Name: 体外荧光显微镜基于动感检测的肌素特异性适应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习使用体外荧光显微镜技术表征非肌肉肌球蛋白动力学特性，研究肌球蛋白5a的运动机制。该方法快速、可重复且高度可控，适用于单分子和群体水平分析疾病相关突变对肌球蛋白行为的影响。

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感谢张芳博士在准备本研究所需试剂过程中提供的技术支持。本工作由美国国家心肺血液研究所/国立卫生研究院院内研究计划基金 HL001786 资助 J.R.S.。

作者声明无利益冲突。

本文展示了一种对肌球蛋白5a和非肌型肌球蛋白2b进行纯化及体外表征的工作流程。该实验体系可用于快速、可重复地定量分析纯化的肌球蛋白构建体的机械化学特性。尽管此处展示的两种肌球蛋白仅为众多可能中的具体示例，但经过适当调整后，这些条件和方法可广泛适用于大多数肌球蛋白及其他多种分子马达蛋白。
此处讨论的实验方案可根据实验室和实验的具体需求进行调整。例如，如表达与分子生物学部分所述，本文所用蛋白是通过两种或多种病毒共感染产生的；然而，使用多表达载体（如 p-FastBac 双表达载体或 BiGBac 表达系统）同样可实现成功的蛋白表达53。
多个因素可能影响重组蛋白的顺利制备。为防止蛋白质降解，必须确保蛋白质纯化的每一步均在适当的温度下进行，所有离心步骤均在 4 °C 下完成，其余操作均在冰上进行。透析后的蛋白质样品在凝胶电泳中可能出现额外条带，这可能提示存在降解或污染。通过尺寸排阻层析或离子交换层析进行后续纯化，可提高样品纯度54。为此，...

肌球蛋白是一类利用三磷酸腺苷（ATP）水解产生的能量在肌动蛋白丝上施加作用力的马达蛋白1。肌球蛋白包含头部、颈部和尾部结构域。头部结构域含有肌动蛋白结合区以及ATP结合与水解位点。颈部结构域由IQ基序组成，可结合轻链、钙调蛋白或钙调蛋白样蛋白2,3。尾部区域具有多种功能，因肌球蛋白类别而异，包括但不限于两条重链的二聚化、货物分子的结合，以及通过与头部结构域的自抑制相互作用来调控肌球蛋白活性1。
肌球蛋白的运动特性在不同类别之间差异显著。这些特性包括占空比（肌球蛋白机械循环中与肌动蛋白结合的时间比例）和过程性（马达在脱离前沿其轨道连续行进多步的能力）4。目前已根据序列分析确定了超过40类肌球蛋白5,6,7,8。由于第2类肌球蛋白是最早被研究的一类，因此被归类为“常规”肌球蛋白；其余所有类别的肌球蛋白则相应地被归类为“非常规”肌球蛋白。
肌球蛋白5a（M5a）属于肌球蛋白5类，是一种具有持续运动能力的马达蛋白，意味着它可在解离前沿肌动蛋白行进多个步长。其占空比较高，表明在其机械循环过程中大部分时间均与肌动蛋白结合9,10,11,12,13,14。与其他肌球蛋白类似，其重链包含一个位于N端的马达结构域，该结构域具有肌动蛋白结合位点和ATP水解位点，其后为作为杠杆臂的颈部区域，含有六个IQ模体，可结合轻链（ELC）和钙调蛋白（CaM）15。尾部区域包含α-螺旋卷曲螺旋结构，使分子形成二聚体，随后为球状尾部结构域，用于结合货物。其动力学特性反映了其在黑素细胞中黑素体运输以及浦肯野神经元中内质网运输中的作用16,17。M5a被认为是典型的货物运输马达蛋白18。
2型肌球蛋白，即传统肌球蛋白，包括驱动骨骼肌、心肌和平滑肌收缩的肌球蛋白，以及非肌型肌球蛋白2（NM2）的同工型NM2a、2b和2c19非肌球蛋白2（NM2）同工型存在于所有细胞的细胞质中，在胞质分裂、细胞黏附、组织形态发生和细胞迁移中具有共同作用。19,20,21,22本文在非肌型肌球蛋白2b（NM2b）的背景下讨论传统的肌球蛋白实验方法。23与M5a相比，NM2b的占空比较低，且酶促反应速度较慢，其V最大 0.2 秒-1 23 与 M5a 的 V 相比最大 的 &#8776;18 秒-1 24值得注意的是，含有两个头部的截短型NM2b构建体在肌动蛋白上不能进行持续的运动；相反，每次与肌动蛋白结合后均产生一次动力冲程，随后分子即从肌动蛋白上解离25.
NM2b 包含两条肌球蛋白重链，每条重链具有一个球状头部结构域、一个杠杆臂（含一条 ELC 和一条调节轻链（RLC））以及一个长约 1,100 个氨基酸的 α-螺旋卷曲螺旋杆状/尾部结构域，该结构域使这两条重链形成二聚体。NM2b 的酶活性和结构状态受 RLC 磷酸化的调控23。在 ATP 存在及生理离子强度（约 150 mM 盐）条件下，未磷酸化的 NM2b 会形成一种紧凑构象，其中两个头部参与不对称相互作用，且尾部在两个位置回折覆盖在头部上方23。在此状态下，肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用较弱，且酶活性极低。当 RLC 被钙调蛋白依赖性肌球蛋白轻链激酶（MLCK）或 Rho 相关蛋白激酶磷酸化后，分子伸展，并通过尾部区域与其他肌球蛋白结合，形成包含约 30 个肌球蛋白分子的双极性丝状结构23。上述 RLC 的磷酸化还会使 NM2b 的肌动蛋白激活 ATP 酶活性提高约四倍26,27,28。这种双极性丝状排列在每一端均含有多个肌球蛋白马达，适用于收缩和张力维持功能，可相对移动具有相反极性的肌动蛋白丝23,29。因此，NM2b 在与肌动蛋白相互作用时表现为一组协同工作的马达。丝状结构内大量马达的存在使得 NM2b 丝能够在肌动蛋白丝上进行持续性运动，从而可以在体外&#160;对丝状体的持续性进行表征29。
尽管在理解肌球蛋白在细胞中的作用方面已取得进展，但仍需在蛋白质水平上深入了解其各自特性。为了在简单的蛋白质-蛋白质相互作用层面（而非细胞内环境）研究肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用，我们可以表达并纯化重组肌球蛋白，用于体外研究。此类研究的结果可为力学生物学家提供特定肌球蛋白的生物物理特性信息，而这些特性最终驱动着复杂的细胞过程12,13,14,25,29。通常，这一目标可通过在全长或截短的肌球蛋白构建体上添加亲和标签，并利用亲和层析进行纯化来实现29,30,31。此外，还可对构建体进行改造，使其包含可遗传编码的荧光蛋白，或添加可用于与合成荧光染料标记的标签。通过引入此类荧光标记，可开展单分子成像研究，以观察肌球蛋白的力学行为与动力学特征。
纯化后，可通过多种方法对肌球蛋白进行表征。可通过比色法测定其ATP酶活性，从而了解该马达蛋白在不同条件下的整体能量消耗及其对肌动蛋白的亲和力32。为了进一步研究其运动过程中的机械化学特性，还需开展更深入的实验。本文详细描述了两种基于体外荧光显微镜的技术，可用于表征纯化肌球蛋白的运动特性。
第一种方法是滑动肌动蛋白丝（gliding actin filament）检测法，可用于定量研究肌球蛋白马达的群体特性，也可用于定性评估一批纯化蛋白的质量33。尽管本文讨论了使用全内反射荧光（TIRF）显微镜进行该检测，但这些实验也可使用配备数码相机的宽场荧光显微镜有效完成，这类设备在许多实验室中都很常见34。在该检测中，将饱和量的肌球蛋白马达固定在盖玻片表面。这可通过硝酸纤维素、抗体、膜、SiO2修饰的表面（如三甲基氯硅烷）等方法实现29,33,35,36,37,38。将荧光标记的肌动蛋白丝通过盖玻片腔室，使其结合到固定在表面的肌球蛋白上。加入ATP（在研究非肌球蛋白2（NM2）时还需加入激酶）后，对腔室进行成像，以观察表面固定的肌球蛋白驱动肌动蛋白丝的转运过程。可使用追踪软件分析每根滑动肌动蛋白丝的速度和长度。分析软件还可提供移动和静止肌动蛋白丝数量的测量值，这有助于评估特定肌球蛋白制备样品的质量。通过将肌动蛋白表面锚定至其他蛋白，还可有意调节停滞丝的比例，并测量以确定肌球蛋白的负荷依赖性39。由于每根肌动蛋白丝可由大量可用的马达驱动，该检测具有高度可重复性，最终测得的速度对起始肌球蛋白浓度变化或溶液中存在其他因素等扰动具有较强的鲁棒性。这意味着该方法可轻松修改，用于研究不同条件下肌球蛋白的活性，例如磷酸化状态、温度、离子强度、溶液黏度的变化，以及表面锚定所诱导负荷的影响。尽管诸如不能水解ATP的强结合肌球蛋白“失活头”（"dead heads"）等因素可能导致肌动蛋白丝停滞，但已有多种方法可缓解此类问题，从而实现准确测量。肌球蛋白的动力学特性在不同类别间差异显著，根据所用肌球蛋白的具体类型，本检测中肌动蛋白丝滑动速度可从低于20 nm/s（肌球蛋白9）40,41到高达60,000 nm/s（Characean 肌球蛋白11）42不等。
第二种实验方法反转了肌动蛋白丝滑动实验的几何构型12。在此方法中，肌动蛋白丝被固定在盖玻片表面，从而可以观察M5a单分子或NM2b单个双极性丝的运动。该实验可用于定量分析单个肌球蛋白分子或肌丝在肌动蛋白上的运行长度和运动速度。首先，使用一种既能阻断非特异性结合又能同时实现表面功能化的化学化合物（如生物素-聚乙二醇，biotin-PEG）对盖玻片进行包被。随后加入修饰后的亲和素衍生物以活化表面，并使生物素化的肌动蛋白通过反应腔室，从而在腔室底部形成一层稳定结合的F-actin。最后，将活化并带有荧光标记的肌球蛋白（通常为1–100 nM）引入腔室，通过成像观察肌球蛋白在静止的肌动蛋白丝上的运动情况。
这些方法代表了快速且可重复的技术，可用于研究非肌性肌球蛋白和肌性肌球蛋白的动力学行为。本报告概述了分别代表非常规肌球蛋白和常规肌球蛋白的 M5a 和 NM2b 的纯化与表征流程。随后讨论了为成功捕获两种检测体系中运动过程而可实施的若干肌球蛋白特异性优化措施。
表达与分子生物学 
目的肌球蛋白的 cDNA 必须克隆至经过修饰的 pFastBac1 载体上，该载体编码 C 末端 FLAG 标签（DYKDDDDK），用于表达 M5a-HMM；或编码 N 末端 FLAG 标签，用于表达 NM2b 的全长分子23,43,44,45,46。NM2b 的 C 末端 FLAG 标签会导致蛋白在 FLAG 亲和柱上的结合能力减弱。相比之下，N 末端带 FLAG 标签的蛋白通常能较好地结合 FLAG 亲和柱23。N 末端标记的蛋白可保留其酶活性、机械活性以及依赖磷酸化的调控功能23。
本研究中使用了一种截短的小鼠 M5a 重酶解肌球蛋白（HMM）样构建体，其在 FLAG 标签与肌球蛋白重链 C 末端之间插入了 GFP。需要注意的是，与 NM2b 不同，M5a-HMM 可在 N 末端或 C 末端成功添加 FLAG 标签，并且两种构建体均具有活性。M5a 重链在第 1090 位氨基酸处被截断，GFP 与 M5a 的卷曲螺旋区域之间包含一个由三个氨基酸（GCG）组成的连接肽47。GFP 与 FLAG 标签之间未添加额外的连接肽。M5a-HMM 与钙调蛋白共同表达。全长的人源 NM2b 构建体则与 ELC 和 RLC 共同表达。RLC 的 N 末端通过一个由五个氨基酸（SGLRS）组成的连接肽与 GFP 融合。HaloTag 直接连接在 FLAG 标签上，HaloTag 与肌球蛋白重链 N 末端之间由两个氨基酸（AS）组成的连接肽相连。
两种肌球蛋白样品均从一升感染杆状病毒的Sf9细胞培养物中纯化获得，细胞密度约为 2 × 106 个细胞/mL。每种亚基所用杆状病毒的体积取决于制造商说明书中确定的病毒感染复数。对于 M5a，细胞同时感染两种不同的杆状病毒——一种表达钙调蛋白，另一种表达 M5a 重链。对于 NM2b，则同时感染三种不同的病毒——分别表达轻链 ELC、轻链 RLC 和 NM2b 重链。对于研究多种肌球蛋白（或其他多亚基复合蛋白）的实验室，该方法效率较高，因为它允许多种重链与轻链的组合，且常用轻链（如钙调蛋白）可与多种不同的肌球蛋白重链共转染。所有细胞操作均在生物安全柜中进行，并采用适当的无菌技术，以避免污染。
为了表达M5a和NM2b，通过离心收集感染后2-3天的Sf9细胞以获取重组肌球蛋白，并在-80 °C下保存。通过在4 °C下以2,800 × g离心共感染的Sf9细胞30分钟获得细胞沉淀。蛋白质纯化过程如下所述。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1 mL 注射器&lt;/strong&gt;</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2&lt;/strong&gt; M CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;溶液</td><td>VWR</td><td>10128-558</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2 M MgCl&lt;/strong&gt;&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;溶液</td><td>VWR</td><td>10128-298</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;27号针头&lt;/strong&gt;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5 M NaCl 溶液&lt;/strong&gt;</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3270</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;乙酸&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>984303</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;乙酸戊酯&lt;/strong&gt;</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anti-FLAG M2 亲和凝胶&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2220</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ATP&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生物素标记的G-肌动蛋白&lt;/strong&gt;</td><td>细胞骨架公司</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;牛血清白蛋白&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;bPEG-硅烷&lt;/strong&gt;</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bradford 试剂浓缩液&lt;/strong&gt;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;钙调蛋白&lt;/strong&gt;</td><td></td><td>PMID: 2985564</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;过氧化氢酶&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系（Sf9）在 SF-900 II SFM 中&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496015</td><td>http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;圆形滤纸 - 滑动实验&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;圆形滤纸 - 倒置实验&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001090</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>5056489001</td><td>这应于4℃保存 &amp;deg;C. 平板可直接使用，或通过将1片溶于2 mL蒸馏水中配制成25倍浓缩液。所得溶液可在4℃保存 &amp;deg;C下保存1-2周，或在-20℃下至少保存12周 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;浓缩管（100,000 截留分子量）&lt;/strong&gt;</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>UFC910024</td><td>截留分子量（MWCO）并非必须 &quot;一刀切&quot; 只要截留分子量（MWCO）小于待纯化蛋白的总分子量即可。本文中的非肌球蛋白2b（NM2b）使用截留分子量为100,000的浓缩管进行浓缩，而肌球蛋白5a（M5a）则使用截留分子量为30,000的浓缩管进行浓缩。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;考马斯亮蓝 R-250 染料&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;盖玻片架&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z688568-1EA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;盖玻片：肌动蛋白滑动丝测定&lt;/strong&gt;</td><td>VWR International</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;盖玻片：倒置运动性测定法&lt;/strong&gt;</td><td>Azer Scientific</td><td>ES0107052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;透析袋（3500 道尔顿截留分子量）&lt;/strong&gt;</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-670-5A</td><td>透析管的直径可以不同，但截留分子量（MWCO）应保持一致。本研究中使用的非肌球蛋白2b（NM2b）在18 mm透析管中进行透析。透析管可保存于4 ℃的20%乙醇溶液中。 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DL-二硫苏糖醇&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;双面胶带&lt;/strong&gt;</td><td>Office Depot</td><td>909955</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DYKDDDDK 肽&lt;/strong&gt;</td><td>GenScript</td><td>RP10586</td><td>这可以溶解在含有 0.1 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN 的缓冲液中&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，以及10 mM MOPS（pH 7.2），最终浓度为50 mg/mL。可于-20℃保存 &amp;deg;300 毫摩尔 &amp;micro;L 等分试样。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EGTA&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;洗脱柱&lt;/strong&gt;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>761-1550</td><td>这些可重复使用。清洗时，先用 2–3 柱体积的 PBS 和蒸馏水冲洗层析柱，然后在 4 °C 下冷藏保存。&amp;deg; 使用前置于冰上。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;乙醇&lt;/strong&gt;</td><td>Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;G-肌动蛋白&lt;/strong&gt;</td><td></td><td>PMID: 4254541</td><td>G-actin 储存液可保存在 200 &amp;mu;M 在液氮中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;葡萄糖&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;葡萄糖氧化酶&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;100 mM 甘氨酸缓冲液，pH 2–2.5，1 L&lt;/strong&gt;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-295018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HaloTag&lt;/strong&gt;</td><td>普洛麦格</td><td>G100A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HCl&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;KCl&lt;/strong&gt;</td><td>Fischer Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;大孔径移液器吸头&lt;/strong&gt;</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;亮肽素蛋白酶抑制剂&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78435</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mark12 未染色标准蛋白分子量标记&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5677</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;甲醇&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>MX0482</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;甲基纤维素&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜载玻片&lt;/strong&gt;</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-553-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;MOPS&lt;/strong&gt;</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;mPEG-硅烷&lt;/strong&gt;</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;肌球蛋白轻链激酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td>PMID: 23148220</td><td>FLAG标签的MLCK可采用与本文所述FLAG标签肌球蛋白相同的方法进行纯化。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NeutrAvidin&lt;/strong&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31050</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;硝酸纤维素&lt;/strong&gt;</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NuPAGE 4% 至 12% Bis-Tris 小型蛋白凝胶，15 孔&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323PK2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X)&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;磷酸盐缓冲液，pH 7.4&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PMSF&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>78830</td><td>PMSF 可用异丙醇配制成 0.1 M 的储存液，并于 4 ℃ 保存 &amp;deg;C. 加入异丙醇会导致晶体析出，但可通过室温搅拌使其溶解。使用前应立即将PMSF逐滴加入快速搅拌的溶液中，终浓度为0.1 mM。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;刀片&lt;/strong&gt;</td><td>Office Depot</td><td>397492</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;罗丹明-鬼笔环肽&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R415</td><td>可将储备液用100%甲醇稀释至终浓度为200 &amp;mu;M.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sf9培养基&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12658-027</td><td>这应于4℃保存&amp;deg; C. 其保质期为自生产日期起18个月。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织培养皿 - 滑动实验&lt;/strong&gt;</td><td>康宁</td><td>353025</td><td>每个组织培养皿可容纳约九个盖玻片。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织培养皿 - 倒置实验&lt;/strong&gt;</td><td>康宁</td><td>353003</td><td>每个组织培养皿可容纳约四个盖玻片。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;平滑侧 200 &amp;micro;L 吸头&lt;/strong&gt;</td><td>托马斯科学公司</td><td>1158U38</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;离心&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75006590</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td>尼康</td><td>型号：Eclipse Ti，配备 H-TIRF 系统和 100 倍 TIRF 物镜（数值孔径 1.49）</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜相机&lt;/strong&gt;</td><td>Andor</td><td>型号：iXon DU888 EMCCD 相机（1024 × 1024 传感器格式）</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜环境控制箱&lt;/strong&gt;</td><td>Tokai HIT</td><td>定制温控盒</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜激光装置&lt;/strong&gt;</td><td>尼康</td><td>LU-n4 四激光单元，配备用于 405 nm、488 nm、561 nm 和 640 nm 的固态激光器</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;中型台式离心机&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>型号：CR3i</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Misonix 超声波破碎仪&lt;/strong&gt;</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Optima Max-Xp 台式超速离心机&lt;/strong&gt;</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;等离子清洗机&lt;/strong&gt;</td><td>Diener electronic GmbH + Co. KG</td><td>系统类型：Zepto</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;超声波破碎仪探头（3.2 mm）&lt;/strong&gt;</td><td>Qsonica</td><td>4418</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;标准培养箱&lt;/strong&gt;</td><td>结合蛋白</td><td>模型：56</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Waverly 试管混合器&lt;/strong&gt;</td><td>Waverly</td><td>TR6E</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ImageJ FIJI&lt;/strong&gt;</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;FAST（版本 1.01）&lt;/strong&gt;</td><td>http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements</td><td>FAST 可用于基于 Mac OSX 和 Linux 的系统。</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;图像稳定插件&lt;/strong&gt;</td><td>https://imagej.net/Image_Stabilizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ImageJ TrackMate&lt;/strong&gt;</td><td>https://imagej.net/TrackMate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成像软件&lt;/strong&gt;</td><td>NIS Elements（AR 软件包）</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>文件：TrackMate-手册.pdf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>https://github.com/turalaksel/FASTrack</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于体外荧光显微镜的运动分析技术针对肌球蛋白的特异性优化

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

肌球蛋白能够结合并相互作用于丝状肌动蛋白（F-actin），在系统发育树中的多种生物体内均存在。其结构和酶学特性经过适应性演化，以执行细胞内的特定功能。肌球蛋白5a可在F-actin上进行持续性行走，从而在细胞内运输黑色素体和囊泡。相反，非肌肉肌球蛋白2b以包含约30个分子的双极性细丝形式发挥作用。它将具有相反极性的F-actin向细丝中心移动，在该位置，肌球蛋白分子以非同步方式结合肌动蛋白，产生动力冲程，随后解离并重复循环过程。非肌肉肌球蛋白2b及其其他非肌肉肌球蛋白2亚型在细胞黏附、胞质分裂以及张力维持等过程中发挥重要作用。&#160;肌球蛋白的机械化学特性可通过使用纯化蛋白进行体外运动分析来研究。在滑动肌动蛋白细丝实验中，肌球蛋白被固定在显微镜盖玻片表面，从而驱动荧光标记的F-actin发生移位，其运动轨迹可被追踪。而在单分子/集合运动实验中，F-actin被固定在盖玻片上，观察荧光标记的肌球蛋白分子在F-actin上的运动行为。本文概述了利用亲和层析技术从Sf9 细胞中纯化重组肌球蛋白5a的方法。随后，我们介绍了两种基于荧光显微镜的检测方法：滑动肌动蛋白细丝实验和倒置运动实验。通过这些实验，可利用图像分析软件提取诸如肌动蛋白移位速度、单分子运行长度及运动速度等参数。这些技术也可用于研究非肌肉肌球蛋白2亚型单根细丝的运动特性，本文以非肌肉肌球蛋白2b为例进行讨论。该工作流程提供了一套可用于研究非肌肉肌球蛋白单分子及集合动力学的实验方案和定量分析工具。

可通过还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来评估肌球蛋白的纯化效果，如图2所示。尽管该图展示的是透析后的最终纯化肌球蛋白，但也可对纯化过程中各个阶段的等分试样进行SDS-PAGE分析，以确定是否有产物残留在上清液中。肌球蛋白5a的重链片段（HMM）在120–130 kDa范围内出现条带，而全长非肌肉肌球蛋白2b则在200–230 kDa范围内出现对应于重链的条带29,44。肌球蛋白5a还在约17 kDa处有一条带，代表钙调蛋白（calmodulin）。非肌肉肌球蛋白2b在约17 kDa处有一条带，代表轻链（ELC）。由于该NM2b样品中含有GFP标记的调节轻链（RLC），因此RLC条带出现在约47 kDa处；然而，若未标记GFP，则未标记的RLC条带将出现在约20 kDa处。
在视频1和图3...

本文介绍了一种表达和纯化肌球蛋白5a的实验流程，并讨论了如何利用群体和单分子水平的体外荧光显微镜检测方法对其进行表征，以及如何修改这些方法以适用于非肌肉肌球蛋白2b的表征。

肌球蛋白能够结合并相互作用于丝状肌动蛋白（F-actin），广泛存在于系统发育树中的各类生物体中。其结构与酶学特性根据在细胞中执行的特定功能而有所适应。肌球蛋白5a可沿F-actin进行持续性行走，负责细胞内黑素体和囊泡的运输。相反，非肌肉肌球蛋白2b以包含约30个分子的双极性细丝形式发挥作用，它将具有相反极性的F-actin向细丝中心移动，其中肌球蛋白分子异步地与肌动蛋白结合，产生动力冲程，随后解离并重复该循环。非肌肉肌球蛋白2b及其其他非肌肉肌球蛋白2亚型在细胞黏附、胞质分裂以及张力维持等过程中发挥重要作用。通过使用纯化蛋白进行体外运动性实验，可研究肌球蛋白的机械化学特性。在肌动蛋白滑动实验中，肌球蛋白被固定于显微镜盖玻片表面，从而驱动荧光标记的F-actin发生位移，其运动可被追踪。而在单分子/集合运动性实验中，F-actin被固定于盖玻片上，观察荧光标记的肌球蛋白分子在F-actin上的运动。本报告概述了利用亲和层析法从Sf9细胞中纯化重组肌球蛋白5a的步骤。随后，我们介绍了两种基于荧光显微镜的实验方法：肌动蛋白滑动实验与倒置运动性实验。通过图像分析软件，可从这些实验中提取诸如肌动蛋白转运速度、单分子运行长度及运动速度等参数。这些技术也可用于研究非肌肉肌球蛋白2亚型单根细丝的运动，本文以非肌肉肌球蛋白2b为例进行讨论。该工作流程提供了一套研究非肌肉肌球蛋白单分子及集合动力学的实验方案与定量分析工具。

该方案可用于在蛋白质水平上表征非肌性肌球蛋白的动力学特性，从而揭示其在细胞功能中发挥运动作用的相关性质。这是一种快速、可重复且高度可控的方法，可用于研究各种调控条件对肌球蛋白运动行为的影响，进而阐明其细胞内的功能表现。这些技术还可用于探究非肌性肌球蛋白中致病性突变如何在单分子和群体水平上影响其生物学行为。该方法的一般性策略可应用于其他多种细胞骨架系统，例如利用微管对纯化的驱动蛋白和动力蛋白进行表征。本实验方案具有良好的灵活性，尽管这可能引发关于何种荧光染料和化学条件最为合适的问题，但该方法可在相对较短时间内完成优化。掌握流动池的组装与包被方法，将为在不同实验条件下进行适应性调整奠定坚实基础。首先，用乙酸戊酯配制浓度为百分之一的硝酸纤维素溶液，并将直径为125毫米的圆形滤纸放置于组织培养皿底部。将八块方形盖玻片装入支架中，先用约2至5毫升的200-proof乙醇彻底清洗，再用2至5毫升的蒸馏水冲洗。然后使用过滤的空气管线或氮气管线将盖玻片完全吹干。用移液器缓慢地将10微升1%硝酸纤维素溶液沿一个盖玻片的一边加入，然后用200微升移液器吸头的侧面以一个平滑的动作将其涂抹至盖玻片其余部分。随后将此盖玻片放置于组织培养皿上，硝酸纤维素面朝上。对其余的盖玻片重复此操作，并使其干燥。用光学镜头纸擦拭显微镜载玻片，以清除较大的碎屑。剪下两段双面胶，每段长约两厘米，将其中一段沿载玻片长边的中部粘贴。将第二条胶带放置在第一条胶带下方约两毫米处，使两者平行，形成一个可容纳约 10 微升溶液的流动腔室。小心地将一片硝酸纤维素盖玻片粘贴到胶带上，确保涂有硝酸纤维素的一侧与胶带直接接触。使用移液器吸头轻轻按压盖玻片与胶带的接触界面，以确保盖玻片牢固地粘附在载玻片上。然后用剃刀片将载玻片边缘悬垂的多余胶带裁切掉。准备好 Myosin 5a 所需溶液，并置于冰上。将 10 微升 Myosin 5a 溶液注入载玻片流动池中，孵育一分钟。然后加入10微升含有DTT的运动缓冲液中含有一毫克每毫升的BSA溶液。重复此步骤两次，并在第三次洗涤后等待一分钟。将纸巾或滤纸的一角轻轻置于流动池出口处，通过毛细作用将溶液从通道中吸出。然后用含DTT的10微升运动缓冲液洗涤。使用1毫升注射器和27号针头吸取黑色肌动蛋白溶液，在将该溶液引入样品室之前剪切肌动蛋白丝。在含有1毫摩尔ATP的50毫摩尔MB缓冲液（含1毫摩尔DTT）中，将黑色肌动蛋白加入样品室。接下来，加入 50 微升含有 DTT 和 1 毫摩尔 ATP 的运动缓冲液，以清除样品池中游离的肌动蛋白丝。用含 DTT 的运动缓冲液清洗 10 微升，重复三次，以耗尽样品池中残留的 ATP。加入 10 微升含有 DTT 运动缓冲液的 20 纳摩尔 RH 肌动蛋白溶液，静置一分钟，使肌动蛋白丝与附着在盖玻片表面的 Myosin 5a 发生强直结合。用 10 微升含 DTT 的 50 毫摩尔运动缓冲液洗涤两次，以去除未结合的 RH 肌动蛋白丝。加入 30 微升终末缓冲液。使用 561 纳米激发波长在荧光显微镜下记录图像，以观察 RH 肌动蛋白。准备用于肌球蛋白5a逆向运动实验的溶液，并将其置于冰上。用10微升含DTT的动力缓冲液冲洗样品池。注入10微升含DTT的动力缓冲液中浓度为1毫克/毫升的牛血清白蛋白（BSA）溶液。重复此步骤两次，在第三次洗涤后等待一分钟。将纸巾或滤纸的一角轻轻置于流动室出口处，通过毛细作用将溶液从通道中吸出。然后用含DTT的10微升运动缓冲液洗涤流动室三次。用带DTT的运动缓冲液将10微升NeutrAvidin溶液注入流动池，静置一分钟。随后用该溶液冲洗三次，每次10微升。使用宽口移液器吸头，将含DTT运动缓冲液的10微升BRH肌动蛋白溶液注入流动池。然后等待一分钟。接着用含DTT的10微升运动缓冲液清洗三次。加入30微升终末缓冲液，其中含有10纳摩尔的Myosin 5a。立即在全内反射荧光显微镜上进行观察。找到TIRF成像的最佳焦平面后开始记录。通过SDS-PAGE分析非肌性肌球蛋白2b、必需轻链和调节轻链，以及肌球蛋白5a和钙调蛋白的纯化结果。滑动肌动蛋白丝实验展示了理想且可追踪的影片特征，其中标记的肌动蛋白丝表现出平滑的运动。使用黑色肌动蛋白洗涤步骤确保去除了失活的肌球蛋白头部，从而进一步促进了肌动蛋白丝整体的平滑运动。通过快速追踪程序获得了非肌型肌球蛋白2b和肌球蛋白5a的丝状物追踪输出图像。一个代表性直方图显示，肌动球蛋白2b的滑动速度为每秒77纳米，而肌动球蛋白5a的滑动速度为每秒515纳米。在缺乏甲基纤维素的情况下，肌动蛋白丝无法紧密地与包被肌球蛋白的表面结合，导致其在包被非肌球蛋白2b的盖玻片表面附近发生翻转摆动。使用倒置运动性测定法，通过表面固定的荧光肌动蛋白丝观察到了肌球蛋白的运动。在将未标记的肌动蛋白引入流动池进行黑化肌动蛋白洗涤前，对其进行剪切处理至关重要，这有助于肌动蛋白的顺畅转运。进一步的实验可探究肌球蛋白突变、诱导负载的蛋白质、离子强度以及调节蛋白对肌球蛋白运动性的影响。可重建多种细胞条件以供未来研究。这些方法可用于在单分子和集合水平上，对不同肌球蛋白同工型的运动特性及机械特性进行生物化学和生物物理学研究。

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学习使用体外荧光显微镜技术表征非肌肉肌球蛋白动力学特性，研究肌球蛋白5a的运动机制。该方法快速、可重复且高度可控，适用于单分子和群体水平分析疾病相关突变对肌球蛋白行为的影响。

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