定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

本方案有助于表征蚊子基因在多种生理通路中的作用，例如昆虫抗性及疟原虫发育过程。该方法可将转基因插入已预先明确的单一基因组位点，从而能够直接比较不同转基因所导致的表型差异，有效避免位置效应带来的干扰。该方法可应用于多种具有公共卫生和农业重要性的昆虫物种，其应用范围广泛，可从细菌延伸至哺乳动物细胞。

首先设计携带显性荧光标记、attB 重组位点和目标转基因片段的 attB 供体质粒。使用单个 attB 位点整合携带转基因表达盒的完整质粒，或使用两个反向排列的 attB 位点实现表达盒的置换。使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化供体和辅助质粒。

将携带目的转基因的 attB 标记供体质粒和携带整合酶的辅助质粒混合，得到终浓度为每微升 350 纳克供体质粒和每微升 150 纳克辅助质粒的混合物。加入 0.1 体积的 3 摩尔醋酸钠和 2.5 体积的冰冻 100% 乙醇沉淀 DNA，然后涡旋振荡。应立即可见白色沉淀物。

将沉淀洗涤后重悬于注射缓冲液中，使其最终总体浓度达到每微升500纳克。然后将溶液分装为每份10-15微升，于-20摄氏度保存。在显微注射前72小时，对目标整合品系及相应的野生型4至7日龄蚊虫进行血液饲喂。

在25毫摩尔氯化钠溶液中，以45度角对冈比亚按蚊胚胎的后极进行显微注射。在卤代烃油中，以30度角对斯氏按蚊胚胎的后极进行显微注射。注射后立即把卵转移到盛有无菌蒸馏水的培养皿中，并放回昆虫饲养环境。

孵化后，每天将G0幼虫转移至含有盐蒸馏水的培养皿中，并饲养至化蛹。在体视显微镜下按性别对G0蛹进行分选。将雄蛹放入独立的笼中，每笼三至五只，使其羽化，并加入十倍数量的同龄野生型雌虫。

将雌虫按每组10至15只分别置于不同笼中，并加入同等数量的同龄野生型雄虫。让成虫交配4至5天，并为雌虫提供血餐。收集卵并饲养孵化出的下一代G1代个体。

在铺有湿润滤纸的培养皿或载玻片上收集 G1、L3 和 L4 幼虫，并使用荧光体视显微镜检测随 attB 标记载体引入的标记物。对于单 attB 设计，需筛选新标记物和原有标记物的存在；对于用于盒式交换的双 attB 设计，需筛选新标记物的存在以及原有标记物的缺失。

按性别分选转基因G1蛹，并与同龄野生型异性别个体进行大规模杂交。让成虫交配4至5天，并提供血液餐。对于单一位点整合实验，直接从大规模杂交中收集卵。

对于盒式交换实验，从单只雌性个体收集卵，并将后代分开培养，直至完成分子检测，因为可能存在两种不同的盒式结构方向。对G2代后代进行荧光标记的筛选，并保留一部分G2代阳性个体用于分子分析。将其余个体培育至成虫阶段。

按照文稿中所述方法，通过 PCR 对插入位点进行分子验证。对于单次整合，需确认预测的插入位点包含原始的定位载体结构，并且在两个杂交位点 attL 和 attR 之间完整存在供体质粒的序列。对于盒式交换，需确认预测的插入位点与定位品系一致，其中杂交反向 attL 位点取代了原有的反向 attP 位点，且交换模板取代了原先位于两者之间的盒式结构。

该方案用于在约10周内建立稳定的按蚊转基因品系。通过筛选由3xP3启动子调控的荧光标记物，对转化的表型进行了验证，结果如图所示。通过将带有DS红标记盒的片段插入到带有CFP标记的定点整合品系中，获得了新的斯氏按蚊品系，其G1代子代在眼部同时表达两种标记，表现为红色和蓝色荧光。

盒式交换设计可导致供体质粒的标记替换最初插入到对接品系中的标记。这一标记交换已在冈比亚按蚊对接品系中得到验证，其中CFP标记丢失，获得了YFP标记，从而产生黄色眼睛和神经索荧光。偶尔，RMCE可能导致单个整合事件，而非预期转基因盒的交换，此时幼虫同时带有原始的CFP标记和新的YFP标记。

在筛选荧光标记的存在时，关键是要将标记的信号与可能存在的背景自发荧光区分开来。需要提高放大倍数，并聚焦于由启动子驱动荧光表达的组织和器官，以准确识别真正的CFP阳性个体。此外，还通过PCR对各个转化子进行分子水平评估，以确认预期的插入位点。

此处展示了对交换型冈比亚按蚊品系个体进行的PCR验证。即使采用适当的显微注射技术，供体质粒和辅助质粒的精确设计与制备，以及遵循恰当的蚊虫饲养方案，对于获得转基因个体至关重要。该方法可用于插入导致基因过表达或沉默的元件，例如GAL4/UAS系统，以及用于蚊虫遗传控制的基因驱动元件和抗病原体分子。