体外荧光显微镜基于动感检测的肌素特异性适应
February 4th, 2021
这里介绍的是一个过程来表达和净化肌素5a，然后讨论其特征，使用合奏和单分子体外荧光显微镜为基础的测定，以及如何修改这些方法来描述非肌肉肌素2b。
此协议可用于在蛋白质水平上描述非肌肉肌素动力学，这可以告知有助于它们在细胞中发挥作用的动体特性。这是一种快速、可重复和高度控制的方法，可用于研究各种调节条件对肌素活动的影响，告知其细胞行为。这些技术可用于研究非肌肉肌素的致病突变如何影响单分子和合奏水平的行为。
其方法的一般方法可用于其他各种细胞骨骼系统，如用微管对纯化运动素和狄宁的表征。此协议的多功能性可能会引发关于哪些氟和化学条件最合适的问题，但该方法可以相对快速地进行优化。了解如何设置和涂覆流室，为适应这些实验的各种条件打下了坚实的基础。
首先，在乙酸淀粉中准备百分之一的硝基纤维素溶液，并在组织培养板底部放置直径为125毫米的圆形滤纸。将八个方形盖子滑到架子上，用大约两到五毫升的200防乙醇彻底清洗，然后是两到五毫升的蒸馏水。然后使用过滤的气管或氮气线完全驱动盖滑。
沿着一个盖滑的一个边缘缓慢地移液10微升1%硝基纤维素溶液。用 200 微升移液器尖端的侧面以一个平滑的动作将其涂抹在盖子滑的其余部分。然后将此盖滑在组织培养盘上，将硝基纤维素侧向上。
重复此为剩余的盖滑，并允许它们干燥。用光学透镜纸擦拭显微镜滑梯，以清理大碎片。切割两片双面胶带，长度约两厘米，沿着显微镜滑梯的长边中间放置一块。
将第二块磁带放在第一块磁带下方大约两毫米处，这样两块胶带是平行的，从而形成一个流室，可以容纳大约 10 微升的溶液。小心地将其中一个硝基纤维素盖滑到胶带上，以便涂有硝基纤维素的侧面与胶带直接接触。使用移液器尖端，轻轻按压滑动胶带接口，以确保盖滑正确粘附在滑动上。
然后用剃刀刀片切割悬在滑梯边缘的多余的胶带。为 Myosin 5a 准备解决方案，并将其保留在冰上。在肌素 5a 的 10 微升中流过滑梯流室，等待一分钟。
然后与 DTT 一起在动能缓冲器中以每毫升 1 毫克 BSA 的 10 微升流量流动。重复两次，在第三次洗涤后等待一分钟。使用纸巾或滤纸的一角，通过通道轻轻地将纸的一角放置在流动室出口处，从而将溶液槽芯入通道。
然后用 DTT 用 10 微升的动感缓冲器清洗。派佩特用一毫升注射器和一根27口径的针头切开黑色行动素溶液，然后再将该溶液引入腔室。在 50 毫摩尔 MB 中加入一毫摩尔 ATP，并加入一毫摩尔 DTT 中的黑色行为素。
接下来，用DTT和一毫摩尔ATP在50微升的动能缓冲器中流动，以耗尽自由行动的细丝室。用 10 微升的动感缓冲器用 DTT 清洗三次，以耗尽任何 ATP 的腔室。流入 10 微升 20 纳米摩尔 RH 作用素溶液，其中含有与 DTT 的动性缓冲，等待一分钟，以便将行动素丝与连接到盖滑表面的肌素 5a 进行严格结合。
用 10 微升 50 毫摩尔动性缓冲器与 DTT 清洗两次，以去除未绑定的 RH 作用性丝。流在30微升的最终缓冲。使用 561 纳米的激发波长在荧光显微镜上记录图像，以可视化 RH 作用素。
为 Myosin 5a 倒置运动性分析准备解决方案，并将其保留在冰上。用 DTT 用 10 微升的动感缓冲器清洗它们的腔室。在 DTT 的动感缓冲器中，以每毫升 1 毫克 BSA 的 10 微升流量。
重复两次，等待第三次洗涤后一分钟。使用纸巾或滤纸将纸张的一角轻轻地放置在流室出口处，从而通过通道将溶液槽芯。然后，用 DTT 用 10 微升的动感缓冲器清洗房间三次。
在使用 DTT 的动性缓冲器中流入 NeutrAvidin 溶液的 10 微升中，等待一分钟。然后用该溶液的 10 微升洗涤三次。使用大孔移液器尖端在 10 微升 BRH 作用素中流动，其中含有含有活力缓冲和 DTT 的微升。
等一下然后，用 DTT 用 10 微升的动感缓冲器洗涤三次。流在30微升的最后缓冲与10纳米摩尔肌素5a。
并立即加载到总内部反射荧光显微镜。找到 TIRF 成像的最佳对焦后，开始录制。通过执行 SDS-PAGE 评估非肌肉肌肌素 2b、基本光链和调节光链以及肌素 5a 和镇静素的净化。
滑翔动作灯丝检测显示了理想和可跟踪电影的特点，具有标记的动作细丝的流畅运动。黑色作用素洗涤确保将死肌素头从测量场中取出，进一步促进肌丝的整体平稳运动。从快车道程序获得的长丝跟踪输出图像为非肌肉肌肌素 2b 和肌素 5a。
一个代表性的直方图显示，Actomyosin 2b 滑翔速度为每秒 77 纳米。而阿克托米约辛5a的515纳米/秒。在没有甲基纤维素的情况下，肌素涂层表面的肌素丝没有紧密联系，导致它在非肌肉肌素 2b 涂层盖滑的表面附近翻滚。
使用倒置运动性检测，在表面系绳荧光作用素丝上观察到肌素运动。在将未标记的的行为素引入流细胞进行黑色行为素洗涤之前，切开未标记的动作素非常重要，这样可以顺利地转移行为素。其他实验可以研究肌素的动性如何受到肌素突变、引载蛋白、离子强度和调节蛋白的影响。
各种细胞条件可以重组为未来的研究。这些方法允许生化和生物物理研究各种肌素等形体在单分子和合奏水平上运动和机械特性的变化。
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概述
本协议详细说明了肌球蛋白5a的表达和纯化，随后使用体外荧光显微镜检测技术进行其表征。它还讨论了研究非肌肉肌球蛋白2b的修改方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 细胞生物学
- 神经科学
背景
- 肌球蛋白在细胞运动中起着关键作用。
- 了解肌球蛋白动力学对于阐明它们在细胞中的功能至关重要。
- 非肌肉肌球蛋白参与各种细胞过程。
- 表征技术可以揭示突变对肌球蛋白行为的影响。
研究目的
- 在蛋白质水平上表征非肌肉肌球蛋白动力学。
- 了解有助于细胞角色的运动特性。
- 研究调节条件对肌球蛋白运动性的影响。
使用的方法
- 整体和单分子荧光显微镜检测。
- 纯化肌球蛋白的表征。
- 荧光团和化学条件的优化。
- 实验的流通室设置和涂层。
主要结果
- 该协议快速、可重复且高度可控。
- 它允许研究非肌肉肌球蛋白中导致疾病的突变。
- 适用于其他细胞骨架系统的多功能方法。
- 针对各种实验条件的快速优化。
结论
- 了解肌球蛋白动力学增强了对细胞行为的认识。
- 该方法为未来的研究提供了坚实的基础。
- 它提出了有关健康和疾病中肌球蛋白功能的重要问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative characterization of myosin motility at single molecule and ensemble levels, providing mechanistic insights into motor protein function. It supports target validation by linking biochemical properties to cellular phenotypes, informing de-risking of myosin-directed therapeutic strategies. The approach is adaptable to disease-relevant models, facilitating preclinical evaluation of myosin isoform dynamics under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myosin mechanochemistry to clarify functional roles in cellular transport and adhesion.
- Operational Value: Provides reproducible, quantitative readouts of translocation velocity and run length for target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of how regulatory conditions or mutations alter motor protein behavior, aiding in target confidence scoring.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, fluorescence-based motility assays compatible with high-content imaging for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable parameters such as actin translocation velocity and single molecule run length for dose-response analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other cytoskeletal systems (e.g., kinesin/dynein with microtubules), enabling cross-target assay portability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Allows reconstitution of cellular conditions to study disease-causing mutations in non-muscle myosins at the protein level.
- Mechanistic De-risking: Links molecular motility defects to cellular phenotypes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical functional assessment through conserved assay format.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, offering biophysical characterization that informs structure-function relationships in motor proteins.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of myosin isoforms through direct observation of motility dynamics.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating compound effects on motor protein activity under controlled buffer conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of velocity and processivity that allow comparison across isoforms, mutants, or treatment conditions.
- Translational Research: Connects single molecule behavior to ensemble-level outputs relevant to cellular functions like cytokinesis and tension maintenance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse motor proteins across therapeutic areas, reducing assay redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in myosin mechanochemical coupling.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and standardization across laboratories through defined flow chamber preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of motility-altering mutations or regulatory effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of myosin targets based on validated functional domains and motility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence microscopy, and image analysis for motility tracking.
- Depends on access to TIRF or widefield fluorescence microscopy systems and flow chamber fabrication capabilities.
- Necessitates standardization of buffer conditions, ATP concentrations, and fluorophore selection across experimental replicates.
- Involves optimization considerations for different myosin isoforms regarding surface density, ionic strength, and regulatory protein inclusion.
- Limited by the need for purified, functional protein preparations; activity may be affected by tags, degradation, or improper folding.
