Name: 开源微型氟度计，以监测资源有限设置中的实时异热核酸放大反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 了解如何组装开源微型氟度计，用于实时监测等温核酸扩增反应。该设备采用低成本商用材料和开源软件，无需电子专业知识即可搭建，适用于多种分子诊断应用场景。

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特别感谢 Chelsey Smith、Megan Chang、Emilie Newsham、Sai Paul 和 Christopher Goh 在样品制备方面的协助。作者感谢 Caroline Noxon 对稿件的修改。本研究的资金由美国人民通过美国国际开发署（USAID）提供，由IAVI通过研究资助CCID 9204，在IAVI与USAID之间的资助协议AID-OAA-A16-00032项下支持。

1. 准备步骤：3D打印与焊接
注意：本方案中描述的光学系统适用于标准干式块加热器。
<ol>
	<li>要创建第一种配置，请分别3D打印作为补充文件1、2和3提供的CAD文件：</li>
	<li>要创建第二种配置，请分别3D打印作为补充文件3、4和5提供的CAD文件： 
	注意：这些部件设计为需支撑结构进行打印。本指南中使用黑色聚碳酸酯丝材，该材料在承受高达110 °C的温度后仍可保持其形状。通常，任何能够在目标等温反应温度下加热而不发生显著变形的材料均可使用。为尽量减少内部反射和环境光干扰的影响，建议使用黑色或其他深色材料。</li>
	<li>准备两个光转数字传感器评估模块，用于对两个样品进行并行监测。在其中一个传感器测试板上，移除R4电阻，并用跳线将PCB上R4区域右侧焊盘与R1区域顶部焊盘焊接连接。这将更改传感器的I2C地址，从而实现两个传感器的同时测量。 
	注意：所用传感器包含两块PCB：一块USB适配板和一块包含光传感器的传感器测试板；本装置仅需使用传感器测试板。</li>
	<li>将导线焊接到两个发光二极管（LED）上。将红色导线（正极）连接至LED上标有&#34;1&#34;的焊盘，将黑色导线（负极）连接至标有&#34;2&#34;的焊盘。在LED背面涂上一层薄薄的导热胶，将LED放置在端盖顶部，并等待导热胶固化。在端盖的另一侧，加装散热片。 
	注意：在LED密封于外壳之前进行测试时，务必佩戴合适的防蓝光眼部防护装置。</li>
	<li>要创建第二种配置，使用剪刀或剃刀刀片从蓝色激发滤光片膜上裁剪出两个直径为1/4英寸的圆片，从黄色发射滤光片膜上裁剪出四个直径为1/4英寸的圆片。</li>
	<li>将一个M2.5六角形嵌件压入“LCD_Screen_Holder.stl”部件倾斜部分的四个孔中。</li>
</ol>
2. 光学组装
<ol>
	<li>将一个长度为3/16英寸的4-40螺纹嵌件插入“Optics_Enclosure_Bottom.stl”部件顶部的孔中。将长度为1/4英寸的4-40螺纹嵌件插入该3D打印部件的所有其他孔中，如图2A所示。</li>
	<li>将传感器测试板插入外壳的顶部腔体内，使五个引脚朝上并靠近设备的中心轴。通过传感器测试板上的孔，使用一根长度为3/16英寸的4-40螺丝将其固定（图2B）。</li>
	<li>将一片焦距为20 mm的透镜放置在传感器测试板下方的区域，凸面朝向设备底部，背离测试板（图2C）。</li>
	<li>为构建第一种配置，请将长通滤光片放置在上一步安装的20 mm焦距透镜下方的区域（图2D）。为构建第二种配置，请将两张黄色发射滤光片放入透镜下方的区域。</li>
	<li>为构建第一种配置，请将二向色镜放置在外壳中心附近的对角区域，同时注意遵循制造商指定的滤光片方向（图2E）。为构建第二种配置，请将分束器放置在对角区域。分束器无需特定方向。</li>
	<li>将第二片焦距为20 mm的透镜放置在二向色镜（或根据配置为分束器）下方的区域，凸面朝向设备顶部（图2F）。</li>
	<li>为构建第一种配置，请将激发滤光片放置在二向色镜右侧的区域，并确保箭头指向二向色镜（图2G）。为构建第二种配置，请将一张蓝色激发滤光片放入分束器右侧的区域。</li>
	<li>将焦距为15 mm的透镜放置在激发滤光片右侧，凸面朝向二向色镜（图2H）。</li>
	<li>将一个LED插入打印件的剩余区域，LED朝向二向色镜（或根据配置为分束器）。确保从LED引出的两根导线插入凹槽通道中，以便打印件能够紧密闭合。</li>
	<li>对3D打印件的另一侧重复步骤2.3–2.9（图2I）。</li>
	<li>通过将外壳上半部分的凸出部分插入下半部分的凹槽中，将空的一侧打印件闭合到已安装光学元件的打印件上。使用长度为3/8英寸的4-40螺丝将两个打印部件固定在一起（图2J）。 
	&#8203;注意：如果两个打印部件未完全闭合，激发光可能会从光学外壳中泄漏。在实现良好密封之前，请务必佩戴适当的防蓝光护目镜。请重新密封外壳，直至无多余光线逸出。</li>
</ol>
3. 电子元件与触摸屏组装
<ol>
	<li>将两个迷你面包板连接在一起，然后将微控制器安装到其中一个面包板上。确保微控制器的 microUSB 接口朝外。</li>
	<li>为实现 LED 调制连接，将 LED（+）驱动器的 CTL 引脚连接至微控制器的一个数字引脚，将 LED 驱动器的 LED（-）引脚连接至微控制器的 GND 引脚。</li>
	<li>取下面包板背面的塑料盖。将面包板的背胶粘贴到 3D 打印部件上，使组合后的面包板固定在“LCD_Screen_Holder.stl”打印部件的内侧后部。</li>
	<li>使用一英寸长的 4-40 螺丝，将内部装有已组装面包板的液晶显示器（LCD）支架固定到第 2 节中已组装的光学外壳上。</li>
	<li>为连接 LED 电源，将 LED 驱动器的 LED（+）引脚连接至第一个 LED 的正极导线。将第一个 LED 的负极导线连接至面包板上第二个 LED 的正极导线。再将第二个 LED 的负极导线连接至 LED 驱动器的 LED（-）引脚。 
	注意：第一个或第二个 LED 的顺序是任意的。</li>
	<li>为连接 LED 驱动器电源，将 10 V 电源的正极和负极导线分别连接至 LED 驱动器的 VIN+ 和 VIN- 引脚。（使用了桶形插孔转双针适配器。）</li>
	<li>连接传感器测试板的电源和数据传输。传感器测试板仅使用四个引脚：SCK、SDA、VDUT 和 GND。使用一根 4 针母对公跳线，通过 LCD 支架打印件右上角的间隙，将光转数字传感器测试板上的这些引脚连接至迷你面包板。</li>
	<li>在面包板上，确保以下连接正确无误：微控制器的 3.3 V 引脚与两个测试板的 VDUT 引脚相连；微控制器的 GND 引脚与两个测试板的 GND 引脚相连；微控制器的模拟引脚 4（A4）与两个测试板的 SDA 引脚相连；微控制器的模拟引脚 5（A5）与两个测试板的 SCK 引脚相连。 
	注意：由于光传感器采用 I2C 通信方式，两个传感器的 SCK 和 SDA 引脚均可连接至微控制器的同一对应引脚。</li>
	<li>使用四个 M2.5 螺丝将单板计算机固定在 LCD 屏幕支架上。确保单板计算机的 HDMI 接口和电源适配器接口朝上，并且单板计算机在 3D 打印部件上居中放置。</li>
	<li>根据触摸屏说明书，将触摸屏显示器连接至单板计算机，然后将单板计算机的 HDMI 接口与触摸屏的 HDMI 接口相连。</li>
</ol>
4. 软件安装
<ol>
	<li>安装并使用网络编辑器，将 补充代码文件 1 中提供的自定义程序 &#34;MiniFluorimeter_2Diode.ino&#34; 上传至微控制器。确保通过库管理器安装 &#34;ClosedCube OPT3002&#34; 库。</li>
	<li>将变量 led_A_pin 更改为第 3.3 步（电子元件与触摸屏组装部分）中使用的数字引脚编号。</li>
	<li>通过修改变量 ExposureTime 的值，调整在采集荧光信号时 LED 开启的毫秒数；通过修改变量 led_A_Interval 的值，调整两次 LED 照射之间的毫秒间隔。</li>
	<li>将变量 led_Power 设置为 0 到 1 之间的数值，以调节 LED 在照射期间的亮度。数值为 0 时亮度最高，数值为 1 时亮度最低。</li>
	<li>按照 3.5 英寸显示屏随附的制造商说明，启用通过触摸屏控制显示的功能。 
	注意：如有需要，3.5 英寸屏幕可在无触摸功能的情况下作为显示器使用，此时可通过将键盘和鼠标连接至单板计算机的 USB 接口来操控该计算机。</li>
	<li>从 补充代码文件 2 下载 &#34;MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py&#34; 文件至单板计算机的指定位置。</li>
	<li>确保单板计算机上已安装可用版本的 Python。所提供的 Python 模块使用的是 Python 3.7，但任何稳定的 Python 版本均可使用，只需对提供的脚本进行相应调整即可。将 Python 程序所需的库安装到单板计算机上。</li>
	<li>将变量 measurement_time 更改为所需的测量持续时间。当设定时间到达后，程序将自动结束数据采集并关闭。图形用户界面也允许通过界面上的按钮手动终止采集。</li>
	<li>将变量 serialPort 更改为所连接微控制器的串行端口地址。</li>
</ol>
5. 记录实时荧光数据
<ol>
	<li>打开商用加热模块，并使其升至所需温度。</li>
	<li>使用大多数单板计算机购买时附带的标准 5 V 电源为单板计算机供电。使用 microUSB 转 USB 数据线将单板计算机与微控制器连接。</li>
	<li>通过触摸屏打开提供的 Python 脚本。将 measurement_time 和 serialPort 变量修改为所需的值。将变量 outputFilepath 修改为程序生成的数据文件名称。确保文件名以 '.xlsx' 结尾。</li>
	<li>将两个含有待监测反应液的 PCR 管放入加热模块中。确保 PCR 管的位置与荧光仪放置到加热模块上后各光学通道对齐。</li>
	<li>将荧光仪放置在加热模块上方，使 PCR 管位于荧光仪每个光学通道伸出的四个定位柱之间中心位置。为获得最佳测量效果，请确保 3D 打印的荧光仪牢固地嵌入加热模块的孔位中。</li>
	<li>牢固固定荧光仪，并插入 LED 的电源适配器。</li>
	<li>使用触摸屏启动 Python 程序。液晶显示屏上将出现图形用户界面（GUI），并开始实时测量荧光信号。</li>
	<li>在图形用户界面上观察两个 PCR 管随时间变化的实时荧光测量结果。</li>
	<li>当用户设定的实验时间结束后，数据采集将自动停止。用户可在预设路径中查看输出的数据文件。如需提前终止测量，请点击用户界面上标有 &#34;Stop Acquisition&#34; 的按钮。</li>
</ol>

<ol><li>Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+amplification+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications.</a> Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+Amplified+Detection+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA.</a> Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种开源、低成本、模块化、便携式的荧光检测仪，可用于等温扩增反应的定量荧光检测。开源项目具有易于维护、成本低廉的优点，其替换部件易于获取，并且基于模块化设计，用户可根据自身需求灵活调整系统。本方案详细描述了机械、光学和电子组件的组装过程以及光学性能的验证方法。此外，该荧光检测仪被证实具有足够的灵活性，可监测两种在温度、反应体积和荧光检测要求方面差异显著的等温扩增检测方法：RPA exo 和 RT-LAMP。RPA 反应在 39 °C 下进行，反应体积为 50 µL，通过序列特异性的 FAM 标记探针产生荧光信号；而 RT-LAMP 反应在 65 °C 下进行，反应体积为 25 µL，采用嵌入式染料来指示扩增 DNA 的存在。由于荧光信号通过平盖 PCR 管顶部进行检测，该荧光仪能够兼容两种不同反应体积的检测，且加热能力仅受限于所选商用加热模块的性能。此外，由于 RT-LAMP 采用染料法而非探针法生成荧光信号，其产生的荧光强度几乎比 RPA 高出一个数量级。然而，所选光学传感器的动态范围足以检测并量化这两种信号，且通过基线扣除算法可校正这些差异，从而获得可靠的荧光读数。
为了促进技术推广并最大限度降低潜在的维护成本，采用了模块化设计，可兼容在不同环境中广泛使用的加热设备。在本方案中，使用了一种常见的干式金属浴加热器；相同的光学和电路设计可轻松适配其他市售的加热器。如果采用其他干式金属浴加热器，仅需对3D外壳设计进行少量修改。具体而言，必须调整光学外壳STL文件中的底部定位柱，以确保与其他商用加热块的孔位正确对齐。尽管示例中展示的外壳是在相对低端的3D打印机上打印的（参见材料表），但仍需注意确保打印机的分辨率和/或打印公差足以容纳光学元件和螺纹嵌件。在所提供的STL文件中，根据制造商提供的尺寸，在光学元件的径向和轴向两侧各增加了0.01–0.02英寸的公差。这可确保所有光学元件牢固地安装在外壳内，并且外壳能完全阻挡多余光线进入或逸出。为确保螺纹嵌件实现合适的压配合，在CAD文件中从制造商提供的直径基础上减去了约0.01–0.02英寸的相似公差。
采用第一种荧光计配置可成功监测RPA反应，而RT-LAMP反应则可使用任一配置进行监测。由于RPA反应中荧光探针产生的荧光信号较弱，因此需要第一种配置更优的杂散光抑制能力。相比之下，RT-LAMP采用嵌入染料进行信号生成，产生的荧光强度较高，因此适用于使用摄影滤光片的第二种配置的较低动态范围。用户应根据其检测方法中荧光信号生成元件——嵌入染料或荧光探针——选择匹配的荧光计配置。
该系统的一个局限性在于，加热依赖于通过标准墙式插座供电的商用加热块。其他研究团队已表明，通过整合便携式可充电电池组，可进一步开发该系统，使其适用于缺乏稳定电力供应的地区12。另一个局限性是系统的通量相对较低，每次仅能同时对两个样本进行荧光检测。虽然可将多个外壳打印件放置在同一加热块上以提高通量，但所使用的光传感器仅有四个唯一的 I2C 地址，这限制了最多只能同时检测四个样本。若要进一步提高通量，需要采用具有更多唯一 I2C 地址的其他类型光传感器。

等温扩增技术被广泛用于核酸的检测。与需要热循环的传统PCR方法相比，等温扩增可在单一温度下实现核酸扩增，从而缩短检测时间，并对抑制物具有更强的耐受性1,2。等温扩增的另一项关键优势在于仪器设备的简化。大多数等温扩增反应仅需一个加热模块和一种检测方式——可通过荧光实时监测进行实时检测，或通过侧向流动试纸条或凝胶电泳进行终点检测3,4。实时荧光检测是通过检测嵌入染料在双链DNA存在时产生的荧光信号，或在特定双链DNA序列存在时被激活的淬灭型荧光探针所释放的荧光信号来实现的。
尽管市面上已有商用的台式等温荧光仪，但许多设备在检测方法的定制化方面存在不足。例如，许多仪器需要使用特定的或厂商提供的耗材，推荐指定供应商，或必须依赖专有软件才能获得宣传中的性能指标。大多数此类系统的售价超过5000美元，这对于资源有限环境下的广泛应用构成了显著障碍。此外，在资源匮乏地区，用户还面临设备维护困难的问题，原因包括恶劣的环境条件、备件供应链薄弱，以及维护和维修所需的专用工具5。为满足这一需求，本文介绍了一种模块化、低成本荧光仪的设计与组装方法，该仪器由现成组件构成，封装于紧凑的3D打印外壳中（图1A-C），并提供两种可选配置。该设备的第一种配置使用市售玻璃滤光片和二向色镜以阻隔过量背景光，总组装成本为830美元。尽管这些滤光片在基于荧光的成像系统中广泛使用，但此前研究已表明，用低成本的光学滤光片替代昂贵的高规格滤光膜仍可实现核酸检测6。荧光仪的第二种配置在采用这些低成本滤光片的基础上，进一步以φ½"分光镜替代二向色镜，使系统总成本从830美元降至450美元。
第一种构型的组装代表性图像如图1和图2所示，第二种构型的类似图像见补充文件6。为避免需要专业的光学对准，该光学系统设有指定区域用于放置各个光学元件，且可使用相对低端的3D打印机制造，从而有利于该设计的广泛使用。两种构型在构建和组装上的唯一区别在于3D打印所用的文件以及装入外壳中的光学元件。两种系统的3D打印外壳外部尺寸相同。表1展示了两种系统的成本对比。
如图1A所示，为了保持较小的体积，该荧光仪采用Φ½"（约12.5 mm）的光学元件，并结合紧凑的激发与检测系统，其布局可从PCR管顶部测量信号。图1所示系统设计用于检测激发峰和发射峰波长分别接近490 nm和525 nm的染料，包括FITC以及与之相近的常用染料SYBR和SYTO-9，这些染料通常作为实时核酸扩增反应中的报告分子7,8。根据需要，激发光源、光学滤光片和检测器可轻松替换为适用于其他荧光染料的组件。核酸扩增反应通常在PCR管中进行，该荧光仪可置于任何市售的、用于承载PCR管的加热模块上方（图1D），从而实现对等温扩增反应的实时监测。合适的加热模块在大多数生物医学实验室中均有配备，且售价低于500美元。
先前已证实，使用单板计算机作为低成本、即时检测替代方案来控制成像技术是可行的9。基于该研究，&#160;本实验方案采用由单板计算机驱动的图形用户界面（图1D），以实现在检测现场进行实时数据记录和结果显示，从而无需使用笔记本电脑进行数据处理或可视化。荧光测量数据通过I2C协议从光传感器传输至微控制器，再通过串行通信提供给单板计算机。照明和数据传输的电气连接通过在微型面包板上进行简化的布线和焊接实现，无需专门的印刷电路板（PCB）。运行该荧光计所需的软件可通过开源软件框架获取，运行设备所需的代码详见补充代码文件。整套荧光计的组装成本介于450至830美元之间，实验结果表明，其能够提供准确可靠的荧光测量，用于监测核酸的实时等温扩增。

<table><tbody><tr><td>1/4英寸长 4-40螺纹嵌件</td><td>McMaster-Carr</td><td>90742A116</td><td>用于将3D打印光学外壳的两侧固定在一起。</td></tr><tr><td>10V电源</td><td>GlobTek, Inc.</td><td>WR9HU1800CCP-F(R6B)</td><td>交流/直流壁挂式适配器，10V，18W</td></tr><tr><td>15 mm焦距透镜</td><td>Thorlabs</td><td>LA 1074</td><td>荧光计共使用两个。该透镜用于聚焦LED照明光。</td></tr><tr><td>1英寸长 4-40螺丝</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mm焦距透镜</td><td>Thorlabs</td><td>LA 1540</td><td>荧光计共使用四个。</td></tr><tr><td>2x WarmStart LAMP主混合液</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>E1700</td><td>主混合液用于生成图3C所示的LAMP反应</td></tr><tr><td>3.5&amp;rdquo; 触摸屏</td><td>Uctronics</td><td>BO10601</td><td></td></tr><tr><td>3/16英寸长 4-40螺丝</td><td>McMaster-Carr</td><td>90128A105</td><td></td></tr><tr><td>3/16英寸长 4-40螺纹嵌件</td><td>McMaster-Carr</td><td>90742A115</td><td>用于将OPT3002测试板固定到3D打印外壳上</td></tr><tr><td>3/8英寸长 4-40螺丝</td><td>McMaster-Carr</td><td>90128A108</td><td>用于将3D打印光学外壳的两侧固定在一起。</td></tr><tr><td>3D打印机耗材</td><td>3D Universe</td><td>UMNFC-PC285-BLACK</td><td>推荐使用黑色或其他深色</td></tr><tr><td>使用的3D打印机</td><td>Ultimaker</td><td>Ultimaker 2+</td><td></td></tr><tr><td>8联PCR管条</td><td>BioRad</td><td>#TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>高级迷你干式恒温加热器</td><td>VWR International</td><td>10153-320</td><td>以下加热模块可作为替代品，无需重新设计光学组件：949VWMNLUS、949VWMHLUS 和 949VWMHLEU</td></tr><tr><td>筒形插孔转双针适配器</td><td>SparkFun Electronics</td><td>1568-1238-ND</td><td></td></tr><tr><td>蓝色激发滤光片箔</td><td>LEE</td><td>LE071S</td><td>专为与FITC配合使用而选择——其他荧光染料可能需要不同的滤光片。</td></tr><tr><td>蓝色LED - 460 nm</td><td>Mouser</td><td>LZ1-30DB00-0100</td><td>专为与FITC配合使用而选择——其他荧光染料可能需要不同部件</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505T</td><td>专为与FITC配合使用而选择——其他荧光染料可能需要不同部件</td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Edmunds Optics</td><td>OG-515</td><td>专为与FITC配合使用而选择——其他荧光染料可能需要不同部件。部件上的箭头应背离光源方向。</td></tr><tr><td>激发滤光片</td><td>Omega Filters</td><td>490AESP</td><td>专为与FITC配合使用而选择——其他荧光染料可能需要不同部件</td></tr><tr><td>LED驱动器</td><td>LEDdynamics</td><td>3021-D-I-700</td><td></td></tr><tr><td>M2.5六角形嵌件</td><td>McMaster-Carr</td><td>91292A009</td><td>用于将树莓派固定在3D打印的LCD屏幕支架上</td></tr><tr><td>微控制器</td><td>Arduino</td><td>Nano</td><td></td></tr><tr><td>迷你面包板</td><td>Adafruit</td><td>65</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级矿物油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69794</td><td></td></tr><tr><td>OPT3002EVM - 光电数字传感器</td><td>Texas Instruments</td><td>OPT3002EVM:</td><td>所使用的光电数字传感器。包含两块PCB：SM-USB_DIG板和OPT3002测试板；本设备仅需使用OPT3002测试板。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>购买的寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPA试剂盒阳性对照DNA</td><td>TwistDx Limited</td><td>CONTROL01DNAE</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 RNA对照</td><td>Twist Biosciences</td><td>MN908947.3</td><td></td></tr><tr><td>单板计算机</td><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi 3</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp RPA exo试剂盒</td><td>TwistDx Limited</td><td>TAEXO02KIT</td><td></td></tr><tr><td>超透明平盖</td><td>BioRad</td><td>#TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>黄色发射滤光片箔</td><td>LEE</td><td>LE767S</td><td>专为与FITC配合使用而选择——其他荧光染料可能需要不同部件</td></tr></tbody></table>

开源微型荧光仪用于资源有限环境下实时监测等温核酸扩增反应

Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings

传统的核酸检测与定量方法依赖于聚合酶链式反应（PCR），需要使用价格昂贵的热循环仪，并通过集成荧光检测扩增产物。等温核酸扩增技术无需热循环过程；然而，要获得实时、定量的结果，仍需基于荧光的产物检测。目前市面上已有多种集成了荧光检测功能的便携式等温加热设备；但在资源有限的环境中，这些设备的成本仍然是广泛采用的主要障碍。本文介绍了一种模块化、低成本荧光检测仪的设计与组装方案，该仪器由市售组件构建而成。该检测仪封装于紧凑的3D打印外壳中，设计用于放置在商用加热块上方，加热块中可容纳PCR管。本文所述荧光检测仪已优化用于检测异硫氰酸荧光素（FITC）染料，但该系统可改造以适用于实时核酸扩增反应中常用的各种报告染料。通过两种等温扩增技术进行实时核酸检测，验证了该系统的临床适用性：使用重组酶聚合酶扩增（RPA）检测商业试剂盒中提供的阳性对照DNA，以及使用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测具有临床意义水平的SARS-CoV-2 RNA。

组装完成后，可通过测量FITC染料稀释系列的荧光来验证荧光计的性能。图3A展示了在荧光计第一种配置的两个通道中，以1×PBS配制的浓度分别为0、20、40、60和80 pg/µL的FITC染料的测量结果。每个样品测量三次，LED曝光时间为1.5秒，间隔20秒。荧光计的两个通道在目标浓度范围内均表现出线性响应。
通过将该系统与市售的干式加热块结合使用，进行两种等温扩增技术（RPA 和 RT-LAMP）的扩增反应，进一步验证了荧光检测仪的临床适用性。
图3B展示了在39 °C下对标准商用试剂盒中提供的阳性对照DNA按照制造商说明配制的实时RPA阳性和阴性对照反应（50 µL）进行扩增时，测得的扣除基线后的荧光随时间变化过程。对于产生相对较低荧光水平的RPA反应，采用荧光检测仪的第一种配置进行测量，该配置可更有效地抑制激发光。
图3C 展示定制 RT-LAMP 检测在不同时间点的测量结果 65 °C 利用Zhang等人描述的N2、E1和As1e引物组10，以及 Rabe 和 Cepko11RT-LAMP 反应产生更强的荧光信号，使用第二种低成本荧光检测仪配置进行测量。寡核苷酸购入后用 2×TE 缓冲液重悬，浓度为 1 mM。正向内引物（FIP）和反向内引物（BIP）寡核苷酸采用高效液相色谱法纯化。每组引物（N2、E1 和 As1e）混合配制 1000 µL 25倍混合液的配制如下： 40 µL FIP的 40 µL BIP的 5 µL F3的 5 µL B3的 10 µL LF的 10 µL LB 的 890 µL 1× TE缓冲液。为配制每个RT-LAMP反应体系， 1 µL 每对引物组均加入 0.5 µL 50倍荧光染料 12.5 µL 2×主混合液，并将反应体系补足至 20 µL 按照制造商说明使用无核酸酶水。将SARS-CoV-2 RNA对照品用无核酸酶水连续稀释至每份10、100或1,000拷贝的浓度 µL，以及 5 µL 总体积为 25 µL所有实验中使用的无模板对照（NTC）均为无核酸酶水。RT-LAMP 反应上层覆盖有 25 µL 分子生物学级矿物油
RPA 和 RT-LAMP 反应分别在 0.2 mL 低剖面 8 孔 PCR 条形管的两个孔中配制，并用超透明平盖密封。每个 RPA 和 RT-LAMP 反应均设置三个重复。在所有测试中，微型荧光仪均成功量化了与 DNA 扩增相关的荧光信号随时间的上升。
<img alt="光谱学光学装置示意图和原型；吸收和发射分析装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：置于加热块上方的光学外壳及组装完成的微型荧光仪。（A）光学外壳示意图，显示一个检测通道中放置的光学元件。（B）微型荧光仪组装后第一种构型的示意图。（C）光学外壳实物照片，显示一个检测通道中已安装光学元件。（D）组装完成的微型荧光仪放置在商用加热块上的实物照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用 Arduino 的自动光传感器组件示意图；包括检测和数据分析过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：微型荧光仪的组装与电气控制示意图。A-J) 第一种系统配置中，光学元件在3D打印的光学外壳中的逐步安装位置。（K）两种配置下微型荧光仪的电气连接图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光图；浓度、时间分析；PCR结果；数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：使用微型荧光仪获得的代表性测量结果。（A）两个通道中测得的荧光信号与FITC染料浓度的关系，显示在所需动态范围内呈线性响应。（B）商业试剂盒的阳性和阴性对照样本在等温扩增过程中的实时荧光信号随时间变化。阳性对照样本出现预期的扩增曲线。（C）自定义RT-LAMP检测中，SARS-CoV-2 RNA的50、500和5000拷贝样本以及NTC样本在等温扩增过程中的实时荧光信号随时间变化。扩增曲线在接近该检测方法的检出限处出现，符合预期。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">系统 1</td>
			<td colspan="2">系统 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>项目</td>
			<td>数量</td>
			<td>总价（美元）</td>
			<td>数量</td>
			<td>总价（美元）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">光学组件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>透镜</td>
			<td>6</td>
			<td>158.14</td>
			<td>6</td>
			<td>158.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反射镜</td>
			<td>2</td>
			<td>244.56</td>
			<td>2</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>光学滤光片</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>6</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>小计</td>
			<td>602.7</td>
			<td>小计</td>
			<td>223.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">照明与检测</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>2</td>
			<td>72.62</td>
			<td>2</td>
			<td>72.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 驱动器</td>
			<td>1</td>
			<td>11.49</td>
			<td>1</td>
			<td>11.49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>光电二极管</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>小计</td>
			<td>134.11</td>
			<td>小计</td>
			<td>134.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">电子与显示组件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano</td>
			<td>1</td>
			<td>20.7</td>
			<td>1</td>
			<td>20.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>1</td>
			<td>35</td>
			<td>1</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD 屏幕</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>迷你面包板</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10V 电源</td>
			<td>1</td>
			<td>8.6</td>
			<td>1</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>小计</td>
			<td>93.3</td>
			<td>小计</td>
			<td>93.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">总成本（美元）</td>
			<td>830.11</td>
			<td></td>
			<td>450.55</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：微型荧光仪两种配置的成本比较。
补充文件 1：System1_Optics_Enclosure_Top.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System1_Optics_Enclosure_Top.STL" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl，以及 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System1_Optics_Enclosure_Bottom.STL" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：LCD_Screen_Holder.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/LCD_Screen_Holder.STL" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 4：System2_Optics_Enclosure_Top.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_Optics_Enclosure_Top.STL" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 5：System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl，以及 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_Optics_Enclosure_Bottom.STL" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 6：System2_BuildInstructions.pdf <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_BuildInstructions.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a> 
补充代码文件 1：MiniFluorimeter_2Diode.ino <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/MiniFluorimeter_2Diode.ino" target="_blank">请点击此处下载该代码文件。</a>
补充代码文件 2：MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/MiniFluorimeter_2Diode_GUI.zip" target="_blank">请点击此处下载该代码文件。</a>

提供了详细的说明，用于构建一种开源的模块化荧光仪，该荧光仪可与多种低成本加热装置兼容，用于进行实时、定量的等温核酸扩增。

检测和定量核酸的传统方法依赖于聚合酶链式反应（PCR），并需要使用昂贵的热循环仪以及……

该方法使不具备电子学专业知识的人员也能够构建用于等温核酸扩增与检测的荧光仪等仪器，这对于分子诊断至关重要。该技术的主要优势在于，整个系统可完全使用市售材料和开源软件以低成本组装完成。该荧光仪可兼容多种等温扩增方法。这一点非常重要，因为等温扩增技术正被越来越多地用于检测多种传染性和遗传性疾病。组装光学外壳时，将一个长度为3/16英寸的4-40螺纹嵌件插入光学外壳底部STL件顶部的孔中，并将长度为1/4英寸的4-40螺纹嵌件插入该部件的所有其他孔中。将中心测试板插入外壳顶部的腔体内，使五个引脚朝上并靠近设备的中心轴线，然后使用长度为3/16英寸的4-40螺钉固定测试板。将一个焦距为20毫米的透镜放置在中心测试板下方的区域中，透镜的凸面朝向设备底部，背离测试板。要创建第一种配置，请将长通滤光片放置在焦距为20毫米的透镜下方的下一个区域中。要创建第二种配置，请将两张黄色发射滤光箔放置在透镜下方的区域中。为实现第一种配置，将二向色镜放入镜筒中心附近的对角位置，同时注意遵循制造商指定的滤光片方向。为实现第二种配置，将分束器放入对角位置。根据具体配置，在二向色镜或分束器下方的区域放置第二个焦距为20毫米的透镜，透镜的凸面朝向设备顶部。要创建第一种配置，请将激发滤光片放置在二向色镜右侧的插槽中，并确保箭头指向二向色镜。要创建第二种配置，请将一片蓝色激发滤光片放入分光镜右侧的插槽中。将焦距为15毫米的透镜放置在激发滤光片右侧，凸面朝向二向色镜。将LED插入打印件剩余部分，LED朝向二向色镜或分束器，具体取决于配置。确保从LED引出的两根导线插入凹槽通道中，以便打印件能够紧密闭合。对3D打印件的另一侧重复上述组装步骤。然后将外壳上半部分突出的部分插入外壳下半部分的凹槽中，以闭合装有光学元件的部件的空置一侧，并使用长度为3/8英寸的4-40螺丝将两部分固定在一起。在组装电子元件和触摸屏时，连接两个迷你面包板，并将微控制器插入其中一个面包板中，确保微控制器的micro-USB接口朝外。为了连接LED调制，将LED+驱动器的CTL引脚连接到微控制器的数字引脚，再将LED驱动器的LED引脚连接到微控制器的GND引脚。取下面包板背面的塑料盖，将面包板的背胶粘贴面压合到3D打印部件上，从而将组合好的面包板固定在LCD屏幕支架STL打印件后部内侧。使用1英寸长的4-40螺丝将装有已组装面包板的LCD屏幕固定架固定在光学 enclosure 内。连接LED电源时，将LED驱动器的LED正极引脚连接到第一个LED的正极导线，再将第一个LED的负极导线连接到面包板上第二个LED的正极导线。将第二个LED的负极导线连接到LED驱动器的LED引脚。连接LED电源时，使用桶形插孔转2针适配器，将10伏电源的正极和负极导线分别连接到LED驱动器的VIN+和VIN-引脚。为连接传感器测试板的电源和数据传输，使用4针母对公跳线，将光转数字传感器测试板上的SCK、SDA、VDUT和GND引脚通过LCD支架打印件右上角的间隙连接到迷你面包板。在面包板上，确认微控制器的 3.3 伏引脚与两个测试板的 VDUT 引脚、微控制器的 GND 引脚与两个测试板的 GND 引脚、微控制器的模拟 4 引脚与两个测试板的 SDA 引脚，以及微控制器的模拟 5 引脚与两个测试板的 SCK 引脚均已正确连接。使用四颗 M2.5 螺丝将单板计算机固定在 LCD 屏幕支架上，单板计算机的 HDMI 接口和电源适配器接口朝上，并使其居中安装于 3D 打印部件上。然后根据触摸屏说明书，将触摸屏显示器连接至单板计算机。将单板计算机的HDMI端口连接到触摸屏的HDMI端口。为了记录实时荧光数据，在加热模块开启并达到适当温度后，接通单板计算机电源，并使用micro-USB转USB线缆将单板计算机连接至微控制器。在触摸屏上打开提供的Python脚本，并修改测量时间。将变量输出文件路径更改为程序生成的数据文件的名称，并将串口变量更改为所需的值。将两个含有待监测反应液的PCR管放入加热模块中。将荧光仪放置在加热块上，使PCR管位于每个光学通道伸出的四个插销之间并居中。确认3D打印的荧光仪已固定后，插入LED电源适配器并启动Python程序。LCD屏幕将显示图形用户界面，用于实时测量两个PCR管中的荧光信号。实验结束后，查看保存在用户指定位置的测量结果和输出数据文件。组装完成后，可通过测量FITC染料系列稀释液的荧光来验证荧光计的性能。在此代表性分析中，荧光计的两个通道在目标范围内均表现出线性响应。图中显示的是在荧光仪的第二种配置下，对标准商用试剂盒的重组酶聚合酶扩增阳性反应及阴性对照反应所测得的基线校正后荧光信号。在荧光仪的第一种配置下，对SARS-COVID-2 RNA进行定制的逆转录环介导等温扩增反应的实时荧光检测结果表明，在具有临床相关性的RNA拷贝数范围内，扩增反应如期发生。在全球供应链承受巨大压力的当下，此类开源设备（如该荧光仪）有助于减轻与大流行相关的部分健康不平等问题。

open-source-miniature-fluorimeter-to-monitor-real-time-isothermal

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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