原代小鼠胚胎腭间充质细胞的分离和延时成像，以分析集体运动属性

该协议允许颅面领域的研究人员定量比较对照细胞和突变细胞中的集体运动属性，作为了解腭架抬高期间间充质重塑的手段。原代小鼠胚胎腭间充质细胞和延时成像的使用为评估腭架抬高动力学提供了一种可访问的代理方法。要从小鼠胚胎中收获腭壳，使用灭菌的穿孔勺子将胚胎13.5胚胎放入体视显微镜下充满无菌MEPM培养基的无菌10厘米培养皿中。

斩首后，将无菌精细5号镊子的一个尖端插入脸颊内的嘴中，并推动镊子的尖端，直到它离开颅骨的后部。调整镊子的方向，使另一只手臂悬停在耳道上，然后捏住镊子以切割组织。在头部的另一侧重复切口，继续捏切手术，直到下颌，舌头和颅骨的下部被移除，暴露出腭架。

将头部放在一侧，将一对小的，无菌的不锈钢剪刀的尖端放在头骨的前面和后面，正好与胚胎的眼水平相当，并在眼睛上方切开以去除头骨的颅骨，形成平坦的表面。接下来，将头部倒置，上部平放在盘子的底部，并找到腭架，这应该在头部前半部分的中央凹槽的两侧可见为两个凸起的桥。要将头部固定到培养皿中，将细镊子的一个尖端插入靠近头部前部鼻部区域的组织，然后插入另一个尖端，穿过颅底后部到腭架。

将第二对非常锋利，细的镊子的两个点插入架子外侧表面底部的组织中，然后缓慢而小心地捏合以切割组织。沿着搁板内侧表面的底部以及在搁板的前两端和后端重复切口，将搁板从其附着在头部的装置上分离出来，然后轻轻抬起搁板，根据需要进行额外的捏合，以将外壳从周围组织中完全释放出来。当以相同的方式移除第二个腭架时，使用无菌塑料灯泡转移移液管将搁板转移到无菌的1.5毫升微量离心管中，在冰上约500微升PBS。

为了建立MEPM细胞培养物，当收集完所有货架时，在不干扰组织的情况下吸出PBS，并立即向每管腭架组织添加200微升37摄氏度0.25%胰蛋白酶。使用1， 000微升移液器短暂移液组织几次，并在37摄氏度下孵育组织10分钟，五分钟后短暂移液。在孵育结束时，再次移液组织，然后向每个管中加入800微升MEPM培养基并离心管以收集细胞。

吸出上清液后，将沉淀重悬在每管一毫升新鲜MEPM培养基中，并将细胞接种到含有每孔2毫升的六孔组织培养处理板的单个孔中，最终每孔总共三毫升，然后让细胞在无菌细胞培养箱中粘附在塑料表面上12小时。要建立2D集体迁移测定，请为每个待分析样品取出一个无菌双孔硅胶插入物的顶部，使其高度约为1毫米，并使用无菌镊子将缩短的无菌双孔插入物安装到六孔板的单个孔的中心。沿所有边缘向下按压，以确保插入物完全粘附在孔底，并在每平方毫米的缩短有机硅插入物中接种300个MEPM细胞，总体积为40至50微升MEPM培养基，进入每个插入物中，在细胞培养箱中孵育过夜。

要建立伤口修复测定，请使用无菌镊子将一个未改性的无菌双孔硅胶插入每个样品的六孔板的一个孔的中心，并用力按压插入物的边缘以将插入物连接到培养板上。然后将每平方毫米1， 400个细胞接种在100微升MEPM培养基中，放入每个插入物中，并在细胞培养基中孵育细胞48小时。当进行2D集体迁移测定时，在大型培养皿中将细胞接种在双孔硅胶插入物中通常可提供更好的成像细胞密度。

放置在35毫米培养皿中的小型3D打印环也可用于2D运动分析。对于伤口修复测定，细胞在双孔硅胶插入物中生长，直到高度汇合。然后取出插入件并成像伤口直到闭合。

MEPM轨迹是持久的，细胞运动的方向保持数小时。平均位移与时间分析表明，位移形式的持久性与经过的时间成正比。对运动数据的流动分析表明，共同移动的MEPM细胞簇的大小约为300微米。

还观察到野生型和突变MEPM细胞之间的深刻运动差异。该程序可用于各种转基因小鼠品系，并用各种生化试剂处理MEPM细胞，以研究它们对细胞运动的影响。我们专注于原发性腭间充质细胞，但延时成像和定量分析也可用于探索动态发育过程中任何运动细胞类型的迁移属性。