斑马鱼光学杯形态形成的四维成像
2021年5月26日
本协议描述了斑马鱼早期眼睛发育的托托标记和多维成像方法。我们使用激光扫描共聚焦显微镜描述标签、嵌入和四维（4D）成像，以及优化数据集获取以解剖光学杯形态发生机制的考虑因素。
我们对眼形态形成的理解来自以前的固定组织研究。然而，这些研究缺乏细胞和组织动力学。使用延时成像，我们能够捕获整个过程进行可视化和分析。
我们的方法，利用斑马鱼胚胎的光学清晰度的外部发展，促进活成像，并使用激光扫描共聚焦显微镜，这是在大多数研究校园很容易获得。新采用这种方法的研究人员在获取可用数据集之前，应该会进行一些试验和错误。许多步骤，特别是注射和嵌入，必须顺利进行，才能成功，所以要有耐心。
一旦斑马鱼开始繁殖，同时等待15至20分钟，以确保卵子成为受精，使用P10移液器和P10微升尖端背负拉玻璃毛细管微注射针与2.5至5微升的RNA稀释的兴趣。当卵子准备好时，使用转移移液器和解剖显微镜小心地将卵子装入注射模具中，使用钳子滚动胚胎，使单个细胞在必要时可见。然后在单细胞阶段注射所有胚胎，瞄准细胞而不是蛋黄，以确保发育中的胚胎有一个统一的标签。
施肥后约11小时，在42摄氏度的热阻隙中，将E3介质中1.6%低熔化糖的1至5毫升的藻类放在中间，并使用荧光显微镜筛选成功注射的具有整体荧光亮度的胚胎。数一数，使胚胎正常分期。施肥后11小时，应观察到三个闷闷不乐。
理想的样品将具有强大的EGFP和mCherry信号，并处于正确的发展阶段。安装前，将胚胎放入一个涂有琼脂的盘子中，并用钳子从每个胚胎中取出胆汁。当所有的胚胎都被否认时，用玻璃滚筒移液器吸气一个胚胎。
弹出尽可能多的E3，使胚胎坐在玻璃巴斯德移液器的尖端，并下降胚胎到从热块的气管。让胚胎沉入气管几秒钟，然后与胚胎一起吸气少量的阿加罗斯，小心胚胎保持在移液器的尖端。将胚胎和藻子喷射到玻璃底盘中的玫瑰滴中，并快速但小心地使用钳子在玫瑰滴硬化之前将胚胎的侧面向下定向。
以同样的方式安装 10 到 12 个胚胎后，加入足够的阿加罗斯，以完全覆盖包裹在单个玫瑰盘中所有液滴的盘子底部。当藻糖变硬时，在阿加罗斯上层 E3 以保持样品水分。将激光扫描聚焦显微镜设置到适当的延时成像参数后，将玻璃底盘的底面涂上浸入介质，与水的折射度指数相匹配，注意避免气泡，并将一小滴浸入介质涂抹到 40 倍水目标上。
固定舞台插入的玻璃底盘，并添加额外的E3介质，以保持胚胎在一夜之间湿润。使用建模粘土将塑料盖密封在盘子上，并提高与菜肴接触的目标。在显微镜软件的标题下，单击添加以保存第一个样品的 XYZ 信息，以便延时，并选择具有强荧光和最佳安装的示例。
在定位选项卡下，搜索下一个示例并单击位置并添加以选择所示示的示例。当所有示例都已选中时，突出显示第一个位置并单击移动到。在持续扫描时，将光学囊泡排列在框架内，相对于光学囊泡和大脑，在前部和相交区域留出充足的空间。
要分配第一个和最后一个 Z 切片，请选择设置第一和设置最后，同时通过 Z 方向与精细的焦点旋钮移动，保持总切片数量约 63，以适应光学杯的生长。包括光学囊泡的腹腔侧的额外空间，以留出生长空间。设置第一个和最后一个 Z 切片后，单击 C 以移动到 Z 堆栈的中心，并调整激光功率并获取两种激光。
设置激光功率和增益后，停止扫描并单击更新以更新位置信息。要移动到下一个位置，请单击位置二。一旦第一个和最后一个 Z 切片被定义为演示，打开时间系列标题并将周期数设置为 300，时间间隔设置为 2.5 分钟。
在查看设置以确保所有内容都完成后，单击开始延时并确认第一轮成像捕获正确，然后才允许延时运行一夜。直接注射到单个细胞是统一标签和强力荧光的必要条件。当胚胎沉浸于高糖中时，胚胎应在整个盘子中均匀地间隔。
如果胚胎的分期正确、荧光充足且安装充分，它们将在延时期间保持在成像框架中，从而能够对整个器官进行成像。不沿正点轴方向的样本（如水平或对角线的样本）会随着延时而从成像框架中长出，无法用于进一步分析。过度旋转的胚胎会导致更后延。
旋转不足的胚胎只能观察到最前组织。此外，安装在框架方向上的样品更有可能产生成功的延时。这种对腹腔侧的偏向为腹腔方向的组织生长提供了额外的空间，从而产生最佳的延时。
当不符合这些标准时，延时将不再捕获组织发展的整个 3D 体积，无法用于进一步分析。这些信息丰富的数据集可以通过多种方式进行分析，包括具有细胞速度和轨迹量化的 4D 细胞跟踪、细胞和组织体积测量以及 3 和 4D 可视化。
Overview
This study outlines a protocol for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. By utilizing laser scanning confocal microscopy, the method captures cell and tissue dynamics during optic cup morphogenesis, providing insights into the temporal and spatial aspects of this biological process.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Developmental Biology
- Imaging Techniques
Background
- Previous studies on eye morphogenesis lacked dynamic insights.
- Time-lapse imaging allows for visualization and analysis of developmental processes.
- Zebrafish embryos provide optical clarity for live imaging.
- Laser scanning confocal microscopy is widely available in research settings.
Purpose of Study
- To optimize methods for labeling and imaging zebrafish early eye development.
- To detail the procedures needed for successful data acquisition.
- To present a reliable approach for dissecting mechanisms behind optic cup morphogenesis.
Methods Used
- Laser scanning confocal microscopy for 4D imaging.
- Zebrafish embryos used as a biological model.
- Key steps include precise injection, embedding, and sequential imaging.
- Important to ensure proper staging and mounting of embryos for optimal results.
- Involves incubation and specific pipetting techniques to manipulate embryos.
Main Results
- The protocol aids in capturing dynamic changes during eye development in zebrafish.
- Successful imaging requires uniform labeling and correct positioning of embryos.
- Data acquisition facilitates new insights into optic cup formation.
- Ensures embryos remain observable throughout the imaging process for comprehensive analysis.
Conclusions
- This study demonstrates a robust approach to visualize and analyze eye morphogenesis in zebrafish.
- The methodology provides a foundation for further studies on developmental mechanisms.
- Implications extend to understanding dynamic developmental processes and potential applications in regenerative biology.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
1-Cell Zebrafish Embryo Microinjection
1:32
Optic Vesicle Stage Zebrafish Embryo Mounting
3:14
Multiple Position Confocal Timelapse Laser Scanning Confocal Microscopy
5:32
Results: Representative 4D Zebrafish Optic Cup Morphogenesis Imaging
6:53
Conclusion
