Name: 斑马鱼光学杯形态形成的四维成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 了解斑马鱼胚胎眼发育的活体成像方法，利用共聚焦显微镜实现四维光学杯形态形成动态观察。该技术适用于野生型和突变体研究，为脊椎动物眼形态发生机制提供高分辨率细胞追踪与三维可视化分析手段。

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我们感谢Kwan实验室的历届和现任成员在延时成像方法上的工作以及对本方案的讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（KMK获得R01 EY025378和R01 EY025780；SL获得F31 EY030758；MAC获得T32 GM007464）。

本文所述使用斑马鱼的所有方法均包含在 Kristen Kwan 博士的动物实验方案中， &#34;斑马鱼视觉系统发育的细胞与分子机制&#34;，并已获得犹他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 加帽RNA合成
<ol>
	<li>制备体外转录用的DNA模板。
	<ol>
		<li>通过在100 µL反应体系中消化10 µg DNA来线性化DNA模板。典型的反应体系配制如下：使用3 µL酶和10 µL缓冲液消化10 µg DNA，加水至终体积为100 µL。 
		&#8203;注意：常用的消化模板为pCS2载体，例如本文所述用于膜和染色质标记的pCS2-EGFP-CAAX或pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry。在此情况下，质粒DNA均使用NotI酶进行消化。用户应注意星号活性（star activity）；建议使用高保真酶，此类酶已有商业化产品。</li>
		<li>在37 °C孵育过夜，以确保DNA完全消化。</li>
		<li>按照制造商说明书，使用PCR纯化试剂盒对限制性酶切产物进行纯化。用30 µL ddH2O洗脱DNA。将线性化DNA储存于-20 °C，按需使用。 
		&#8203;注意：所用DNA消化量及洗脱体积可获得约0.3 µg/µL的浓度；此浓度足以进行约5轮体外转录，每轮使用约2 µg DNA作为模板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用体外转录试剂盒合成带帽RNA。对于pCS2模板（如本文所述），应使用SP6试剂盒。
	<ol>
		<li>配制体外转录反应体系，如下所示：将2 µg DNA模板或最多6 µL模板加入2 µL 10x反应缓冲液、10 µL 2x核糖核苷酸混合物和2 µL 10x酶混合物中。</li>
		<li>在37 °C孵育2–4小时或更长时间（更长孵育时间可提高产量）。如有需要，可在孵育中途补充1 µL酶混合物。</li>
		<li>加入1 µL无RNase的DNase，37 °C孵育15分钟，以消化DNA模板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商说明书，使用RNA纯化试剂盒纯化带帽RNA（参见材料表）。用100 µL无RNase的H2O洗脱。 
	注意：本应用中无需添加β-巯基乙醇。尽管本方案所述方法简便，也可使用其他替代试剂进行RNA纯化。</li>
	<li>沉淀RNA。
	<ol>
		<li>向洗脱的RNA中加入10 µL 3 M无RNase的NaOAc和2.5倍体积（约275 µL）预冷的无RNase 100% EtOH。</li>
		<li>在-20 °C孵育15–30分钟。在4 °C以高速离心15分钟，使RNA形成沉淀。 
		&#8203;注意：沉淀应可见于管壁。建议记录离心时离心管在转子中的方向，以便预测沉淀最终所在位置。</li>
		<li>小心使用注射器移除EtOH，注意避免加热、过度干燥或扰动沉淀。将沉淀重悬于20 µL无RNase的H2O中。</li>
		<li>检测RNA以确认转录成功。取1 µL用分光光度计测定浓度，并取0.5 µL上样至1%琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现一条或两条清晰条带，而非低分子量弥散。体外转录反应的产量应约为1 µg/µL。</li>
		<li>分装RNA并储存于-20 °C或-80 °C。RNA在注射前才进行稀释。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单细胞斑马鱼胚胎的显微注射
注意：为在视杯形态发生过程中实现染色质和细胞膜的广泛表达，每条RNA注射量为200-300 pg。准备5-10 µL的RNA稀释液，每根注射针上样2.5-5 µL；需预留额外用量，以防针头断裂。
<ol>
	<li>注射前的准备工作。
	<ol>
		<li>准备一个注射模具培养皿，以方便在显微注射过程中对单细胞胚胎进行定位和方向排列。将2%琼脂糖溶于E3培养基（标准胚胎培养液）中，倒入培养皿。待琼脂糖仍处于高温液态时，小心地将注射模具（见材料表）漂浮在其表面，使琼脂糖凝固后形成槽状印模。琼脂糖完全凝固后，移除注射模具。 
		注意：注射模具培养皿可使用数月；不使用时用E3培养基覆盖，并于4 °C保存。</li>
		<li>拉制显微注射针。使用拉针仪将玻璃毛细管拉成细长锥形，制成显微注射针。根据所用毛细管类型设置拉针仪程序。对于1.0 × 0.78 mm的硼硅酸盐毛细管，使用以下参数：加热温度 = 546 °C，拉力 = 130，速度 = 70，时间 = 90（图2F）。将制好的针置于培养皿中，并用橡皮泥固定。 
		注意：拉针程序因仪器和灯丝不同而异，每次更换新灯丝均需重新校准。每次拉针可产生两根注射针（图2G）；建议多次操作以制备足够数量，以防意外断裂或用于后续实验。</li>
		<li>稀释带帽RNA用于注射。使用无RNase的H2O将EGFP-CAAX和H2A-mCherry两种RNA分别稀释至200–300 ng/µL的浓度，并加入1 µL酚红，总体积为5 µL（酚红终浓度为0.1%）。轻弹混匀后短暂离心以收集全部液体。稀释后的RNA在注射前需置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞胚胎注射
	<ol>
		<li>当鱼类开始产卵后，等待约15–20分钟，以确保卵子完成受精。在此期间，使用P10移液器和P10微加载吸头将2.5–5 µL RNA稀释液从针尖后端装入注射针中。</li>
		<li>使用皮升注射仪，借助目镜测微尺（也可使用显微标定玻片）测量液滴体积（球体体积公式 = (4/3) × π × 半径³），对注射针进行校准。调节注射时间和压力，使每次注射体积为1 nL（图2I）。</li>
		<li>用滚针/转移移液器小心将胚胎转移至注射模具中（图2J）。如有需要，可在注射前或注射过程中使用镊子轻轻滚动胚胎，使单细胞清晰可见。是否使用显微操作仪由操作者自行决定。</li>
		<li>在单细胞阶段对胚胎进行注射，针头应准确进入细胞而非卵黄部分（图2M），以确保胚胎发育过程中标记均匀分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将注射后的胚胎培养至所需发育阶段（根据标准分期法，不超过12 hpf34）。由于注射胚胎发育会有所延迟，建议在略高的温度下培养（29.0–29.5 °C）以补偿时间。下午时段应检查胚胎状态，及时移除死亡个体，以维持整批胚胎的健康状态。</li>
</ol>
3. 用于延时成像的斑马鱼视泡期胚胎的固定
<ol>
	<li>在封片前，用E3培养基配制1.6%低熔点琼脂糖。若计划进行多次成像实验，可配制约20 mL低熔点琼脂糖并于室温保存。在胚胎封片当天，将其融化后取1–5 mL新鲜分装至离心管中，封片前置于42 °C金属浴中预热。</li>
	<li>使用荧光显微镜在固定前筛选胚胎，评估显微注射是否成功以及荧光整体亮度。理想样本应表现出强烈的EGFP和mCherry荧光，并处于正确的发育阶段（图3B - B'').
	<ol>
		<li>使用荧光显微镜筛选胚胎。选择EGFP和mCherry荧光均强烈表达的胚胎用于制片。</li>
		<li>选取11 hpf的胚胎。通过计数体节对胚胎进行准确分期。34；在11 hpf时应有3个体节，到12 hpf时应有6个体节。 
		&#8203;注意：在12 hpf之前（11 hpf时）固定胚胎，可确保在延时成像开始时，样品处于准确的12 hpf发育阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在固定前去除胚胎的卵膜。可使用精细镊子手动去除，或使用蛋白酶（2 mg/mL）进行化学去除。对于如此年轻的胚胎，去卵膜操作必须在涂有琼脂的培养皿中进行，并避免胚胎接触气-液界面。</li>
	<li>使用玻璃滚压移液管吸取一个胚胎，并尽可能排出E3溶液，使胚胎停留在玻璃巴斯德移液管的尖端。</li>
	<li>将胚胎滴入来自加热块的琼脂糖管中。让胚胎在琼脂糖中沉降数秒钟，然后先吸取少量琼脂糖，再吸取胚胎，确保胚胎始终位于移液枪头的尖端图3C - C').</li>
	<li>将用于成像的玻璃底培养皿置于解剖显微镜下。将胚胎和琼脂糖弹出至玻璃底培养皿中的琼脂糖液滴内。用镊子迅速调整胚胎方向，使其背侧朝下（头部顶端接触玻璃底面）。让琼脂糖液滴凝固。图3D - D'此步骤必须快速但小心地进行，因为此阶段的胚胎十分脆弱。受损的胚胎将无法存活于延时成像过程。 
	注意：本实验中所有胚胎的方位必须保持一致。进行延时成像时，需确保胚胎位于指定视野范围内，同时为视泡的生长预留充足空间。最佳的摆放方式是将所有胚胎的头尾轴对齐。 &#34;垂直地&#34; 或沿钟面的12点和6点方向（图 3G).</li>
	<li>装载10至12个胚胎，数量超过实际成像所需样本的两倍，以便在共聚焦显微镜下评估后筛选出最佳样本图3E - E'). 样品将根据年龄、荧光标记的均一性以及封片方向的准确性进行评估。</li>
	<li>胚胎固定后，用移液器加入更多琼脂糖，完全覆盖培养皿底部，从而将所有独立的琼脂糖液滴包裹成一个大的琼脂糖圆盘（图3F - F'足够的琼脂糖可确保单个胚胎液滴或整个载玻片不会从培养皿底部抬起并漂浮至视野之外。</li>
	<li>凝固后，用E3覆盖琼脂糖，以保持样品在整个延时成像实验期间的湿润状态（此问题取决于实验室及周围环境的湿度）。 
	注意：由于这些特定的延时成像实验所用胚胎足够年轻，因此无需使用Tricaine；但如果需要，且在处理较晚期胚胎时，可将Tricaine加入琼脂糖中，并将其覆盖于培养基上。</li>
	<li>在纸上绘制胚胎位置图，以便在设置延时成像时快速参考。这对于后续将每个样本的位置与其基因型准确对应至关重要。</li>
</ol>
4. 使用激光扫描共聚焦显微镜进行多位置共聚焦延时成像
注意：本延时成像方案设计用于配备制造商软件的激光扫描共聚焦显微镜（参见材料表）。该系统配备压电Z轴装置，可快速获取Z轴层扫图像。本方案使用的激光线包括488 nm氩离子激光和561 nm DPSS激光。561 nm激光非常适合mCherry荧光蛋白的成像：其波长接近mCherry激发峰（587 nm），且激光功率充足。
<ol>
	<li>设置共聚焦显微镜。
	<ol>
		<li>打开共聚焦显微镜并登录台式计算机。</li>
		<li>安装压电Z轴位移台插件（图4B），然后启动采集软件。</li>
		<li>在软件内 采集 模式，使用下拉菜单打开 488 和 561 激光器（图4F激光器需要几分钟预热时间，因此应尽早执行此步骤以节省时间。 
		注意：采集参数如下：检查 Z轴层扫，时间序列，以及 位置 盒子。设置 帧大小 至 512 (X) × 384 (Y)， 扫描速度 至 9， 扫描模式 双向的， 缩放 至 0.7， 针孔 至60.2（1.63艾里单位≈1.6 µm切片），以及 Z区间 至2.1 µm。这将得到303.6 µm × 227.7 µm的图像尺寸，以及0.59 µm的像素尺寸。应检查488和561激光器并将其分配至同一通道；EGFP的检测范围为494–545 nm，mCherry的检测范围为598–679 nm。图4F).</li>
		<li>用浸没介质充分覆盖玻璃培养皿底部，该介质的折射率应与水相匹配，并注意避免产生气泡（图4C）。选择40倍水镜物镜，并在物镜上滴加一小滴浸没液（图4D）。将玻璃底培养皿固定在载物台插件中，加入E3培养基以保持胚胎整夜湿润，然后使用模型黏土将塑料盖密封在培养皿上（图4E）。升高物镜以接触培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选样品并准备进行延时成像。
	<ol>
		<li>从……切换 采集 切换到 定位 点击标签并单击灯泡图标以打开透射光。使用透射光时，通过操纵杆定位第一个样本：肉眼观察下先将样本移入光束中，然后使用目镜将视场中心对准并聚焦于视泡结构。</li>
		<li>返回到 采集 标签。确保 Z轴扫描, 时间序列，以及 职位 检查盒子，并预热激光器以备使用。</li>
		<li>设定 帧大小 至 512 (X) × 384 (Y)， 扫描速度 至 9， 扫描模式 双向，并设置 缩放 至 0.7。</li>
		<li>在……之下 通道 首先将488和561激光器分配给 功率 2.0 和 增益 550（此值可后续调整）。设置 针孔 至60.2（1.63艾里单位≈1.6 µm切片）。</li>
		<li>开始使用以下设备进行扫描 连续的 按钮。使用微调焦旋钮在Z轴上定位样本，并调整X-Y轴位置使其位于视野范围内。停止扫描。</li>
		<li>在 职位 标题，点击 添加 保存第一个样本的 XYZ 信息（图4F）。仅对需要进行延时成像的样品执行此操作。选择荧光强且封片效果理想的样品。</li>
		<li>切换到定位选项卡，移至下一个样品，并选择性地选取样品，重复步骤 4.2.5–4.2.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定样本位置，设定Z轴范围，然后开始延时成像。当所有样本均被选中（可在2.5分钟的总时间间隔内对4-5个样本进行成像）且位置保存后，逐一检查每个样本，并在视野范围内调整其XYZ位置。
	<ol>
		<li>突出第一个位置并点击 移动至在持续扫描的同时，将视泡对准视野范围内。在视泡和脑部的前方及远端区域保留足够的空间。</li>
		<li>接下来，通过选择来指定第一个和最后一个Z层切片 设置第一步 和 设置最后 在使用细调焦旋钮沿Z轴方向移动的同时，保持总切片数约为63，以适应视杯的生长。在视泡的腹侧预留额外空间，以利于其生长。</li>
		<li>设置好第一层和最后一层Z切片后，单击 C 按钮以移至Z轴堆栈的中心。调整两台激光器的激光功率和增益；如果可能，将激光功率保持在5以下，并在必要时使用较高的增益。停止扫描。通过单击更新位置信息 更新.</li>
		<li>单击以移动到下一个位置 位置2重复步骤 4.3.1–4.3.3，针对每个指定位置进行操作。激光功率和增益的设置应确保所有样品均得到充分照明。</li>
		<li>当位置信息和激光设置均确定后，设定时间序列参数。在 时间序列 标题，分配 时间间隔 至2.5分钟，且 循环 至 300 (图4F计算循环次数，以确保延时成像持续超过24 hpf阶段，即视杯发育完成的时期。</li>
		<li>开始延时拍摄，点击 开始监测第一个完整周期：使用计时器确保一个完整周期（对所有位点成像）少于2.5分钟，并确认每个位点的图像正常。显微镜将在夜间独立运行，无需持续监测。 
		&#8203;注意：尽管共聚焦显微镜室已进行温度控制，室温维持在20–25 °C，但由于设备运行及激光扫描，载物台处的实际温度接近28.5 °C，此温度下胚胎发育速率符合预期，可通过形态学标志进行目视评估确认。</li>
		<li>使用这些设置，延时成像将持续12.5小时。延时成像完成后保存文件，文件体积较大（约40 GB），可使用采集软件在保存后将其分割为各个独立位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处，我们介绍一种实验方案 整体上 标记和四维延时成像视杯形态发生过程。我们逐步介绍生成编码荧光蛋白的加帽RNA以标记不同亚细胞区域的方法；向斑马鱼单细胞胚胎注射该RNA；将11小时（hpf）胚胎包埋于琼脂糖中进行多重成像；并在视杯形态发生全程（12–24 hpf）内获取多个胚胎的四维数据集。

利用这些信息密集型数据集可以回答大量问题。4D 数据可以通过多种方式进行可视化和定量分析。尽管这些内容超出了本实验方案的范围，我们仍在此列出部分研究目标和常规应用，以示例说明可实现的研究类型。当然，定量图像分析方法在不断发展中，既可使用商业软件，也可使用定制工具。如果研究者此前未使用过此类方法，则应做好准备，进行一定的优化工作，以确保所获取的数据集适用于所选择的定量分析方法。

由于文件体积较大，对4D数据集进行可视化和定量评估可能具有挑战性。可使用采集软件将数据集按单个胚胎进行分离，并使用ImageJ/Fiji将共聚焦图像从商业格式转换为更标准的tif堆栈格式，其中每个时间点保存为单独的文件。这将减小文件大小并标准化文件格式。利用ImageJ/Fiji，可将每个时间点的单个光学切片组装成二维（XY）时间序列，从而实现对数据的快速二维可视化与评估。视频1即为此类示例：它是对图4I–I’’’中所示最佳样本随时间变化的单个光学切片所构建的时间序列。在此基础上，对于三维（3D）和四维（4D）可视化，我们通常使用FluoRender35,36，该软件可免费获取，但对显卡有特定要求。通过FluoRender，用户可沿任意轴旋转三维渲染数据，随时间动态可视化四维数据集，在任意平面上生成剖切视图，并将旋转过程和可视化结果保存为视频或一系列tif图像。

在定量分析方面，有许多问题亟待解答。我们自主研发了软件，以实现深入理解视杯形态发生过程中细胞行为的特定目标。我们的程序 LongTracker 利用细胞核信号作为位置代理，用于追踪细胞13。通过这些数据，我们可以确定细胞移动的时间、位置和方式；细胞移动的速度和距离；以及细胞分裂的频率。除了我们自主开发的软件外，目前还存在多种商业化的和定制开发的4D细胞追踪方案。我们还开发了程序 LongAxis，用于实现细胞分割，并量化神经视网膜内细胞的形态与排列结构37。然而，输入 LongAxis 的数据集是高分辨率下获取的单个Z轴层扫描图像。长期以来存在的一个挑战是，如何生成具有足够高分辨率的时间序列数据集，以便能够可靠地进行细胞分割并推断其形态。一种替代方法是使用光转换荧光蛋白（如 Kaede）进行马赛克（稀疏）标记，从而直接可视化细胞形态，我们及其它研究团队已在发育中的眼球中实施了此类方法8,11,13。这种方法简化了细胞分割问题，并可通过 FluoRender 进行三维重建，快速量化细胞形态与大小。

本方案的每一步均针对我们的特定目的进行了优化。该方案的特异性导致了一些局限性：按本文所述，该方案并未针对斑马鱼眼部发育的其他方面（如视网膜神经发生）、其他眼部结构、其他发育阶段或其他亚细胞区域的成像进行优化。包埋方向、成像速度和标记方式的设计均旨在帮助我们回答特定的生物学问题。例如，若要对视网膜神经发生进行成像，此处所述的胚胎背侧朝向可能无法清晰显示某些感兴趣的特征，且成像速度也可能不适宜。本方案的许多方面可根据具体的研究兴趣和目标进行调整和修改。首先，使用RNA注射使标记过程具有很高的灵活性。可通过荧光蛋白融合构建体标记感兴趣的亚细胞结构，并通过调整RNA注射量来优化标记效果。根据我们对光转化荧光蛋白Kaede的研究，RNA注射似乎支持一个短暂的翻译高峰，该高峰在12 hpf时已基本结束11,13。通过RNA注射实现高水平的荧光蛋白表达有助于对抗光漂白，但这种方法无法支持目标荧光标记物的持续表达。如果需要持续表达，例如在较晚发育阶段对胚胎进行成像，则可考虑使用转基因品系，而在斑马鱼中构建新的转基因品系是相对简单可行的24。

接下来，该方案可针对发育的后期阶段进行调整。由于色素可能阻碍后期阶段的成像，可使用苯硫脲（PTU）处理胚胎以抑制色素形成，或选用色素合成相关的遗传突变体。为防止胚胎抽搐，可在琼脂糖以及覆盖胚胎的培养基溶液中添加三卡因（tricaine），并根据需要调整琼脂糖的浓度。随着眼睛的生长，可能需要改变胚胎的包埋方向；本文中我们采用背侧朝下包埋胚胎，但在后期阶段，根据所关注的结构，可能采用侧向或前向包埋更为合适。由于不同生物学过程发生在不同的时空尺度上，因此可优化图像采集时的Z轴步进（Z-step）和时间间隔（time step）。这些参数的具体设置通常只能根据各实验室的具体需求通过实验经验来确定。

最后，本方案是专门为激光扫描共聚焦显微镜设计的，适用于在眼睛发育早期阶段将胚胎包埋于相对高浓度的琼脂糖中进行成像。如果需要在眼睛发育的不同时间点或不同位置进行成像，则需针对具体的研究过程对本方案进行相应调整。目前已有多种不同的成像方法可供选择，且光学工程师仍在不断开发新的技术。每种方法都带来一系列独特的挑战，包括胚胎包埋与装载方式的差异，以及图像文件大小和格式的不同。我们在引言中概述了相关考虑因素，以指导优化过程，在空间和时间分辨率最大化的同时，平衡光漂白、光毒性和巨大的文件体积等问题。我们希望，除了上述实用信息外，这些通用原则也能帮助其他研究者建立延时成像方法，以探索眼睛发育领域中诸多尚未解决的科学问题。

脊椎动物眼睛的发育始于视泡从未来脑部的神经上皮中突出或外翻。随后，视泡经历一系列组织形态变化，先伸长，再内陷形成视杯。在视杯中，源自神经上皮的神经视网膜和视网膜色素上皮共同包裹由表面外胚层发育而来的晶状体原基。整个过程需要神经上皮、外胚层以及间充质细胞群体之间协调复杂的细胞与组织运动及分子信号传导。这些早期事件建立了眼睛的基本结构，后续的眼睛发育步骤（包括虹膜和角膜的形成）均是在早期结构基础上的进一步完善。早期眼睛发育与形态发生过程的异常是人类多种视觉障碍疾病的基础，包括无眼球症、小眼球症和眼缺损症。揭示调控视杯形态发生的细胞与分子机制，对于深入理解视觉系统的发育过程以及这些过程出错所导致的病理状况至关重要&#160;。
我们对脊椎动物眼睛发育和形态发生的理解源于大量研究工作，这些研究涵盖了从经典的组织学研究到在多种模式生物（包括小鼠、鸡、青蛙和鱼类）中进行的胚胎学和遗传学方法1,2,3,4,5。尽管这些研究建立了调控早期眼发育的分子机制，但长期以来人们对眼睛形态发生过程——即其三维结构的形成——仍缺乏深入理解。大部分相关发现来自于在特定时间点对胚胎切片进行成像。虽然这种方法足以提供二维层面的组织形态视图，但形态发生本身是一个动态的三维过程。为了明确组织形状如何随时间在三维空间中变化、单个细胞的行为方式，以及这些细胞行为如何促成三维组织形态的改变，必须采用不同的研究方法。
解决这一重要知识空白的一种方法是活体成像，该技术能够在器官形成过程中实时动态地观察细胞和组织。然而，由于胚胎发育的限制，许多模式生物中难以轻易实现这一技术。例如，小鼠和鸡的胚胎（分别在子宫内或蛋壳内发育）不易接触，且许多活体胚胎不具备良好的光学透明性，导致严重的光散射，限制了成像的深度。斑马鱼具有体外发育和透明胚胎的特点，为开展眼球形态发生过程的活体成像提供了独特的机会6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。此外，目前已有大量可用的转基因和突变品系，以及用于构建新的转基因和突变体的工具20,21,22,23,24。更重要的是，斑马鱼的视杯形态发生过程进展迅速，仅在受精后12至24小时（hpf）的12小时内完成，使得对整个过程进行成像成为可能。
活体成像技术的发展得益于荧光蛋白家族的不断拓展与优化，这些荧光蛋白可用于亚细胞结构的遗传编码活体标记，同时显微镜技术的改进与创新也推动了该领域进步。本文所述方案采用激光扫描共聚焦显微镜，而非其他现有的斑马鱼胚胎发育成像方法，如转盘共聚焦显微镜、选择性平面照明显微镜（SPIM及其变体）以及其他更为专业的显微技术。针对发育中的斑马鱼眼睛，我们发现转盘共聚焦显微镜在对组织深层成像时效果不足。尽管SPIM具有极快的成像速度并正被越来越广泛地使用，但其产生的大数据集在可视化与分析方面仍存在挑战。相比之下，激光扫描共聚焦显微镜更容易获得，尤其适合缺乏光学硬件组装经验的研究人员。我们希望激光扫描共聚焦显微镜的广泛可及性将使本方案对众多实验室具有实用价值。
本文介绍了我们用于获取视杯形态发生过程的4D数据集的方法，该方法通过对胚胎的膜结构和染色质进行全组织（in toto）标记，并使用激光扫描共聚焦显微镜进行图像采集（示意图见图1）。所使用的荧光蛋白（EGFP-CAAX 和 H2A.F/Z-mCherry）可实现单细胞分辨率的组织标记。我们利用本方案生成的数据集进行多种图像分析和可视化操作。若需标记其他亚细胞结构，本方案亦可轻松调整。为可视化细胞形态，我们选择标记质膜：使用EGFP-CAAX，其中H-ras的最后21个氨基酸作为异戊二烯化信号序列，与EGFP的C末端融合13。其他靶向质膜的荧光蛋白（例如跨膜融合蛋白或豆蔻酰化蛋白）也可能具有类似效果。为标记细胞核，我们选用H2A.F/Z-mCherry，其中mCherry与组蛋白融合13。这可确保细胞分裂过程（包括有丝分裂纺锤体的方向）能够被清晰观察。
在任何活体成像方法中，都必须权衡成像速度与信噪比、轴向分辨率以及样品保存之间的关系。我们已优化了实验方法，以最大限度提高单次运行中可成像图像的质量和胚胎数量。通常目标是观察纯合突变体胚胎中视杯形态发生过程，而该胚胎在视杯形态发生起始时表型可能与野生型难以区分，且来源于杂合子互交的后代（其中25%的胚胎为所需基因型）。通过优化并进而多重化图像采集过程，可更大概率获得纯合突变体胚胎的数据集。
时间分辨率，即体积数据（Z-stack）的采集频率，是延时成像中的一个关键因素。根据此类数据集的具体用途，对成像速度有不同的要求。本实验方案最初是为手动进行4D细胞追踪而开发的。在均匀标记的组织中追踪单个细胞，需要足够高的时间分辨率，以确保能够持续、无误地追踪任意一个细胞随时间的变化过程。我们发现，在对斑马鱼视杯形态发生过程进行Z-stack成像时，至少需要每3.1分钟采集一次，持续12小时；在此基础上，我们已优化了激光扫描共聚焦显微镜的采集参数，使得每2.5分钟即可完成对4至5个胚胎的Z-stack成像。
确定Z轴步进尺寸是实验方案优化中的关键步骤：对于三维重建与可视化，理想情况是获得各向同性数据，即Z轴步进尺寸等于XY平面的像素尺寸。然而在实际操作中，由于成像时间限制和光漂白效应，对活体样本获取此类延时成像数据极为困难。因此，根据实验对图像重建和可视化的需求，确定合适的Z轴步进尺寸至关重要，特别是需要明确X:Y:Z体素比例如何设定，才能在保证成像速度并防止光漂白的同时，最大程度地保留轴向信息。在本实验方案中，设定的体素比例为1:1:3.5（使用40倍长工作距离水浸物镜，对应0.6 µm × 0.6 µm × 2.1 µm的Z轴步进尺寸）。当采集130–140 µm的Z轴深度时，该设置可获得具有足够时间分辨率且光漂白程度较低的体积成像数据。
如上所述，本方案专门用于斑马鱼视杯形态发生过程的4D成像，实验采用整体胚胎（in toto），对细胞质膜和染色质进行标记，并使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。以下方案可轻松适应多种不同的实验需求。首先，在亚细胞结构方面，任何存在活细胞标记物的结构均可进行成像。其次，尽管本文重点仅限于视杯形态发生，但延时成像技术也可适用于眼部发育的其他阶段，例如神经发生25,26,27,28,29,30,31,32,33。对于后期发育阶段的成像，需考虑胚胎固定（因为自发性肌肉活动约在24 hpf开始）、色素沉着（约在24 hpf开始出现）、组织大小（在神经发生期间眼球体积显著增大）以及成像速度（应根据所关注过程的动态速度进行调整）。上述各项因素均可有效应对。本方案具有较强的灵活性；除了此处所述具体方案的细节之外，还包含若干通用原则，可为希望开展眼部发育其他方面活体成像的研究人员提供帮助。

<table><tbody><tr><td>Delta TPG 培养皿，0.17 mm 透明</td><td>Bioptechs</td><td>0420041500C</td><td>适用于光学兼容性的盖玻片底部</td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>总长度 14.6 cm（53/4&quot;）</td></tr><tr><td>Dumont #5、#55 或 #5SF 镊子</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>11254-20</td><td>#5 型规格：直头尖端，尖端尺寸 0.05 × 0.01 mm，不锈钢材质，长 11 cm</td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微电极拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Immersol W</td><td>卡尔·蔡司显微镜公司（Carl Zeiss Microscopy）</td><td>4449690000000</td><td>适用于水浸物镜的浸没液，无卤素，低荧光</td></tr><tr><td>显微注射模具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>含六个斜坡，一侧为 90 度斜面，另一侧为 45 度斜面</td></tr><tr><td>Microloader 吸头</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Microloader，用于填充玻璃毛细管，容量 0.5 &amp;ndash; 20 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>包含 SP6 酶混合物、10X 反应缓冲液、2XNTP&amp;frasl;CAP 溶液、GTP 溶液、pTRI-Xef、TURBO DNase、乙酸铵终止溶液、氯化锂沉淀溶液和上样缓冲液，所有组分均保存于 &amp;ndash;20&amp;deg;C。无核酸酶水可保存于任意温度</td></tr><tr><td>Nikon SMZ645 体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>用于胚胎显微注射（见图 2B）</td></tr><tr><td>NotI-HF 酶</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td>附带紫色上样染料（6X）</td></tr><tr><td>NuSieve GTG 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>高分辨率、低熔点琼脂糖</td></tr><tr><td>物镜 LD &quot;C-Apochromat&quot; 40x/1.1 W Korr M27</td><td>卡尔·蔡司显微镜公司（Carl Zeiss Microscopy）</td><td>421867-9970-000</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX16 体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX2-ZB16</td><td>用于胚胎筛选和包埋（见图 3A）</td></tr><tr><td>酚红溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>DPBS 中 0.5%，经无菌过滤，内毒素检测合格，细胞培养测试合格</td></tr><tr><td>皮升级显微注射仪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td>可进行飞升级至微升级注射；具备数字显示，用于注射次数、时间和压力；包含五种压力模式：注射、平衡、清除、填充和保持</td></tr><tr><td>移液器泵（Pipette Pump Pipettor）</td><td>SP Bel-Art</td><td>F37898</td><td>适配一次性巴斯德吸管，侧面带有拇指轮用于吸取或分配液体，配备推杆用于快速排空</td></tr><tr><td>优质薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Warner Instruments</td><td>G100T-4</td><td>1.0 × 0.78 mm</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>包含 QIAquick 离心柱、缓冲液、收集管（2 ml）</td></tr><tr><td>无 RNase 的 H2O</td><td>Invitrogen</td><td>AM9906</td><td>无 DNase，分子生物学级别，无 RNase</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>包含 RNeasy Mini 离心柱、收集管（1.5 ml 和 2 ml）、无 RNase 试剂和缓冲液</td></tr><tr><td>Z 轴压电载物台附件 WSB 500</td><td>卡尔·蔡司显微镜公司（Carl Zeiss Microscopy）</td><td>432339-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>通用型 Z 轴压电载物台插件 WSB</td><td>卡尔·蔡司显微镜公司（Carl Zeiss Microscopy）</td><td>432339-9030-000</td><td></td></tr><tr><td>配备 Airyscan 的 Zeiss LSM 880</td><td>卡尔·蔡司显微镜公司（Carl Zeiss Microscopy）</td><td>N/A</td><td>倒置 Axio Observer 显微镜</td></tr><tr><td>Zen Black 2.3 SP1 软件</td><td>卡尔·蔡司显微镜公司（Carl Zeiss Microscopy）</td><td>N/A</td><td>蔡司高效导航（ZEN）软件，用于控制所有蔡司光学显微镜系统</td></tr></tbody></table>

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

视觉系统的功能依赖于精确的组织和器官结构的建立。在脊椎动物眼中，结构缺陷是导致视力障碍的常见原因，然而眼形态发生的机制仍知之甚少。胚胎眼的基本结构在脊椎动物中高度保守，因此对斑马鱼胚胎进行活体成像已成为一种强大的方法，可在正常和病理条件下实时直接观察眼的发育过程。在胚胎中，可对包括细胞运动、形态、相互作用、分裂和死亡在内的动态细胞过程进行可视化。我们已建立了对亚细胞结构进行均匀标记以及对斑马鱼早期眼发育进行延时共聚焦显微成像的方法。本方案概述了在单细胞斑马鱼胚胎中注射加帽mRNA的制备方法、在视泡阶段（约受精后12小时，hpf）固定胚胎，以及在激光扫描共聚焦显微镜上对视杯形态发生进行多维延时成像的操作流程，从而在同一次成像过程中连续获取多组数据集。该方法所产生的数据可用于多种用途，包括细胞追踪、体积测量、三维（3D）重建和可视化分析。我们的方法使我们能够在野生型和基因突变体条件下精确定位驱动视杯发育的细胞和分子机制。这些方法可由其他研究团队直接采用，或经调整后用于可视化斑马鱼眼发育的更多其他方面。

荧光RNA注射可实现亚细胞标记 
通过注射可标记细胞质膜和组蛋白的RNA，以捕获视杯形态发生过程中单个细胞的形态变化和运动行为。图2展示了在单细胞阶段对斑马鱼胚胎进行显微注射的各个步骤。简而言之，斑马鱼交配后（图2E），收集胚胎并装入注射模具中（图2J）。用微量注射针反向填充试剂（图2H），并将样品直接注入单个细胞内（图2K-M），这是实现均匀标记所必需的操作（图2M，图4I-I'''，视频1）。除均匀标记外，还可观察到强烈的荧光信号，且胚胎发育未受干扰（图3B-B''）。
有效封片对于12-24 hpf期间的延时成像观察视杯形态发生至关重要 
为了对在较长时间内发生的视杯形态发生过程进行成像，关键在于选择理想的胚胎，并在包埋过程中正确地定位每个样本。图3详细展示了11 hpf胚胎成功封片的操作步骤。首先筛选注射后的胚胎，确保其具有足够的荧光信号（图3B'、B''、F''、F'''）。将单个胚胎浸入琼脂糖中（图3C、C'），并以背侧朝上方式置于单独的琼脂糖液滴中进行封片（图3D、D'）。所有样本最终集中封片于同一块琼脂糖圆盘中（图3E-F'）。当胚胎发育阶段准确、荧光强度足够且封片位置适当时（图3G），在延时成像过程中样本将保持在成像视野内，从而实现对整个器官的完整成像（图4G-G''、I-I'''、视频1）。若上述任一环节未达到要求，则所封片的胚胎将不适合作为延时成像的优质样本。封片时微小的旋转角度偏差，都会显著影响延时过程中胚胎的生长方向。图3展示了非理想旋转的示例：胚胎过度旋转（图3I）会导致成像区域偏向后部；而旋转不足的胚胎（图3J）则仅能观察到最前端的组织。除了封片时需保证适当的旋转角度外，样本相对于成像视野方向的正确定位也更有可能获得成功的延时成像结果（图4G-G''、I-I'''、视频1）。理想的样本应垂直放置于培养皿中，其前后轴与钟面的12点和6点方向对齐（图3G）。非理想样本则是未沿此轴向定位的样本，例如呈水平或对角线方向放置者（图3H）。此类样本在延时成像过程中会逐渐生长出视野范围，无法用于后续分析（图4H-H''、J-J'''）。
获取适用于后续分析的时间序列数据集 
准确注射、培养和封片的胚胎将获得成功的共聚焦成像样本。图4展示了一个理想的时间序列样本：荧光均匀，且胚胎处于12小时（hpf）发育阶段。成像时设定的Z轴层扫范围应使第一层切片位于视泡背侧稍上方，而最后一层切片则延伸至12 hpf视泡腹侧边界以下数层（图4G-G''）。这种偏向腹侧的设置为组织在腹侧方向的生长预留了充足空间。当满足上述条件时，即可获得理想的时间序列图像（图4I-I'''，视频1）。次优样本表现为马赛克式或荧光微弱、已发育超过12 hpf（此时视杯形态发生正在进行中），或在Z轴层扫或XY平面中位置不佳（图4H-H''）。若不满足这些标准，时间序列图像将无法完整捕捉组织发育过程中的全部三维结构，因而不能用于进一步分析（图4J-J'''）。
<img alt="mRNA合成、显微注射、视泡期设置、延时成像；科学方法示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62155/62155fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：斑马鱼视杯形态发生过程的4D延时成像工作流程。（A）为荧光标记感兴趣的亚细胞结构，合成相应的加帽mRNA。（B）在受精后单细胞阶段，将mRNA显微注射到斑马鱼胚胎中。（C）在视泡期（约受精后11小时或3体节期），将胚胎背侧朝下固定，或头部朝下放置于倒置共聚焦显微镜上。（D）可在一次延时成像过程中依次对多个胚胎进行成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/62155fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因工程过程；显微镜、移液器、实验室设备设置；胚胎细胞注射。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62155/62155fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：单细胞斑马鱼胚胎显微注射的可视化指南。（A）注射工具包中应包含的物品（顺时针方向）：可容纳全套工具的中等大小盒子，内含一次性丁腈手套；装有显微注射针的培养皿；镊子；矿物油分装液及裁剪好的Parafilm膜小方块；微量上样吸头；置于冰上的稀释RNA；琼脂糖注射模具；记号笔；滚轴/转移移液管；以及P10移液器。（B）显微注射装置：体视显微镜旁放置一台连接外部压缩气源的皮升注射仪（pico-injector）。脚踏开关和显微操作器与皮升注射仪相连。显微操作器配备针头夹持器，并固定在显微镜载物台上方。（C）琼脂糖注射模具，包含六排凹槽，一侧为90度角，另一侧为45度角。（D）皮升注射仪前面板。压力显示为7.8 PSI；可通过标有Pinject的旋钮进行调节。其下方设有按钮，用于手动触发注射压力、调节注射时间，或执行清空、填充或保持针内液体的操作。注射时间设定为08（相当于8 × 10毫秒）。输出软管连接至Pout，并与注射针相连。在设定注射压力时，压力表源开关置于Pinject位置；也可切换至Pbalance 以调节未注射时施加于针头的基础压力。Pbalance 调节旋钮位于Pinject调节旋钮旁。电源按钮亮起，表示仪器已开启。（E）成年斑马鱼在小型繁殖缸中交配，缸内设有带网状底部的嵌套内缸，可将成鱼与受精卵分离，便于卵的收集。降低水位以模拟浅水环境，并移除缸内隔板以启动交配行为。（F）微毛细管（针头）拉制仪前面板：显示屏显示用于拉制针头的具体参数。压力设定为P = 500，随后显示程序最后一次编辑的日期和时间、程序编号、HEAT = 546、PULL = 130、VEL = 70、TIME = 90。（G）将一根玻璃毛细管插入微毛细管（针头）拉制仪并固定到位。每次程序化拉制运行可产生两根长而尖细的针头（红色箭头所示）。（H）将稀释后的RNA通过反向加载方式注入针头；酚红染料使溶液易于观察。（I）针尖断裂后，使用解剖显微镜目镜测微尺测量RNA液滴体积。对于该体视显微镜，在总放大倍数30倍下，6个刻度线对应1 nL体积。（J）将受精卵装入琼脂糖注射模具中，并用滚轴移液管沿模具凹槽分布。（K）将含有单细胞期胚胎的注射模具置于显微镜下，依次对胚胎进行注射。（L）将注射针插入每个胚胎，靶向单个细胞。（M）针头进入细胞后，踩下脚踏开关，触发受控压力，将1 nL RNA释放至胚胎细胞内（通过酚红显色可见）。比例尺：I = 0.1 mm；L、M = 0.5 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/62155fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于胚胎分析的显微镜装置、体视显微镜、移液器使用、样本观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62155/62155fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：用于成像的胚胎封片操作示意图。（A）封片装置（从左到右）：设定为 42 °C 的加热金属块，用于加热低熔点琼脂糖管；滚轴移液器；一对镊子；盛有去壳胚胎的涂有琼脂糖的培养皿；以及连接金属卤化物荧光灯的解剖体视显微镜。（B, B', B''）注射了 EGFP-CAAX mRNA 和 mCherry-H2A mRNA 的 11 hpf 胚胎，分别在明场、GFP 荧光和 mCherry 荧光下观察。（C, C'）一支巴斯德玻璃移液管，其尖端含有琼脂糖和一个胚胎；C' 为放大视图。（D, D'）一个胚胎被封片于玻璃底培养皿中的一滴低熔点琼脂糖内，图中分别从显微镜载物台视角和目镜视角展示。（E, E'）12 个胚胎分别被封片于玻璃底培养皿中独立的低熔点琼脂糖液滴内，图中分别从显微镜载物台视角和目镜视角展示。（F, F', F'', F'''）所有封片后的胚胎均覆盖一层完整的琼脂糖，以填满培养皿底部，图中分别从显微镜载物台和目镜视角在明场下观察；F'' 为 GFP 荧光图像；F''' 为 mCherry 荧光图像。（G）一个理想的 12 hpf 样本，以背侧朝上方式封片，并垂直方向对齐于 12 点和 6 点钟位置，两个视泡处于同一焦平面内。（H）一个次优样本：虽然以背侧朝上方式封片且两个视泡彼此共面，但该样本沿对角线方向倾斜，在发育过程中将移出视野范围。（I）一个次优样本：该样本过度旋转，未实现背侧封片，因此在延时成像中无法捕捉到视泡的前部区域。（J）一个次优样本：该样本旋转不足，未实现背侧封片，因此在延时成像中无法捕捉到视泡的后部区域。虚线表示每个视泡的位置。比例尺：B = 0.1 mm；D' = 1.5 mm；E', F' = 2.5 mm；G = 0.1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/62155fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光分析的显微镜装置与软件；最佳与次优的细胞成像结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62155/62155fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：多点延时成像的设置及可能的结果。（A）激光扫描共聚焦显微镜。（B）压电Z轴载物台插件。（C）玻璃底培养皿底部涂有与水折射率匹配的浸没介质，其中胚胎被包埋于琼脂糖中。（D）在40倍水镜（长工作距离）上滴加一滴浸没介质。（E）使用载物台插件固定培养皿，在琼脂糖层上方加入E3培养基，并用油泥密封盖子。（F）采集软件设置：从下拉菜单中开启所需的激光线。对于注射了EGFP-CAAX RNA和H2A-mCherry RNA的胚胎，开启氩离子激光和DPSS 561-10激光。红色高亮表示氩离子激光正在预热。通过显微镜控制面板开启透射光以定位样品。EGFP和mCherry均分配至Track 1（用于同时成像），并设置每个探测器的检测范围。此处，EGFP的检测范围设为494–545 nm，mCherry的检测范围设为598–679 nm。在Channels（通道）菜单下可设置激光功率。激光预热完成后，功率可增至最高5.0，增益（主增益）也可进行调节。针孔设为60.2，相当于1.63艾里单位或1.6 µm切片厚度。在Acquisition（采集）菜单下，帧尺寸设为512 × 384，扫描速度为9.0，平均模式为双向，缩放倍数设为0.7。在Z-Stack（Z轴层扫）菜单下，共聚焦扫描过程中设定Z轴的起始与终止位置。步进间隔（步长）设为2.1 µm。在选择起始和终止Z位置时，通常保持63层的标准层数，以适应眼球的整体发育。勾选“use piezo”（使用压电）选项。在Positions（位置）菜单下，列出所有选定的位置，包括编号及X、Y、Z坐标。另有按钮用于控制需成像的胚胎数量（独立位置），包括添加、更新或删除。在Time Series（时间序列）菜单下，循环次数设为300（即采集的Z层堆栈总数），时间间隔（时间步长）设为2.5分钟。设置完成后，点击“开始”按钮启动延时成像。软件将显示当前正在扫描的Z层切片、循环次数和位置。延时成像结束后，点击Images and Documents（图像与文档）面板中的软盘图标保存文件。（G–J）细胞膜（绿色）由EGFP-CAAX标记，细胞核（染色质，品红色）由H2A-mCherry RNA标记。（G, G', G''）一个理想样品设置首尾Z切片的示例。首个Z切片（背侧）以牺牲部分背侧外胚层为代价，而最后一个Z切片（腹侧）位于视泡下方较远处，以适应其向腹侧的生长。（H, H', H''）一个次优样品设置首尾Z切片的示例。该样品mCherry荧光较弱，且安装角度倾斜，导致发育中的视杯在延时成像过程中难以保持在视野内。（I, I', I'', I'''）来自理想样品的延时成像示例。从整个63层Z堆栈的中间层面提取单层图像，共显示4个时间点（T值）。Br，脑；NR，神经视网膜；RPE，视网膜色素上皮；Le，晶状体。（J, J', J'', J'''）来自次优样品的延时成像示例。本例中，样品移出了Z平面，仅捕获到前部视杯的斜切部分。比例尺：G、I = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/62155fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：野生型理想胚胎中视杯形态发生的延时成像。 显示一个野生型胚胎的背侧视图，该胚胎标记了 EGFP-CAAX（细胞膜，绿色）和 H2A.F/Z-mCherry（染色质，品红色）。延时成像时间为约 12–24 hpf，取自完整的 4D 数据集中的单个共聚焦层面。z 层扫描间的时间间隔为 2.5 分钟，视频播放速度为每秒 22.5 帧。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/Movie1.mov" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。

视觉系统功能的实现依赖于精确的组织和器官结构的建立。在脊椎动物眼球中，结构缺陷是导致……的常见原因。

我们对眼球形态发生过程的理解来源于以往的固定组织研究。然而，这些研究缺乏对细胞和组织动态变化的观察。通过使用延时成像技术，我们能够完整地记录这一过程，以进行可视化和分析。我们的方法利用了斑马鱼胚胎在体外发育过程中透明度高的优势，便于进行活体成像，并结合大多数科研单位普遍配备的激光扫描共聚焦显微镜进行观察。初次使用该方法的研究人员应预期在获得可用数据集之前需要经历一定的尝试与优化过程。许多步骤，特别是显微注射和包埋操作，必须顺利执行才能确保成功，因此请保持耐心。当斑马鱼开始繁殖后，在等待15至20分钟以确保卵子受精的同时，使用P10移液器和P10微升吸头反向加载一支拉制的玻璃毛细管显微注射针，吸入2.5至5微升目标RNA稀释液。当卵子准备就绪后，使用转移移液器和解剖显微镜小心地将卵子转移至注射模具中，并根据需要使用镊子轻轻滚动胚胎，使单细胞清晰可见。随后在单细胞阶段对所有胚胎进行注射，应靶向细胞而非卵黄，以确保胚胎发育过程中标记均匀。受精后约11小时，将1至5毫升含1.6%低熔点琼脂糖的E3培养基置于42摄氏度的加热块中，并使用荧光显微镜筛选注射成功的胚胎，观察其整体荧光亮度。通过计数体节对胚胎进行准确分期。在受精后11小时，应观察到三个体节。理想的样本应具有强烈的EGFP和mCherry信号，并处于正确的发育阶段。在封片前，将胚胎置于涂有琼脂的培养皿中，用镊子去除每个胚胎的卵膜。当所有胚胎均去膜后，使用玻璃滚吸管吸取一个胚胎。尽可能排出E3溶液，使胚胎位于玻璃巴斯德吸管的尖端，然后将胚胎滴入置于加热块上的琼脂糖管中。让胚胎在琼脂糖中沉降数秒钟，随后小心吸取少量琼脂糖连同胚胎一起吸入，注意保持胚胎始终位于吸管尖端。将胚胎和琼脂糖排出至玻璃底培养皿中的琼脂糖液滴内，并迅速而谨慎地使用镊子在琼脂糖液滴凝固前将胚胎调整为背侧朝下。 以相同方式固定10至12个胚胎后，加入足量琼脂糖，使其完全覆盖培养皿底部，将所有液滴包裹在单个琼脂糖凝胶片中。待琼脂糖凝固后，在其上方覆盖E3培养基，以保持样品湿润。将激光扫描共聚焦显微镜设置为适合延时成像的参数后，将匹配水折射率的浸没液大量涂抹于玻璃底培养皿的底部，注意避免产生气泡，并在40X水镜物镜上滴加少量浸没液。将玻璃底培养皿固定在载物台插件中，并添加额外的 E3 培养基以保持胚胎整夜湿润。使用油泥密封塑料盖，覆盖在培养皿上，并升高物镜使其与培养皿接触。在显微镜软件的“位置”标题下，单击“添加”以保存第一个待进行延时成像样品的 XYZ 信息，并选择一个荧光较强且封片效果理想的样品。在“定位”选项卡下，搜索下一个样本，点击“定位”并点击“添加”以选择该样本，操作方法如演示所示。当所有样本均被选中后，高亮第一个位置，然后点击“移动到”。在连续扫描过程中，将视泡对准画面内，并在视泡和脑部的前部及远端区域留出充足空间。设定第一和最后一个Z层面时，使用微调焦旋钮在Z方向上移动，同时选择“设定第一个”和“设定最后一个”，并保持总层数约为63，以适应视杯的生长。在视泡腹侧留出额外空间，以容纳其生长。一旦设定了第一和最后一个Z层面，单击C键移动至Z层栈的中心，并调整两个激光器的激光功率和增益。当激光功率和增益设置完成后，停止扫描并点击“更新”以更新位置信息。要移动到下一个位置，请点击“位置二”。当如示例所示定义了第一个和最后一个Z层切片后，打开时间序列设置，将循环次数设置为300，时间间隔设置为2.5分钟。在检查设置以确保所有参数均已确定后，单击“开始”以启动延时成像，并确认第一轮成像已正确捕获，然后方可让延时成像过夜运行。单细胞的直接注射对于实现均匀标记和强荧光信号是必要的。胚胎浸入琼脂糖后，应在培养皿中均匀分布。如果胚胎的分期正确、荧光信号足够强且装片得当，则在延时成像过程中将保持在成像视野内，从而实现对整个器官的完整成像。若样本未沿背侧轴向正确摆放，例如呈水平或对角方向，则在延时成像过程中会移出视野范围，因而无法用于后续分析。胚胎过度旋转将导致延时成像偏向更后部的区域。旋转不足的胚胎将仅能观察到最前端的组织。此外，相对于成像框方向进行固定的样品更有可能获得成功的延时成像。这种对腹侧的偏向为组织在腹侧方向的生长提供了额外空间，从而实现最佳的延时成像效果。当这些条件未满足时，延时成像将无法再完整捕捉组织发育过程中的整个三维体积，因而不能用于进一步分析。这些信息丰富的数据集可通过多种方式进行分析，包括进行细胞速度和轨迹定量的四维细胞追踪、细胞和组织体积测量，以及三维和四维可视化。

4-dimensional-imaging-of-zebrafish-optic-cup-morphogenesis

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