基于体外荧光显微镜的运动分析技术针对肌球蛋白的特异性优化

该方案可用于在蛋白质水平上表征非肌性肌球蛋白的动力学特性，从而揭示其在细胞功能中发挥运动作用的相关性质。这是一种快速、可重复且高度可控的方法，可用于研究各种调控条件对肌球蛋白运动行为的影响，进而阐明其细胞内的功能表现。这些技术还可用于探究非肌性肌球蛋白中致病性突变如何在单分子和群体水平上影响其生物学行为。

该方法的一般性策略可应用于其他多种细胞骨架系统，例如利用微管对纯化的驱动蛋白和动力蛋白进行表征。本实验方案具有良好的灵活性，尽管这可能引发关于何种荧光染料和化学条件最为合适的问题，但该方法可在相对较短时间内完成优化。掌握流动池的组装与包被方法，将为在不同实验条件下进行适应性调整奠定坚实基础。

首先，用乙酸戊酯配制浓度为百分之一的硝酸纤维素溶液，并将直径为125毫米的圆形滤纸放置于组织培养皿底部。将八块方形盖玻片装入支架中，先用约2至5毫升的200-proof乙醇彻底清洗，再用2至5毫升的蒸馏水冲洗。然后使用过滤的空气管线或氮气管线将盖玻片完全吹干。

用移液器缓慢地将10微升1%硝酸纤维素溶液沿一个盖玻片的一边加入，然后用200微升移液器吸头的侧面以一个平滑的动作将其涂抹至盖玻片其余部分。随后将此盖玻片放置于组织培养皿上，硝酸纤维素面朝上。

对其余的盖玻片重复此操作，并使其干燥。用光学镜头纸擦拭显微镜载玻片，以清除较大的碎屑。剪下两段双面胶，每段长约两厘米，将其中一段沿载玻片长边的中部粘贴。

将第二条胶带放置在第一条胶带下方约两毫米处，使两者平行，形成一个可容纳约 10 微升溶液的流动腔室。小心地将一片硝酸纤维素盖玻片粘贴到胶带上，确保涂有硝酸纤维素的一侧与胶带直接接触。使用移液器吸头轻轻按压盖玻片与胶带的接触界面，以确保盖玻片牢固地粘附在载玻片上。

然后用剃刀片将载玻片边缘悬垂的多余胶带裁切掉。准备好 Myosin 5a 所需溶液，并置于冰上。将 10 微升 Myosin 5a 溶液注入载玻片流动池中，孵育一分钟。

然后加入10微升含有DTT的运动缓冲液中含有一毫克每毫升的BSA溶液。重复此步骤两次，并在第三次洗涤后等待一分钟。将纸巾或滤纸的一角轻轻置于流动池出口处，通过毛细作用将溶液从通道中吸出。

然后用含DTT的10微升运动缓冲液洗涤。使用1毫升注射器和27号针头吸取黑色肌动蛋白溶液，在将该溶液引入样品室之前剪切肌动蛋白丝。在含有1毫摩尔ATP的50毫摩尔MB缓冲液（含1毫摩尔DTT）中，将黑色肌动蛋白加入样品室。

接下来，加入 50 微升含有 DTT 和 1 毫摩尔 ATP 的运动缓冲液，以清除样品池中游离的肌动蛋白丝。用含 DTT 的运动缓冲液清洗 10 微升，重复三次，以耗尽样品池中残留的 ATP。加入 10 微升含有 DTT 运动缓冲液的 20 纳摩尔 RH 肌动蛋白溶液，静置一分钟，使肌动蛋白丝与附着在盖玻片表面的 Myosin 5a 发生强直结合。

用 10 微升含 DTT 的 50 毫摩尔运动缓冲液洗涤两次，以去除未结合的 RH 肌动蛋白丝。加入 30 微升终末缓冲液。使用 561 纳米激发波长在荧光显微镜下记录图像，以观察 RH 肌动蛋白。

准备用于肌球蛋白5a逆向运动实验的溶液，并将其置于冰上。用10微升含DTT的动力缓冲液冲洗样品池。注入10微升含DTT的动力缓冲液中浓度为1毫克/毫升的牛血清白蛋白（BSA）溶液。

重复此步骤两次，在第三次洗涤后等待一分钟。将纸巾或滤纸的一角轻轻置于流动室出口处，通过毛细作用将溶液从通道中吸出。然后用含DTT的10微升运动缓冲液洗涤流动室三次。

用带DTT的运动缓冲液将10微升NeutrAvidin溶液注入流动池，静置一分钟。随后用该溶液冲洗三次，每次10微升。使用宽口移液器吸头，将含DTT运动缓冲液的10微升BRH肌动蛋白溶液注入流动池。

然后等待一分钟。接着用含DTT的10微升运动缓冲液清洗三次。加入30微升终末缓冲液，其中含有10纳摩尔的Myosin 5a。

立即在全内反射荧光显微镜上进行观察。找到TIRF成像的最佳焦平面后开始记录。通过SDS-PAGE分析非肌性肌球蛋白2b、必需轻链和调节轻链，以及肌球蛋白5a和钙调蛋白的纯化结果。

滑动肌动蛋白丝实验展示了理想且可追踪的影片特征，其中标记的肌动蛋白丝表现出平滑的运动。使用黑色肌动蛋白洗涤步骤确保去除了失活的肌球蛋白头部，从而进一步促进了肌动蛋白丝整体的平滑运动。通过快速追踪程序获得了非肌型肌球蛋白2b和肌球蛋白5a的丝状物追踪输出图像。

一个代表性直方图显示，肌动球蛋白2b的滑动速度为每秒77纳米，而肌动球蛋白5a的滑动速度为每秒515纳米。在缺乏甲基纤维素的情况下，肌动蛋白丝无法紧密地与包被肌球蛋白的表面结合，导致其在包被非肌球蛋白2b的盖玻片表面附近发生翻转摆动。

使用倒置运动性测定法，通过表面固定的荧光肌动蛋白丝观察到了肌球蛋白的运动。在将未标记的肌动蛋白引入流动池进行黑化肌动蛋白洗涤前，对其进行剪切处理至关重要，这有助于肌动蛋白的顺畅转运。进一步的实验可探究肌球蛋白突变、诱导负载的蛋白质、离子强度以及调节蛋白对肌球蛋白运动性的影响。

可重建多种细胞条件以供未来研究。这些方法可用于在单分子和集合水平上，对不同肌球蛋白同工型的运动特性及机械特性进行生物化学和生物物理学研究。