至关重要，以最大化每只雄性的交配机会。</li>
	<li>将雌性个体以每组10-15只（奠基者家系）分别置于独立笼具中羽化，并加入相同数量的同龄WT雄性。 
	注意：如果昆虫饲养室空间有限，可将雌性蚊虫全部集中在一个笼中羽化。雌雄比例可低至1只雄性对3只雌性。</li>
	<li>让成虫交配4-5天，并为雌虫提供血餐。 
	注意：对 G 进行血液饲喂并收集卵0 多次交配雌性以最大化获得多个生殖周期转化子的机会。</li>
	<li>在同一时间对野生型个体进行血液饲喂以用于杂交。</li>
	<li>收集卵并培育孵化出的下一代 G1s.</li>
	<li>筛选 G1 L3-4 通过适当的荧光筛选幼虫以鉴定转化子。
	<ol>
		<li>将幼虫收集于铺有滤纸的培养皿中或载玻片上，使用配备适当滤光片的荧光体视显微镜观察所引入标记物的存在情况 attB标记的货物 
		注意：由以下因素驱动的荧光 3xP3 启动子在所有胚后发育阶段均可见，因此筛选可在较年轻的幼虫上进行，但这些幼虫更为脆弱，必须相对小心地操作。蛹期也可进行筛选。
		<ol>
			<li>对于单个attB 设计用于整合筛选，以检测新标记和原有标记的存在情况；两者均应存在，因为新的表达盒插入在原有表达盒的邻近位置（图3A, 图4). 
			注意：单一样本的筛查例外 attB 设计：使用无标记对接线时22，仅筛选新标记的存在。当使用整合导致原有标记失活的对接菌株时21, 筛选新标记的存在及原有标记的缺失。</li>
			<li>对于双-attB 设计用于RMCE，筛选新标记的存在以及原有标记的丢失，仅应存在新引入的标记，因为新的表达盒会替换原有的表达盒图3B, 图5). 
			注意：在仅发生单个整合事件的 RMCE 实验中，偶尔可回收到整合事件 attP 重组后两个标记都将存在。对G的筛选1 个体也可在蛹期采用相同步骤进行操作52.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转移转化的G1 将个体放入幼虫培养盘并饲养至化蛹。丢弃无荧光的个体以及标记表达模式异常的个体。</li>
	<li>筛选转化的G1 按性别分离蛹并进行杂交 大规模 与同龄的异性别野生型个体。</li>
	<li>让成虫交配4-5天，提供血餐，收集卵并饲养下一代2 后代
	<ol>
		<li>对于单次整合实验，直接从 大规模 整合位点在所有个体中均相同，因此可进行杂交。</li>
		<li>对于RMCE实验，需从单只雌性个体收集卵子，并将后代单独培养，直至完成分子检测，因为可能存在两种不同的盒式结构方向。图3B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选 G2 后代（幼虫或蛹阶段）中检测荧光标记的存在情况（预期50%个体为阳性），弃去无荧光的后代。</li>
	<li>留出一部分 G2 对分子分析呈阳性的个体进行标记，将其余个体饲养至成虫阶段。 
	注意：如果所有 G2 必须保持个体存活，可对单个成虫的腿部进行分子分析46 或蛹壳DNA提取（L. Grigoraki 个人交流）。或者，可在完成所有G2 个体已产卵且卵已孵化。</li>
	<li>让成年雄性和雌性在同一个笼子中交配，以建立新的转基因品系。 
	注意：对于RMCE实验，成年个体间的杂交必须在来自同一雌性的兄弟姐妹之间进行，直至通过分子分析确定插入方向。</li>
</ol>
5. 通过DNA扩增（PCR）对插入位点进行分子验证
<ol>
	<li>转化后，制备整合位点在染色体中的预测插入位置的图谱。
	<ol>
		<li>单次整合：确保预测的插入位点包含原始的整合载体以及位于两个杂合位点 attL 和 attR 之间的供体质粒完整序列（图3A）。</li>
		<li>RMCE（重组介导的盒式交换）：确保预测的插入位点与整合品系中的位点一致，其中杂合反向的 attL 位点取代了原始的反向 attP 位点，且交换模板取代了原本位于两者之间的表达盒（图3B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计寡核苷酸引物，用于扩增整合位点两侧的插入连接区域。
	<ol>
		<li>单次整合：设计跨越 attR 和/或 attL 位点的寡核苷酸引物对。其中一条引物应结合到先前整合的整合载体序列，另一条则结合到新整合的转基因序列（图3A）。</li>
		<li>RMCE：盒式交换可能相对于染色体以两种不同方向发生（标记为A和B）。设计4条寡核苷酸引物的不同组合，使每种组合仅在一种方向下产生特异性扩增产物，其中一对引物用于鉴定方向A，另一对用于鉴定方向B（图3B，图6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从G2代阳性个体中提取基因组DNA，并进行诊断性PCR及琼脂糖凝胶电泳，以检测预测整合位点图谱中预期的诊断性扩增片段。 
	注：也可从单个成虫的腿部46或蛹壳中提取DNA（L. Grigoraki 个人交流）。</li>
	<li>对PCR产物进行测序，以确认其序列符合预期。</li>
</ol>
<img alt="基因编辑过程；逐步示意图；质粒克隆、显微注射、转基因品系建立" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2. 定点突变实验流程图 φC31 基因组修饰在 按蚊属 蚊子 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="φC31 整合示意图，展示基因转移过程；单次整合与 RMCE 方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3。φC31介导的单次整合（A）和 RMCE（B）的分子基础。 A) 在携带单个attP位点并以 CFP 标记的An. stephensi停泊品系（80.9，表1）中基因组插入的示意图（上图），带有 DsRed 标记的单-attB设计供体质粒（中图），以及成功整合后预期的插入位点（下图）。B) 在携带两个反向attP位点并以 CFP 标记的An. gambiae停泊品系（A11，表1）中基因组插入的示意图（上图），带有 YFP 标记的双-attB设计供体质粒（中图），以及成功 RMCE 后预期的插入位点（下图）。波浪线：蚊子基因组；条纹箭头：piggyBac转座子末端；3xP3：荧光标记物的启动子；SV40：病毒终止子；Ori：复制起点；AmpR：氨苄青霉素抗性基因。交叉线表示attP与attB位点之间的重组位点。编号的黑色箭头代表用于插入位点分子验证的引物结合位点（方案步骤5）。完整注释的单-和双-attB标记质粒可应要求向作者索取。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

作者无任何利益冲突需要披露。

准确设计与所选整合品系相容的attB标记质粒，对实验成功至关重要。在选择用于筛选转化子的标记时需仔细考虑，包括荧光颜色及其表达模式，后者将受到整合品系中已有表达模式的限制。必须使用易于区分的荧光标记：良好的标记组合包括RFP（红色）/CFP（青色）、RFP（红色）/GFP（绿色）、RFP（红色）/YFP（黄色）以及YFP（黄色）/CFP（青色）；应避免的组合为YFP（黄色）/GFP（绿色）和CFP（青色）/GFP（绿色）。3xP3启动子39特异性驱动眼睛和神经索中的表达，是蚊子转基因研究中最常用于驱动荧光标记表达的启动子。事实上，目前所有可用的Anopheles整合品系均使用该启动子。其他可选的调控区域包括An. gambiae多聚泛素基因（PUBc）5或病毒启动子IE120，它们可在多种组织中驱动表达。若与3xP3联合使用，这些启动子可扩展可能的荧光颜色组合，甚至实现同一荧光蛋白的重复利用。上述启动子在整个蚊子生命周期中均具有活性，因而可在所有发育阶段进行筛选和荧光监测。质粒设计中的另一个考虑因素是待整合或替换的外源片段大小。尽管φC31系统具有显著的承载能力18，但仍需注意供体质粒的大小通常与转化效率呈负相关22。
在所述方案中，整合酶来源于一种辅助质粒，该质粒普遍表达该酶40整合酶的普遍存在可能导致体细胞发生转化，如果显微注射未能精确定位至生殖系形成区域。尽管此类转化事件因不可遗传而最终丢失，但体细胞效应可能降低注射个体的适合度。为避免此问题并提高转化效率，可将整合酶的表达限制在生殖系中，例如通过使用 vasa 启动子22,26. 其他方案描述了使用 体外 转录的信使RNA（mRNA）作为来源 φC31 整合酶19,24,43然而，这种方法需要繁琐的mRNA制备过程，并且必须小心处理注射混合物，使用无RNase的试剂以避免降解。已有研究证实，质粒来源的整合酶在两者中均有效 An. gambiae9,21,22,26,33,37 和 An. stephensi （A.A. 个人交流）具有可靠性和高效的转化效果，因此是我们首选的方法。另一种整合酶递送方案是其 体内 自交辅助系中的生产。此类品系已在 An. gambiae 表达 φC31 在生殖系特异性启动子调控下的整合酶 纳米颗粒 并被发现可提高存活率和转化效率20然而，由...施加的潜在适应度负荷 体内 辅助细胞系中整合酶的产生必须予以考虑。
与其他转基因技术一样，必须特别注意由注射后胚胎发育而来的个体的饲养和杂交，以最大限度地提高获得转基因个体的几率。稳定遗传了外源基因的个体最早可在G1代子代中获得。然而，当使用3xP3启动子时，可通过观察G0代一龄和二龄幼虫肛乳突和/或神经索中荧光标记基因的瞬时附加体表达，来初步判断潜在的转化情况43。尽管瞬时荧光的出现表明质粒已成功递送，但这并不能保证外源基因已整合至生殖系并可遗传；同样，缺乏瞬时表达也不能排除成功转化的可能性。然而，已有观察表明，瞬时表达呈阳性的个体比瞬时表达阴性的个体更有可能产生转基因后代43,48。在经验丰富的操作者手中，仅饲养和杂交阳性个体可能是一种减少蚊虫数量的可行策略。但考虑到G0代幼虫数量少且十分脆弱，仍建议尽量减少操作，始终推荐对所有G0代个体进行饲养。
本方案中报道的交配方案旨在最大化交配成功率，并分离独立的转化事件。然而，如果昆虫饲养空间或人员配备有限，可将 G0 成虫按性别分别集中饲养于单个笼中，前提是提供足量的异性个体。这种设置将无法区分来自同一笼中个体的多个转化事件。根据实验设计的不同，在筛选过程中预期会出现双标记（单次整合）或单标记（RMCE）。在单次整合实验中，重要的是验证染色体停靠品系中原有标记的存在；而在 RMCE 实验中，则需验证先前整合的标记已丢失。实际上，在 RMCE 设计中，由于仅有一个 attP 位点发生重组，导致发生单次整合而非位点交换的情况并不少见9,33。在此类个体中，两个荧光标记均存在，且整个供体质粒骨架也保留在基因组中，因此对两个荧光标记进行全面筛选显得尤为重要。
尽管预期荧光模式的存在表明转化成功，但仍需对插入位点进行分子表征。为此，准确绘制预测插入位点的图谱，包括整合位点侧翼的基因组区域，对于设计合适的诊断性寡核苷酸引物以进行基因扩增分析至关重要。单次整合事件会在新插入的DNA与先前插入的表达盒之间的连接处形成attR和attL杂交位点，这些位点可用于插入位点的验证。在RMCE设计中，供体表达盒相对于基因组位点可有两种不同的插入方向，因此可使用四种引物通过不同的PCR组合来检测该品系所携带的插入方向。由于表达盒的插入方向可能影响转基因的表达，在进行基因表达比较分析时，使用具有相同插入方向的品系尤为重要。
当转化子数量较少时，可能不宜牺牲整个个体用于分子分析。一种替代方案是从单个成虫的腿部提取DNA进行分子分析46，因为失去腿部不会影响成年雌虫的交配和产卵能力49。然而，在去除腿部的过程中存在损伤个体的风险。已有研究尝试使用废弃的蛹壳（L. Grigoraki 个人通讯），但最安全的方法是在获得可育的 G3 后代后，对 G2 亲本进行分子分析。
近年来，CRISPR/Cas9 技术彻底改变了位点特异性基因组编辑的方式26,41,50,51。与位点特异性 RMCE 不同，CRISPR/Cas9 介导的基因整合（敲入）无需预先插入重组位点，仅需一步转化即可完成。然而，CRISPR/Cas9 系统依赖于目标插入位点两侧存在足够长的已知基因组序列，以实现成功的同源定向修复，同时还依赖于向导 RNA 介导的高效位点识别。这些条件并不总能满足，或可能需要耗费大量精力进行优化。鉴于在An. gambiae 和An. stephensi 及其衍生品系中已存在多个整合位点品系，φC31 系统仍然是在同一基因组位置进行转基因直接表型比较的重要工具。

可靠且可重复地对疾病传播媒介蚊虫的基因组进行修饰的能力已得到加强 体内 基因的功能验证，并为可实现的遗传载体控制策略打开了大门，例如针对 按蚊属 传播疟疾的蚊子1.
早期的蚊子基因组编辑完全依赖转座元件（TE）介导的转化，其中 piggyBac 是在 Anopheles2,3,4 中最常用的转座子。然而，TE 整合具有随机性，可能导致非预期的修饰，例如基因敲除（插入诱变）以及对转基因表达产生显著的位置效应5,6,7,8。使用 piggyBac 时还常出现多个插入事件5,9，这使得单插入转基因品系的验证与分离工作变得繁琐。其他缺点还包括其潜在的再动员能力，例如在提供 piggyBac 转座酶来源时，已在 Anopheles stephensi 的生殖系中观察到此类现象10,11,12，以及其对携带 DNA 片段大小的限制（长度为 10–15 kb），且随着供体质粒尺寸增大，转化效率会下降13,14。
位点特异性整合技术的引入旨在克服这些问题。在蚊子中，最常见的位点特异性基因组修饰是由 φC31 系统图1a）。这是由一种病毒整合酶驱动的，该酶催化两个异源特异性附着（att) 在噬菌体基因组中天然存在的位点 φC31 (attP）以及在 Streptomyces 细菌宿主attB)15. 两个位点之间的重组是单向的，并导致杂合位点的形成（attL 和 attR）。此类杂交位点的重组（导致DNA切除）不仅需要有活性的病毒整合酶，还需要另一种由噬菌体编码的重组因子16,17因此产生了一个稳定的整合位点，从而解决了潜在的非预期再动员问题15此外，该系统允许整合大分子载荷（例如，整合 &gt;100 kb 的构建体已有报道 D. melanogaster18），显著提高了承载能力。整合发生在单一预定义的基因组位点，这极大地简化了插入验证以及获得稳定转基因品系的杂交方案。此外，由于整合具有位点特异性，不同转基因位于同一基因座，处于相同的邻近基因组环境中，因而可实现表达水平的归一化。事实上，该技术的主要应用之一就是在相同基因座插入不同转基因后，直接比较其所赋予的表型差异。
实现φC31介导的整合包含两个阶段：第一阶段是创建携带attP位点的转基因停泊品系，第二阶段是将两侧带有attB序列的外源基因片段定点整合到停泊品系的基因组中19。第一阶段停泊品系的构建依赖于转座子（TE）介导的attP标记载体的随机整合，因此需要进行初始的繁琐筛选过程（包括对单雌后代进行Southern印迹和反向PCR分析），以分离并验证在基因组中唯一、转录活跃且对适合度无影响的位点上发生单一位点整合的转基因品系。尽管如此，目前已在An. gambiae19,20,21,22和An. stephensi23,24,25中开发并验证了多个适用于φC31介导单一位点整合的停泊品系（表1）。这些品系在停泊位点的基因组位置、品系特异的遗传背景方面各不相同，由此可衍生出多种新的转基因品系。目前，借助CRISPR/Cas9技术可绕过传统转座子介导整合构建停泊品系时所需的复杂验证过程26；但该方法依赖于事先对中性插入位点及其侧翼序列的了解。
φC31介导的整合已广泛应用于昆虫基因组编辑，从模式生物D. melanogaster27，到蚊子Aedes aegypti13,28、Ae. albopictus29、An. gambiae19和An. stephensi24，以及其他昆虫如Ceratitis capitata30和Bombyx mori31。 
一个局限性是 φC31介导的整合，尤其是在考虑用于媒介控制的潜在野外释放时，指的是整个序列在蚊子基因组中的整合 attB携带供体质粒，其中包含不理想的序列，如抗生素抗性基因标记和细菌来源的质粒骨架成分。为解决这一问题，对标准系统进行了改进，采用重组酶介导的盒式交换（RMCE），可实现将先前整合的转基因盒精确替换为新的供体DNA图1b）。这是通过使用两个倒置的 att 供体和受体盒两端均带有侧翼位点，可驱动两个独立的重组事件同时发生，从而实现盒式结构的交换，且不整合质粒骨架。该优化设计避免了非预期序列的插入，拓展了其应用范围 φC31 系统可包括通过筛选先前整合的荧光标记的丢失，来实现无标记DNA货物的整合32.
RMCE 最初在 D. melanogaster32 中实现，随后成功应用于包括 An. gambiae9,26,33、Ae. aegypti34、Plutella xylostella34 和 B. mori35 在内的非模式昆虫。已在 An. gambiae5,9,26 中建立并验证了多个用于 RMCE 的定点整合细胞系（表 1）。据我们所知，RMCE 在其他按蚊（Anopheles）传播媒介物种中尚未被探索。
迄今为止，φC31 系统已广泛应用于Anopheles蚊子中，用于引入并研究多种分子，包括抗疟效应分子19,24,36、GAL4/UAS系统的组分以在杀虫剂抗性研究中过表达或敲低基因9,33、调控元件、报告基因5,21,37以及基因驱动元件26,38。
本方案描述了如何在Anopheles停靠品系基因组中实现：1）attB侧翼载体的定点整合；以及2）由反向attB位点侧翼的构建体的RMCE（重组介导的盒式交换）。该过程使用两种质粒完成：一种是携带目的转基因的供体质粒，其带有attB标签；另一种是表达φC31整合酶的辅助质粒。以主要疟疾传播媒介An. gambiae和An. stephensi作为具体示例，但本方案同样适用于其他Anopheles物种。
<img alt="φC31整合，公式attP-attB，基因修饰中质粒整合过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1定点基因组修饰、单一位点整合以及利用重组酶介导的盒式交换（RMCE） φC31 系统。 的 φC31 整合酶（INT，灰色双箭头）催化介导了两者之间的重组反应 attB 位点（紫色条纹）存在于供体质粒中以及 attP 存在（蓝色条纹）位点的接收对接线，导致杂合位点的形成 attL 和 attR. A) 当单个 attB 和 attP 位点发生重组，导致两个整合标记（蓝色和红色）同时存在。B）当两个 attB/P位点同时发生重组，导致两个/P位点之间的盒式结构被替换 att 对接线位点（蓝色标记）与供体质粒所携带位点（红色标记）的部分核苷酸序列。 attP （蓝色）和 attB （紫色）和杂交位点 attL/R重组发生在以粗体黑色标出的“TT”核心序列之间。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8孔微型载玻片</td><td>VWR</td><td>MARI1216690</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>内毒素清除&amp;nbsp;质粒&amp;nbsp;马克斯&amp;nbsp;试剂盒（10）</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，纯度，分子生物学级</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ FLIII 用 CFP 滤光片组 激发 436/20 nm，发射 480/40 nm</td><td>Leica</td><td>10446363</td><td></td></tr><tr><td>滤光片组 dsRED，适用于 Leica MZ FLIII，激发光波长 545/30 nm，发射光波长 620/60 nm</td><td>Leica</td><td>10447079</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ FLIII 专用YFP滤光片组</td><td>Omega Optical</td><td>500QM25, 500QM35</td><td></td></tr><tr><td>卤代烃油 27</td><td>Sigma</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>卤代烃油 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钾&amp;nbsp;氯离子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钠&amp;nbsp;乙酸盐&amp;nbsp;溶液（3 M），&amp;nbsp;pH&amp;nbsp;5.2</td><td>赛默飞世尔科技（生命技术公司）</td><td>R1181</td><td></td></tr><tr><td>稳定画笔，尺寸 0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

定点 φc31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

功能基因组学分析及相关疟疾遗传控制策略依赖于经过验证且可重复的方法，以准确修饰基因组 按蚊属 蚊虫。在这些方法中， φC31 系统可实现外源基因的精确定点稳定整合，或通过重组酶介导的盒式交换（RMCE）替换已整合的转基因盒式结构。该方法依赖于重组酶的作用 链霉菌φC31 噬菌体整合酶以催化两个特异性附着位点之间的重组，这两个位点被指定为 attP （源自噬菌体）和 attB （源自宿主细菌）。该系统使用一个或两个 attP 先前已整合到蚊子基因组中的位点 attB 供体模板DNA中的位点。本文展示了如何稳定地修饰基因组 attP携带 按蚊属 使用两个质粒进行对接：一个 attB携带整合或交换模板的标记供体质粒和编码辅助蛋白的辅助质粒 φC31 整合酶。我们报告了两个代表性结果 φC31介导的定点修饰：转基因盒的单一位点整合 An. stephensi 和 RMCE 在 An. gambiae 蚊子。 φC31介导的基因组操作具有可在经过验证且对生物体适应性无影响的基因组位点实现可重复的转基因表达的优势，从而能够对表型进行定性和定量的比较分析。这种定点整合的特性还大大简化了单一位点插入的验证工作以及获得稳定转基因品系所需的杂交方案。这些及其他特性使得 φC31 系统是转基因改造疟疾蚊子及其他昆虫媒介遗传工具包中的一个基本组成部分。

本方案可在约10周内建立稳定的Anopheles转基因品系（假设蚊子的生活周期为21天）。
An. gambiae 注射后幼虫的孵化率通常低于 An. stephensi，但已有文献报道其孵化率在 10–50% 之间9,20,24,26,33,43,47。若注射技术得当，孵化率 ≥20% 通常足以获得转基因个体。可通过检测幼龄幼虫中荧光标记物的瞬时表达来评估胚胎对 DNA 的摄取情况。在使用 3xP3 启动子进行的 An. gambiae 成功 RMCE 实验中，最多有 50% 的存活 G0 幼虫在肛乳突中显示出标记基因的附加体表达48。
由于转化效率受到多种变量的复杂相互作用影响，包括注射DNA的纯度、浓度、大小及其潜在毒性、卵的质量、注射前后的卵处理、蚊虫饲养条件，以及最重要的是操作人员的经验，因此在不同实验室之间甚至不同实验之间对转化效率进行泛化评估十分困难。An. gambiae中位点特异性重组介导的染色体整合（RMCE）的转化率最高可达7%（以G0代个体中独立转化事件的数量计算）9,26,33，而在An. stephensi中整合的转化率最高可达2.2%。我们建议至少注射500枚胚胎，这应能导致至少100只G0幼虫孵化，并获得2至7只G0成虫创始个体，从中可获得稳定转化的后代。若对G0幼虫进行瞬时表达的筛选，预计最多可获得40只阳性幼虫。
通过筛选由荧光标记调控的转化进行表型验证的示例 3xP3 启动子被报道在 图4 和 图5. 图4 展示了一种新的 An. stephensi 通过将带有 DsRed 标记的盒式结构插入带有 CFP 标记的停靠品系（80.9， 表1)，从而产生G1 子代在眼部检测到红色和蓝色荧光，表明同时表达了两种标记。
预计RMCE设计将导致供体质粒的标记替换最初插入到着陆位点品系中的标记。图5A和 图5B展示了在标记有CFP的冈比亚按蚊（An. gambiae）着陆位点品系（A11，表1）中发生的这种标记交换：成功进行RMCE后，CFP标记丢失，获得YFP标记，从而产生黄色（而非蓝色）的眼睛和腹神经索荧光33。偶尔，RMCE可能导致单次整合事件，而非预期转基因盒的交换，如图5C所示，图中展示了一头同时带有原始CFP标记和新YFP标记的幼虫。据报道，最多可达全部转化事件总数的50%为单次整合事件9, 33。
在筛选荧光标记物时，关键是要将其信号与可能存在的背景自发荧光区分开来。这一点在使用CFP时尤为重要 按蚊属 幼虫表现出天然的蓝色自发荧光（图6A）。有必要提高放大倍数，并聚焦于预期由启动子驱动荧光的组织和器官，以识别真正的CFP阳性个体，如图所示 图6B 使用 3xP3-CFP 标记
最终通过PCR对单个转化子进行分子检测，以确认预期的插入位点。图7展示了来自一个基因交换型An. gambiae品系个体的PCR验证结果，显示了外源片段在蚊子基因组中的两种可能插入方向33。
<img alt="通过彩色显微镜图像观察基因编辑过程中φC31的整合；分析对接品系效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图 4验证 φC31 单次整合 An. stephensi 幼虫（背侧观）。 A) 挂锁品系（80.9，表1）在眼组织中表达CFP，其表达受 3xP3 启动子。B) 成功整合导致新获得的DsRed以及原始CFP标记物在眼睛中表达。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="φC31 基因编辑；荧光显微镜；RMCE 过程；基因整合结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5．在冈比亚按蚊（An. gambiae）幼虫中对φC31介导的RMCE进行验证（腹面观）。A）整合位点品系（A10，表1）在3xP3启动子调控下于眼部（e）和神经索（nc）表达CFP5。B）成功的RMCE导致荧光标记由CFP替换为YFP33。C）RMCE实验中发生单次整合事件，该转基因幼虫同时表达CFP和YFP标记。此幼虫携带GAL4/UAS元件，导致YFP广泛表达，尤其在腹部肌肉（am）中表达较强。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CFP荧光分析示意图，显示在蓝光激发下CFP标记和CFP阳性标记的生物体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6. CFP 自发荧光在 An. gambiae 幼虫（背侧视图）。 A) 阳性（CFP+）与阴性（CFP-）L 的并列图像4 幼虫的CFP滤光片图像。B) 幼虫眼睛的放大图像，显示CFP+ 与 CFP-个体 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="PCR分析凝胶图像显示方向A和B的DNA条带模式及相应的遗传图谱" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7转基因株系中插入盒方向的分子验证 An. gambiae 由 φC31 RMCE 转基因盒相对于插入位点可插入两种不同的方向（A 或 B）。每个 PCR 反应（I - IV）使用一组引物组合（5-8）33 旨在为每种插入方向提供相应的诊断性扩增片段，具体方向如示意图中的质粒图谱所示。T1：携带插入方向A的代表性转基因个体；T2：携带插入方向B的代表性转基因个体；WT：野生型；DL：对接系；-：以水作为模板的反应阴性对照。该图已根据Adolfi等（2019）修改。33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物种</td>
			<td>菌株</td>
			<td>名称</td>
			<td>attP(s)</td>
			<td>染色体</td>
			<td>启动子-标记物</td>
			<td>来源机构</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An. stephensi</td>
			<td>印度a</td>
			<td>26.10b</td>
			<td>单次</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>加州大学欧文分校</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An. stephensi</td>
			<td>印度a</td>
			<td>44Cb</td>
			<td>单个</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>加利福尼亚大学欧文分校</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An. stephensi</td>
			<td>印度a</td>
			<td>80.9b</td>
			<td>单个</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>加州大学欧文分校</td>
			<td>本研究</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>单次</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>加州大学欧文分校</td>
			<td>本研究</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An. gambiae</td>
			<td>KIL</td>
			<td>Ec</td>
			<td>单个</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>基尔大学</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>X1</td>
			<td>单个</td>
			<td>2L</td>
			<td>无标记物</td>
			<td>斯特拉斯堡大学</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>单个</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>伦敦帝国理工学院</td>
			<td>21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b</td>
			<td>双倍</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>利物浦热带医学院</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b</td>
			<td>双倍</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>利物浦热带医学院</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">a. 约翰斯·霍普金斯大学菌株（M. Jacobs-Lorena 惠赠），于加州大学欧文分校保种培养 &gt;20年。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">b. 这些细胞系可根据合理要求向作者索取。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">c. 该菌株可从 BEI 资源库 www.beiresources.org 获取，编号为 MRA-1163。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. Anopheles attP 整合位点细胞系。

该方案描述了如何在基因组中实现定点修饰 按蚊属 疟疾蚊子使用 φC31 系统。所描述的修饰包括基因组中转基因盒的整合与置换 attP带缆绳的对接线。

定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

功能基因组学分析及相关疟疾遗传控制策略依赖于经过验证且可重复的方法，以准确修饰……

本方案有助于表征蚊子基因在多种生理通路中的作用，例如昆虫抗性及疟原虫发育过程。该方法可将转基因插入已预先明确的单一基因组位点，从而能够直接比较不同转基因所导致的表型差异，有效避免位置效应带来的干扰。该方法可应用于多种具有公共卫生和农业重要性的昆虫物种，其应用范围广泛，可从细菌延伸至哺乳动物细胞。首先设计携带显性荧光标记、attB 重组位点和目标转基因片段的 attB 供体质粒。使用单个 attB 位点整合携带转基因表达盒的完整质粒，或使用两个反向排列的 attB 位点实现表达盒的置换。使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化供体和辅助质粒。将携带目的转基因的 attB 标记供体质粒和携带整合酶的辅助质粒混合，得到终浓度为每微升 350 纳克供体质粒和每微升 150 纳克辅助质粒的混合物。加入 0.1 体积的 3 摩尔醋酸钠和 2.5 体积的冰冻 100% 乙醇沉淀 DNA，然后涡旋振荡。应立即可见白色沉淀物。将沉淀洗涤后重悬于注射缓冲液中，使其最终总体浓度达到每微升500纳克。然后将溶液分装为每份10-15微升，于-20摄氏度保存。在显微注射前72小时，对目标整合品系及相应的野生型4至7日龄蚊虫进行血液饲喂。在25毫摩尔氯化钠溶液中，以45度角对冈比亚按蚊胚胎的后极进行显微注射。在卤代烃油中，以30度角对斯氏按蚊胚胎的后极进行显微注射。注射后立即把卵转移到盛有无菌蒸馏水的培养皿中，并放回昆虫饲养环境。孵化后，每天将G0幼虫转移至含有盐蒸馏水的培养皿中，并饲养至化蛹。在体视显微镜下按性别对G0蛹进行分选。将雄蛹放入独立的笼中，每笼三至五只，使其羽化，并加入十倍数量的同龄野生型雌虫。将雌虫按每组10至15只分别置于不同笼中，并加入同等数量的同龄野生型雄虫。让成虫交配4至5天，并为雌虫提供血餐。收集卵并饲养孵化出的下一代G1代个体。在铺有湿润滤纸的培养皿或载玻片上收集 G1、L3 和 L4 幼虫，并使用荧光体视显微镜检测随 attB 标记载体引入的标记物。对于单 attB 设计，需筛选新标记物和原有标记物的存在；对于用于盒式交换的双 attB 设计，需筛选新标记物的存在以及原有标记物的缺失。按性别分选转基因G1蛹，并与同龄野生型异性别个体进行大规模杂交。让成虫交配4至5天，并提供血液餐。对于单一位点整合实验，直接从大规模杂交中收集卵。对于盒式交换实验，从单只雌性个体收集卵，并将后代分开培养，直至完成分子检测，因为可能存在两种不同的盒式结构方向。对G2代后代进行荧光标记的筛选，并保留一部分G2代阳性个体用于分子分析。将其余个体培育至成虫阶段。按照文稿中所述方法，通过 PCR 对插入位点进行分子验证。对于单次整合，需确认预测的插入位点包含原始的定位载体结构，并且在两个杂交位点 attL 和 attR 之间完整存在供体质粒的序列。对于盒式交换，需确认预测的插入位点与定位品系一致，其中杂交反向 attL 位点取代了原有的反向 attP 位点，且交换模板取代了原先位于两者之间的盒式结构。该方案用于在约10周内建立稳定的按蚊转基因品系。通过筛选由3xP3启动子调控的荧光标记物，对转化的表型进行了验证，结果如图所示。通过将带有DS红标记盒的片段插入到带有CFP标记的定点整合品系中，获得了新的斯氏按蚊品系，其G1代子代在眼部同时表达两种标记，表现为红色和蓝色荧光。盒式交换设计可导致供体质粒的标记替换最初插入到对接品系中的标记。这一标记交换已在冈比亚按蚊对接品系中得到验证，其中CFP标记丢失，获得了YFP标记，从而产生黄色眼睛和神经索荧光。偶尔，RMCE可能导致单个整合事件，而非预期转基因盒的交换，此时幼虫同时带有原始的CFP标记和新的YFP标记。在筛选荧光标记的存在时，关键是要将标记的信号与可能存在的背景自发荧光区分开来。需要提高放大倍数，并聚焦于由启动子驱动荧光表达的组织和器官，以准确识别真正的CFP阳性个体。此外，还通过PCR对各个转化子进行分子水平评估，以确认预期的插入位点。此处展示了对交换型冈比亚按蚊品系个体进行的PCR验证。即使采用适当的显微注射技术，供体质粒和辅助质粒的精确设计与制备，以及遵循恰当的蚊虫饲养方案，对于获得转基因个体至关重要。该方法可用于插入导致基因过表达或沉默的元件，例如GAL4/UAS系统，以及用于蚊虫遗传控制的基因驱动元件和抗病原体分子。

site-directed-c31-mediated-integration-cassette-exchange-anopheles

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

位点导向 的φC31介导的疟疾 按蚊 载体中的整合和盒式交换

斯氏按蚊是分布在印度及整个亚洲的疟疾传播媒介。本视频展示了对该蚊种进行显微注射的技术，通过导入可使蚊子对疟疾产生抗性的外源基因。本视频所展示的大部分方法同样适用于其他蚊种的显微注射技术。...

显微注射斯氏按蚊胚胎以培育抗疟疾蚊子

本文介绍了一种将目标外源DNA快速高效地整合到预制受体菌株（称为着陆垫菌株）中的方法。该方法通过接合及ΦC31整合酶的表达，实现DNA表达盒在特定工程化着陆垫位点上的定点整合。...

位点特异性细菌染色体工程：φC31 整合酶介导的盒式交换（IMCE）

在三种蚊子属中，即 按蚊属， 伊蚊，以及 库蚊，物理基因组作图技术仅建立于 按蚊属，其成员具有可读的多线染色体。对于属的 伊蚊属 和...

蚊子有丝分裂染色体上的荧光原位杂交

在本视频中，我们通过显微注射展示了在Anopheles胚胎中利用phiC31介导的位点特异性外源基因整合技术。该方法有助于将目的基因导入宿主系统，用于科研与工业应用。...

phiC31整合酶介导的定点转基因整合：一种用于将转基因特异性整合至基因组位点的显微注射技术 按蚊属 载体

传播疟疾的蚊子具有一些重要的流行病学特征，这些特征只能通过分子技术进行检测。我们利用基于 MALDI-TOF 的 SNP...

一种用于检测传播疟疾蚊虫的多指标检测方法

通过注入微珠，该技术可激活蚊虫血淋巴循环系统中的黑色素化反应。解剖后，可通过测量覆盖在微珠表面的黑色素量来评估免疫反应强度。...

接种 Anopheles gambiae 利用微珠诱导并测量蚊子黑色素化免疫反应

高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊

本文报告的方案展示了在实验室封闭的小型笼具试验中评估用于病媒控制的基因工程蚊子性能的三种替代方法。每种方案均根据蚊子品系所携带的特定修饰（基因驱动或非基因驱动）以及所测量参数的类型进行定制。...

小型笼具中对基因工程按蚊的实验室试验

显微注射技术对于将外源基因导入蚊子基因组至关重要。本方案介绍了James实验室用于向Anopheles...

Anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

通过细菌产生的双链RNA（dsRNA）进行口服给药，是一种常用于Caenorhabditis...

有效的口服RNA干扰（RNAi）给药至成年Anopheles gambiae蚊子

标准膜饲法（SMFA）被认为是评估和鉴定潜在抗疟化合物的金标准。该人工饲喂系统用于感染蚊子，以进一步评价这些化合物对Plasmodium...

标准膜饲法检测 恶性疟原虫 感染 按蚊属 蚊媒

了解利用φC31系统对按蚊进行位点导向基因组修饰的方法，通过微注射胚胎实现转基因盒整合与交换，可在约10周内获得稳定转基因品系，用于研究疟疾抗性相关基因功能。

定点 φC31介导的整合与盒式交换按蚊属疟疾的传播媒介

探索更多视频

定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

探索更多视频

定点 φC31介导的整合与盒式交换按蚊属疟疾的传播媒介