斑马鱼视杯形态发生的四维成像

我们对眼球形态发生过程的理解来源于以往的固定组织研究。然而，这些研究缺乏对细胞和组织动态变化的观察。通过使用延时成像技术，我们能够完整地记录这一过程，以进行可视化和分析。

我们的方法利用了斑马鱼胚胎在体外发育过程中透明度高的优势，便于进行活体成像，并结合大多数科研单位普遍配备的激光扫描共聚焦显微镜进行观察。初次使用该方法的研究人员应预期在获得可用数据集之前需要经历一定的尝试与优化过程。许多步骤，特别是显微注射和包埋操作，必须顺利执行才能确保成功，因此请保持耐心。

当斑马鱼开始繁殖后，在等待15至20分钟以确保卵子受精的同时，使用P10移液器和P10微升吸头反向加载一支拉制的玻璃毛细管显微注射针，吸入2.5至5微升目标RNA稀释液。当卵子准备就绪后，使用转移移液器和解剖显微镜小心地将卵子转移至注射模具中，并根据需要使用镊子轻轻滚动胚胎，使单细胞清晰可见。随后在单细胞阶段对所有胚胎进行注射，应靶向细胞而非卵黄，以确保胚胎发育过程中标记均匀。

受精后约11小时，将1至5毫升含1.6%低熔点琼脂糖的E3培养基置于42摄氏度的加热块中，并使用荧光显微镜筛选注射成功的胚胎，观察其整体荧光亮度。通过计数体节对胚胎进行准确分期。在受精后11小时，应观察到三个体节。

理想的样本应具有强烈的EGFP和mCherry信号，并处于正确的发育阶段。在封片前，将胚胎置于涂有琼脂的培养皿中，用镊子去除每个胚胎的卵膜。当所有胚胎均去膜后，使用玻璃滚吸管吸取一个胚胎。

尽可能排出E3溶液，使胚胎位于玻璃巴斯德吸管的尖端，然后将胚胎滴入置于加热块上的琼脂糖管中。让胚胎在琼脂糖中沉降数秒钟，随后小心吸取少量琼脂糖连同胚胎一起吸入，注意保持胚胎始终位于吸管尖端。将胚胎和琼脂糖排出至玻璃底培养皿中的琼脂糖液滴内，并迅速而谨慎地使用镊子在琼脂糖液滴凝固前将胚胎调整为背侧朝下。

以相同方式固定10至12个胚胎后，加入足量琼脂糖，使其完全覆盖培养皿底部，将所有液滴包裹在单个琼脂糖凝胶片中。待琼脂糖凝固后，在其上方覆盖E3培养基，以保持样品湿润。将激光扫描共聚焦显微镜设置为适合延时成像的参数后，将匹配水折射率的浸没液大量涂抹于玻璃底培养皿的底部，注意避免产生气泡，并在40X水镜物镜上滴加少量浸没液。

将玻璃底培养皿固定在载物台插件中，并添加额外的 E3 培养基以保持胚胎整夜湿润。使用油泥密封塑料盖，覆盖在培养皿上，并升高物镜使其与培养皿接触。在显微镜软件的“位置”标题下，单击“添加”以保存第一个待进行延时成像样品的 XYZ 信息，并选择一个荧光较强且封片效果理想的样品。

在“定位”选项卡下，搜索下一个样本，点击“定位”并点击“添加”以选择该样本，操作方法如演示所示。当所有样本均被选中后，高亮第一个位置，然后点击“移动到”。在连续扫描过程中，将视泡对准画面内，并在视泡和脑部的前部及远端区域留出充足空间。

设定第一和最后一个Z层面时，使用微调焦旋钮在Z方向上移动，同时选择“设定第一个”和“设定最后一个”，并保持总层数约为63，以适应视杯的生长。在视泡腹侧留出额外空间，以容纳其生长。一旦设定了第一和最后一个Z层面，单击C键移动至Z层栈的中心，并调整两个激光器的激光功率和增益。

当激光功率和增益设置完成后，停止扫描并点击“更新”以更新位置信息。要移动到下一个位置，请点击“位置二”。当如示例所示定义了第一个和最后一个Z层切片后，打开时间序列设置，将循环次数设置为300，时间间隔设置为2.5分钟。

在检查设置以确保所有参数均已确定后，单击“开始”以启动延时成像，并确认第一轮成像已正确捕获，然后方可让延时成像过夜运行。单细胞的直接注射对于实现均匀标记和强荧光信号是必要的。胚胎浸入琼脂糖后，应在培养皿中均匀分布。

如果胚胎的分期正确、荧光信号足够强且装片得当，则在延时成像过程中将保持在成像视野内，从而实现对整个器官的完整成像。若样本未沿背侧轴向正确摆放，例如呈水平或对角方向，则在延时成像过程中会移出视野范围，因而无法用于后续分析。胚胎过度旋转将导致延时成像偏向更后部的区域。

旋转不足的胚胎将仅能观察到最前端的组织。此外，相对于成像框方向进行固定的样品更有可能获得成功的延时成像。这种对腹侧的偏向为组织在腹侧方向的生长提供了额外空间，从而实现最佳的延时成像效果。

当这些条件未满足时，延时成像将无法再完整捕捉组织发育过程中的整个三维体积，因而不能用于进一步分析。这些信息丰富的数据集可通过多种方式进行分析，包括进行细胞速度和轨迹定量的四维细胞追踪、细胞和组织体积测量，以及三维和四维可视化。