Name: 快速网格准备时间解决低温电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 了解快速冷冻电镜网格制备技术，利用定制设备在毫秒级时间内完成样品冷冻，捕捉蛋白质反应的瞬态中间态。该方法仅需50微升样品即可制备四个网格，适用于时间分辨结构生物学研究。

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我们感谢 Molly S.C. Gravett 提供的有益讨论，以及 ABSL 设施工作人员在冷冻电镜数据收集方面的帮助。David P. Klebl&#160;是利兹大学资助的惠康信托四年制博士项目（Astbury 中心）的博士生。FEI Titan Krios 显微镜由利兹大学（UoL ABSL 奖项）和惠康信托（108466/Z/15/Z）资助购置。本研究由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）向 Stephen P. Muench&#160;提供的基金（BB/P026397/1）资助，并得到美国心脏协会向 Howard D. White 提供的研究基金（AMR21-236078）以及美国国立卫生研究院向 Howard D. White 和 Vitold Galkin 提供的研究基金（171261）的支持。

1. 系统准备
注意：以下方案描述了如何制备单个样品的载网。通常，每种样品或条件至少制备2个重复载网。对于更快的冷冻速度（时间延迟小于约20毫秒），通常需制备3至4个重复载网，以弥补薄冰区域数量的减少。
<ol>
	<li>将蛋白样品用所需缓冲液稀释至目标浓度。通常，用于制备电子显微镜载网时，样品终浓度 ≥ 2 mg/mL 效果较佳。注意：从第10步之前，样品可置于冰上保存；自第10步起，样品将在室温下放置较长时间，因制备3–4个载网约需20分钟。</li>
	<li>打开 TED，然后开启控制电脑并启动控制软件。</li>
	<li>通过按下启动所有注射泵 初始化 每个注射泵上的按钮（下方黑色按钮）</li>
	<li>打开电位计电源，将其设置为 9 V，并启动示波器控制软件。</li>
	<li>确保氮气罐的调节阀处于关闭状态2-关闭气瓶。打开气瓶阀门，然后缓慢开启调压阀，将出口压力调节至喷雾气体所需的压力值（通常为1-2 bar）。对于本实验所用的PDMS喷嘴，压力不得超过约2.5 bar，以避免喷嘴损坏。持续流动的气体可防止液体从喷嘴尖端滴落和积聚，从而避免造成喷雾不可重复。</li>
	<li>确保所有注射泵阀门均处于“加载”位置。可通过在控制软件中将所有阀门先切换至“分配”位置，再切换回“加载”位置来完成。所有阀门保持在“加载”状态。将所有注射器归零。</li>
	<li>此时应去除系统中存在的任何气泡。为此，可将注射器卸下，手动去除气泡，并在确认无残留气泡后重新安装注射器。</li>
	<li>液体处理组件通常储存在 H2O. 上样前，使用过量缓冲液冲洗管路，以缓冲液平衡液体系统。采用适当的最高液体流速，避免喷嘴压力过高。液体流速 &#62; 10 µL/s 可能会对本文所述的 PDMS 喷嘴造成损伤。</li>
	<li>将含有 ≥ 200 µL 缓冲液的 1.5 mL 离心管置于 1 号注射器上（管盖必须刺穿以便连接管路）。
	<ol>
		<li>确保阀门1处于“加载”位置。如有必要，在控制软件中进行切换。</li>
		<li>通过控制软件，使用1号注射器吸取所需体积的缓冲液（通常为50–100 µL）。</li>
		<li>通过控制软件将阀1切换至“分配”位置。</li>
		<li>通过控制软件将注射器1中的所有液体排出。</li>
		<li>将回流阀调至“load”位置，在程序中将注射器位置重置为“0”，并按下注射器1的初始化按钮，以准备系统进入下一个循环。 
		注意：步骤 1.9.1 - 1.9.5 通常需重复三次，以确保对管路进行充分清洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>松开冷冻电镜载网夹持臂的夹具，将镊子放入夹具后拧紧固定。</li>
	<li>手动移动冲压臂，使载网与喷嘴处于相同高度（即“样品施加”位置）。若喷嘴与载网对齐，喷雾持续一段时间后液体将在载网上积聚&#160;时期。如有必要，调整喷嘴位置。</li>
	<li>通过手动移动装有镊子的浸入臂至其末端位置（伸入乙烷杯中），调节液态乙烷杯的位置。正确设置时，由镊子夹持的载网将到达液态乙烷杯的大致中心位置。</li>
	<li>检查“运行脚本”是否使用了所需的流速、体积和时间参数。详见上文“运行程序”部分。</li>
	<li>确保推杆运动路径上无任何阻碍。使用控制软件将单次运行所需的缓冲液体积吸入注射器1中，典型设置和体积参见“运行程序”部分。然后确保阀1已切换至“分配”位置。通过按压执行测试运行 运行脚本 在控制软件中。 
	警告：在运行程序结束前，请勿靠近TED。移动部件可能导致伤害！</li>
	<li>当“运行序列”结束后，将驱动臂的压力设置为所需数值（通常为1-2 bar），然后按下 好的 在控制软件中释放压入臂的压力。如果需要调整“运行序列”或压入臂上的压力，可在该阶段修改相关设置，并重复步骤 1.13 至 1.15。</li>
</ol>
2. 快速载网制备
<ol>
	<li>先将液态乙烷/氮气容器中注入液氮。待容器充分冷却且液氮挥发完全后，再向其中注入液态乙烷。注意避免液态乙烷固化。此步骤与常规载网制备方法相同。 
	注意：为尽量减少乙烷污染，应确保步骤 2.2 - 2.13 尽可能快速完成 
	警告：液态乙烷为低温易燃物质，操作时需格外小心。</li>
	<li>制备用于辉光放电的冷冻电镜载网。我们通常使用带孔碳膜载网，在0.1 mbar空气压力和10 mA条件下辉光放电90秒。每次辉光放电通常不超过4个载网。载网在辉光放电后30分钟内使用。</li>
	<li>用样品平衡管路（按照步骤1.9.1–1.9.5操作，以样品替代缓冲液）。若样品体积有限，可用1个死体积的样品进行管路平衡。</li>
	<li>吸取单次运行所需的样品量至控制软件中的1号注射器内（详见“运行程序”部分）。然后将1号阀门切换至“分配”位置。</li>
	<li>检查相对湿度是否已达到所需值（我们通常在60%或更高的相对湿度下制备载网）。一旦湿度达到≥60%，仅在必要时短暂打开湿度室，以维持高湿度环境。</li>
	<li>将镊子（夹持着辉光放电处理过的载网）放入气动冲头中并固定。将冲头移至起始位置（顶部）。</li>
	<li>确保电位器的滑块处于起始位置，以便进行测量，可通过手动移动使其接触柱塞。在示波器软件中设置示波器的触发。</li>
	<li>放置液态乙烷/氮气容器。</li>
	<li>按压 运行脚本 在控制软件中，当出现提示时，单击 好的 在控制软件中启动运行。 
	警告：在运行程序结束前，请勿靠近TED。移动部件可能导致伤害！</li>
	<li>运行序列完成后，通过点击释放气动柱塞的压力 好的 在控制软件中。</li>
	<li>打开湿度室，一手固定镊子，另一手松开镊子与 plunge arm 之间的连接。当镊子脱离后，将 plunge arm 向上移动，同时保持载网处于液态乙烷中。随后将载网转移至周围液氮中的储存位置2冷冻后，载网需保持在液氮中2 始终控制温度。</li>
	<li>保存示波器测量结果。随后手动复位电位器滑块和活塞的位置。</li>
	<li>重复步骤 2.4–2.12 以制备重复网格</li>
	<li>将载网转移至长期保存，直至进行载网剪切和数据采集。</li>
	<li>按照步骤 1.9.1 - 1.9.5 用缓冲液冲洗系统，然后用 H 洗涤系统2O，按照步骤 1.9.1 - 1.9.5。</li>
	<li>关闭主氮气调节阀并切断电源。</li>
	<li>将乙烷/氮气容器置于通风橱中，使其升温，并让液态乙烷和N2 蒸发</li>
</ol>
3. 时间分辨冷冻电镜
注意：使用时间分辨电镜（TED）进行时间分辨实验时，尽管基本装置和变量保持不变，但仍需考虑其他额外因素。此处假设两种溶液以1:1（v/v）的体积比混合，生成最终混合物并滴加至载网上。请遵循“1. 使用TED进行快速载网制备”中的实验步骤，但需进行以下修改：
<ol>
	<li>进行混合实验时，所用储备液的浓度应高于简单喷雾实验。以1:1（v/v）比例混合会导致各组分稀释2倍。</li>
	<li>进行快速混合实验时，应使用全部三个注射器，而非仅使用单个注射器。
	<ol>
		<li>将管路连接至注射泵2-3。</li>
		<li>将注射泵2-3的管路连接至喷雾喷嘴。</li>
		<li>分别用缓冲液和样品对三个注射器进行平衡。通常，注射器1中装入样品A，注射器2-3中装入样品B（图3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更改运行序列。使用全部三个注射器进行快速混合实验的运行序列示例如图6所示。详见“运行序列”部分。</li>
	<li>可通过两种方式实现不同的时间延迟：
	<ol>
		<li>改变推杆速度。通过调节推杆速度，可在相对较窄的范围内改变时间延迟。例如，当喷雾/乙烷距离为2 cm时，推杆速度设为1 m/s或2 m/s，可分别获得20 ms或10 ms的时间延迟。操作方法见步骤1.15。</li>
		<li>通过调节喷嘴的（垂直）位置来改变喷雾/乙烷之间的距离。例如，若喷嘴距乙烷表面5 cm，则以1 m/s的推进速度可获得50 ms的时间延迟。若需实现更长的时间延迟，则需对装置进行进一步改造。 
		注意：由于喷嘴聚焦流区域存在层流，预计在此部分喷嘴内不会发生显著混合。相反，混合应发生在喷雾生成过程中、液滴向网格运动的过程中以及液滴在网格上铺展的过程中。喷雾液滴到达网格的飞行时间估计≤1 ms（液滴速度≥10 m/s，喷嘴至网格距离为1 cm）。因此，仅将液滴着陆至玻璃化之间的时间视为“时间延迟”。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

本研究中的方案可用于通过直接喷雾法快速制备载网以及进行冷冻电子显微镜断层扫描（TrEM）实验。快速载网制备可减少颗粒与气液界面的相互作用5。主要限制因素是样品的可用浓度以及载网上的冰层厚度。在这些限制范围内，只要样品质量良好，该方案即可制备出适用于高分辨率冷冻电镜的载网。
故障排除 
液体流速和网格移动速度决定了沉积在网格上的液体量。根据上述示例设置（液体流速为 5 µL/s，浸入速度为 1–2 m/s），预期可在网格上获得良好的液滴覆盖。如果喷嘴未正确对准（导致喷雾液滴偏离网格），冷冻后的网格上将显示极少或没有液滴。
载网污染无法完全避免（见图7C），但可通过尽量减少液态乙烷暴露于潮湿环境的时间来降低污染程度。为此，应尽快制备重复样品载网（4个载网在≤20分钟内完成）。通常我们在更换液态乙烷前会先制备4个载网。
载网上的...

背景 
近年来，冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的发展使得对日益复杂的生物系统进行高分辨率结构研究成为可能。除少数例外，此类研究主要局限于处于平衡状态的生物大分子1或反应速率相对较慢的过程2。许多体内（in vivo）过程发生在更短的时间尺度上（毫秒级），因此在该时间尺度上开展时间分辨冷冻电镜（TrEM）研究正受到越来越多的关注3。然而，采用传统 blotting 方法进行 cryo-EM 样品制备的速度太慢，无法满足毫秒级 TrEM 的需求。
印迹法除了时间分辨率较差外，还存在其他局限性。蛋白质及蛋白质复合物在载网上可能发生变性或出现优势取向4。研究表明，在样品制备过程中缩短样品暴露于气液界面的时间，可减轻优势取向和蛋白质变性现象5,6。因此，快速制备载网不仅能够实现毫秒级的时间分辨电子显微镜（TrEM），还能提高载网的质量。
目前，自动网格制备主要有三种不同方法。第一种方法采用针状或毛细管装置来承载少量样品。当液体与网格表面接触后，样品被“书写”到网格上7,8样品施加过程相对较慢，需要几秒钟。另一种方法采用压电分配器进行可控液滴生成，并结合自吸式网格。9。这可以缩短从分注到冷冻的时间，但仍受限于液滴形成和芯吸速度（目前达到54 ms）。迄今为止最快的方法是直接喷雾法，其中样品在喷嘴中被雾化成微小颗粒（约10 - 20 µm）和快速（&gt; 5 m/s）液滴在接触冷冻电镜载网时发生铺展。样品喷雾可通过多种方式产生，例如气流雾化器、表面声波或超声波加湿器。10,11,12,13根据我们的经验，采用直接喷洒法所形成的冰层较厚，但该方法能够实现样品滴加至冻结的时间更短。 &lt; 10 ms
本方案详细描述了如何使用配备微流体喷嘴的时间分辨电镜装置（TED）在极短时间内制备载网的逐步操作过程14,15。该装置已用于实现样品施加与冷冻之间的最短延迟时间为6 ms，并可实现两种样品的快速混合与冷冻。TED的设计基于此前的版本16，并与其他基于喷雾的时间分辨冷冻电镜装置相似17。
首先介绍 TED 装置的四个主要组成部分。TED 的核心是液体处理单元，负责样品的吸取与分配。通过气动柱塞将载网移过喷雾并进入液态乙烷中。喷雾由微流控喷嘴产生，冷冻过程在液态乙烷容器中完成，相关内容将简要说明。最后，重点介绍用于控制载网环境（特别是湿度）的附加功能。随后是设备操作及进行 TrEM 实验的详细方案。文中还展示了快速制网及简单 TrEM 实验的代表性结果。
实验设置
液体处理单元 
TED 的液体处理系统由三个注射器驱动泵（“泵 1 - 3”）组成，每个泵均配备一个旋转阀（图 1）。电源为泵 1 - 3 提供 24 V 直流电。通过 RS232 接口与泵 1 进行通信，以实现与控制软件（使用 Visual Basic 和 C++ 编写）的连接。指令通过泵 1 的串行输入/输出扩展端口分发至泵 2-3。泵 1-3 配备有玻璃注射器（“注射器 1-3”，此处使用 250 µL 零死体积注射器）。每个阀具有两个位置：“加载”和“分配”。“加载”位置用于将样品吸入注射器中。一段短管（约 3 - 4 cm 长，外径 1/16"，内径 0.01"）的 FEP 管路通过无法兰 ETFE/ETFE 接头连接至阀 1-3 的“加载”位置。该段短管伸入样品储液管（通常为 1.5 mL 或 0.5 mL 塑料管）中。“分配”位置则通向喷雾喷嘴。从“分配”出口到喷雾喷嘴之间的连接采用 PE 管路（长约 20-30 cm，外径 0.043"，内径 0.015"），并配合一段短套管（约 0.5 cm 长）及无法兰 ETFE/ETFE 接头完成连接。
气动柱塞 
该技术使用气动柱塞来加速载网，并将其推动穿过样品喷雾进入液态乙烷容器中。负压镊子固定载网，该镊子被旋入一个自制的夹持器中，并安装在双杆气动缸上（图2A）。
压力由一个大型氮气钢瓶（W型）提供，钢瓶配备多级减压阀（0 - 10 bar，“主压力”）。通过一根增强型柔性PVC管（外径12 mm）将减压阀连接至12通道歧管，加压氮气由此歧管输送至喷嘴和气动柱塞。通过喷嘴的气体流量保持恒定，由氮气钢瓶端直接调节（主压力）。喷嘴连接部分使用PU管（外径4 mm，内径2.5 mm）、一段较短的PE管（长约8 cm，外径0.043英寸，内径0.015英寸）以及相应的接头完成。气动柱塞的压力通过电磁阀进行控制。使用PU管（外径4 mm，内径2.5 mm）将电磁阀与减压阀及气动柱塞连接，以实现较低的冲压压力（≤ 主压力）。电磁阀由计算机控制。装置的示意图见图2B。
请注意，在此设置下，浸入压力始终等于或小于喷雾气体压力（主压力）。然而，可通过在喷嘴上游增加一个二级调节阀来轻松改进该装置，从而在较低的喷雾气体压力下实现更高的浸入速度。高压（&gt;&gt; 2 bar）可能会损坏PDMS喷嘴。
注意：这是一个加压系统，“主压力”应始终保持 &lt; 7 bar
通常使用 0.5 至 2 bar 的压力驱动气动柱塞，压力与速度之间（在喷雾的垂直位置）呈近似线性关系。通过将滑动变阻器（10 kΩ）与示波器串联，并联接一个 2 kΩ 电阻，来测量冲入速度（图 2C）。电源为变阻器提供 9 V 直流电压。虽然在实验前通过设定冲入压力来预设大致的冲入速度，但实验后可通过变阻器精确读取实际速度。
喷雾喷嘴和液态乙烷容器 
基于喷雾的样品递送所用的气动虚拟喷嘴的制备与操作已在其他文献中详细描述15。如上所述，阀门1-3的“分配”出口连接至喷嘴的液体入口（图3A）。加压喷雾气体连接至喷嘴的气体入口。PDMS喷嘴的入口设计允许直接使用外径为0.043英寸的聚乙烯管，无需额外接头。我们的喷嘴设计包含一种“射流中射流”结构，用于混合两种样品，类似于参考文献18中描述的装置。图3B展示了该设计的示意图，图3C为喷嘴的显微图像。该微流控装置的布局需要使用三支注射器来混合两种样品。喷嘴通常位于载网前方1-1.5 cm处（在样品施加过程中）。
我们使用液态乙烷作为冷冻剂，将其置于用于标准印迹法的液态乙烷/氮气容器中。通过实验室升降平台实现液态乙烷杯的垂直定位。
喷雾与载网环境的控制 
推进杆和喷雾喷嘴被置于一个定制的聚甲基丙烯酸甲酯（有机玻璃）箱体内，箱体带有双层门（图4A）。箱体内部的高相对湿度由置于电子断层扫描设备（TED）后部的空气加湿系统实现（图4B）。空气由泵提供，并通入第一个10英寸滤芯罐（通常用于水槽下方的水净化系统）。该滤芯罐内装有较低水位的水（约5–10 cm），并内置一个加湿装置。加湿装置的市电由数字湿度/温度控制器控制，该控制器通过位于有机玻璃箱体内部的湿度/温度传感器监测环境。当相对湿度达到或超过90%时，控制器将自动关闭泵。来自第一个滤芯罐的湿化空气经扩散器泵送，通过浸没在第二个10英寸滤芯罐水中的管道，随后进入有机玻璃箱体内部。
注意：由于样品在喷嘴中会形成气溶胶，因此危险的生物或化学样本不适宜作为样品使用。
运行程序 
控制软件中的运行脚本按钮用于启动运行程序。该命令序列可在脚本文件中预先定义，并通过软件进行修改。以下解释了其中最重要的变量：
喷雾速度：喷雾速度决定了注射泵所使用的液体流速。流速可按如下方式计算：此处使用的注射泵电机具有固定的步长，泵的整个行程范围被分为 48,000 步。另一个重要因素是注射器的容积，我们通常使用 250 µL 的注射器。控制软件中的喷雾速度以“步数/秒”设定。当喷雾速度设为 1000 步/秒时，对应的实际流速为：
<img alt="静力平衡方程、速度转换公式、微升每秒计算步骤。" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">
喷雾体积：喷雾体积决定了需要喷出的总体积，因此也决定了喷雾的持续时间。控制软件中将喷雾体积设置为步数。在喷雾速度为1000步/秒时，2000步的喷雾体积对应喷雾持续时间为2秒，总体积为10.4 µL。
预喷时间：该变量定义了喷雾开始与载网浸入之间的时间间隔。选择延迟时间时，应确保喷雾在载网浸入前有足够时间达到稳定状态。通常，在载网浸入前会给予喷雾1.5至4秒的稳定时间。喷雾持续至载网完全通过为止，通常在载网浸入后0.5至1秒停止液体流动（即停止喷雾）。例如，当喷雾速度为1000步/秒、喷雾体积为2000步时，典型的预喷时间为1.5秒。
一个典型的命令序列如图5A所示，随时间变化的网格位置如图5B所示。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;时间分辨装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸玻璃箱</td><td>美国科学公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字湿度/温度控制器</td><td>THE20 数字湿度/温度控制器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双杆气动缸</td><td>双杆气动缸 TN 10x70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEP 管</td><td>Upchurch Scientific 1/16&amp;rdquo; O.D.，0.01&#039;&#039; I.D. FEP 管</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无法兰接头</td><td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE 无法兰接头</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柔性增强型聚氯乙烯管</td><td>12 mm 外径，柔性增强型聚氯乙烯管</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td>Kloehn 250 &amp;micro;L 零死体积</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿器泵</td><td>Interpret Aqua Air AP3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液态乙烷容器</td><td>来自赛默飞/FEI Vitrobot&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Mark IV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多级调节器</td><td>GASARC 3 级多级调压器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>负压镊子</td><td>Dumont N5 Inox B 负压镊子</td><td></td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Hantek 6022BE 示波器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE管</td><td>Scientific Commodities Inc. 0.043&amp;rdquo; O.D.，0.015&amp;rdquo; I.D. PE 管</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>Mean Well GSM160A24-R7B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>Wanptek KPS305D 电源供应器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PU管</td><td>SMC TU0425 4 mm 外径，2.5 mm 内径 聚氨酯管</td><td></td><td></td></tr><tr><td>调节器</td><td>Norgren R72G-2GK-RMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滑动电位器</td><td>PS100 滑动电位器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电磁阀</td><td>SMC NVJ314M 电磁阀</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器驱动泵</td><td>Kloehn V6 48K 型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂 &amp;仪器与材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>马脾脱铁铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich，A3660</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich，A2383</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻电镜载网</td><td>Quantifoil 300 目 Cu，R 1.2/1.3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-肌动蛋白</td><td>由 H.D. White 提供（制备步骤参见参考文献） &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电晕放电仪</td><td>Cressington 208 碳镀膜仪配备辉光放电装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich，H7006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich，P1190</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich，M8266</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich，M1254</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich，S9888</td><td></td><td></td></tr><tr><td>骨骼肌肌球蛋白S1</td><td>由 H.D. White 提供（制备步骤参见文献2）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>参考文献 1</td><td>Spudich, J. A. &amp;amp; Watt, S. 兔骨骼肌收缩的调控 I. 原肌球蛋白-肌钙蛋白复合物与肌动蛋白及肌球蛋白蛋白水解片段相互作用的生化研究. 生物化学杂志 246, 4866-4871 (1971).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>参考文献 2</td><td>White, H. &amp;amp; Taylor, E. 肌动球蛋白三磷酸腺苷酶的能量学与机制。 &lt;em&gt;生物化学 &lt;/em&gt;&lt;strong&gt;15&lt;/strong&gt;, 5818-5826 (1976).</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

快速制备用于时间分辨冷冻电镜的载网

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

冷冻电子显微镜（cryo-EM）领域正随着新硬件和处理算法的不断进步而迅速发展，能够解析更高分辨率的结构，并研究更具挑战性的生物体系。在 cryo-EM 样品制备方面，同样经历着一场革命，新的方法正在被开发以取代传统的滤纸 blotting 系统，包括压电式分配器、针式打印和直接喷雾技术。得益于这些进展，载网制备的速度已从数秒缩短至毫秒级，为时间分辨 cryo-EM 等研究领域带来了新的机遇——在快速混合蛋白质与底物后立即进行冷冻，从而捕获短暂存在的中间态。本文详细描述了一种在我们自主研发的时间分辨 EM 装置上制备载网的标准操作流程，适用于常规的快速载网制备以及时间分辨实验。该方案制备 4 个载网至少需要约 50 µL 样品，样品浓度需 ≥ 2 mg/mL。样品施加到冷冻之间的延迟时间可短至 10 ms。一个局限是，在更快速度下所形成的冰层比传统 blotting 方法更厚。我们希望本方案能为其他研究者设计自主的载网制备装置，以及开展时间分辨实验提供帮助。

使用 TED 快速制备载网 
作为快速制网样品的测试标本，我们采用了马脾脱铁蛋白 20 µM 在30 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.5的条件下。根据参考文献所述，从690张显微照片获得了3.5 Å分辨率的重构结果。15 (图7A）。选择离焦范围是为了使颗粒在原始图像中易于识别（图7B). 延迟时间为10-40 ms制备的典型载网显示出足够大的薄冰区域（图7C以允许收集 &gt; 1000 张显微照片。最终的分辨率可能受限于冰层厚度，对多个不同载网进行断层扫描分析显示，冰层厚度为 96 ± 33 nm。6.
时间分辨冷冻电镜 
为了展示使用快速混合装置（TED）实现快速混合与时间分辨的能力，我们以ATP混合诱导肌...

本文提供了一种快速载网制备装置的详细使用方案，可用于快速制备载网，以及进行快速混合与冷冻，从而开展时间分辨实验。

冷冻电子显微镜（cryo-EM）领域正随着新硬件和处理算法的不断进步而迅速发展，能够解析出更高分辨率的结构……

您好，欢迎观看本期 JoVE 视频。我们将向您介绍我们在利兹开发的快速网格制备装置，这是一种用于时间分辨研究的实验系统。请注意，这并非标准配置，但我们希望通过详细阐述我们所使用的各项设备和参数，帮助您在各自的实验室中构建类似的系统。该设备的详细描述见于Richmond方案。本文将提供快速网格制备和时间分辨电镜观察的逐步操作指南。根据我们的经验，蛋白质浓度应为每毫升2毫克或更高。该方案所需最小体积约为50微升。打开设备。然后开启控制计算机并启动控制软件。通过按下每个注射泵上的初始化按钮，对所有注射泵进行初始化。打开电位计电源，将其调至9伏，并启动示波器控制软件。需要加压氮气以产生喷雾。打开氮气瓶，将压力设为2 bar。确保所有注射泵的阀门均处于加载位置。为此，请在控制软件中先将所有阀门切换至排液状态，然后再切换回加载状态。将所有注射器归零。此时应除去系统中存在的任何气泡。为此，可能需要将注射器卸下，手动去除气泡，并在确认无残留气泡后重新安装注射器。液体处理系统通常保存在水中。在上样前，需用缓冲液对系统进行平衡。通过用过量缓冲液冲洗管路来实现。将含有至少 200 微升缓冲液的管子插入第一支注射器。必须刺穿管子的顶部以进行连接。使用控制软件，用1号注射器吸取适量缓冲液，体积介于50至100微升之间。切换1号阀门以进行分配。将第一个注射器中的所有液体排出。将第一个阀门转回加载位置，然后按下第一个注射器上的初始化按钮，以使系统准备好进行下一个清洗循环。这些步骤通常重复三次，以确保管路得到彻底清洗。接下来，定位喷雾喷嘴。将一块EM载网放入冷冻夹持臂中。将载网置于喷雾喷嘴前方。使用控制软件分配缓冲液。如果喷嘴与网格对齐，喷射较长时间后液体应在网格上积聚。如有必要，调整喷嘴位置，然后再次检查液体在网格上的积聚位置。接下来，调整乙烷杯的位置。镊子的尖端应大致到达乙烷杯的中心位置。进行一次试运行，以确保所有设置正确无误。关闭湿度室。确保推杆的运动路径畅通无阻。将单次运行所需的缓冲液体积吸入第一支注射器中。将阀门一切换至分配状态。在控制软件中按下“运行”以开始实验。检查第一台注射泵是否开始移动（本例中为2秒），并在适当的延迟后（此处为1.5秒）将载网浸入。 当运行结束后，将推杆臂的压力调节至所需数值。在控制软件中按“OK”以释放推杆臂的压力。此时乙烷杯已冷却并充满液态乙烷。使用前对载网进行辉光放电处理。典型的辉光放电条件为在0.1毫巴空气下以10毫安电流处理90秒。随后用样品对管道进行平衡。如果可用的样品体积较少，可仅用一个死体积的溶液对管路进行平衡。吸取样品。通常死体积约为 30 µL。将阀门一切换至分配模式。通过管路和喷嘴分配样品。然后吸取单次运行所需的样品量。将阀门一切换至分配状态。检查相对湿度是否已达到所需值。我们通常在60%或更高的湿度条件下制备载网。这可能需要几分钟。将夹持着辉光放电处理过的载网的镊子放入冷冻投入装置的机械臂中。将电位器滑块置于起始位置，准备进行速度测量。在示波器软件中设置速度测量的触发条件。放置液态乙烷杯，并将其靠近湿度室。确保推杆的运动路径畅通无阻。在控制软件中启动运行。运行结束后，在控制软件中按“OK”以释放压入臂的压力。打开湿度室，松开压入臂与镊子之间的连接。在保持载网处于液态乙烷中的同时，上移骤冷臂。随后将载网转移至液氮中进行储存。保存示波器的测量结果。手动重置电位器滑块和柱塞的位置。重复该方案以制备重复样品载网。时间分辨实验以类似方式进行。由于混合步骤中的稀释作用，时间分辨实验需要更高的储备液浓度。进行时间分辨实验时，需使用全部三个注射器。将管路连接至注射泵和喷雾喷嘴。此处使用的微流控喷嘴还包含一个混合元件。请注意，较长的管路会导致更大的死体积，且清洗平衡步骤需要更多的缓冲液和样品。将所有注射器分别用缓冲液和样品进行平衡。通常，注射器一用于样品A，注射器二和三用于样品B。在管路平衡后，将样品A装入注射器一，将样品B装入注射器二和三。然后，切换阀门一至三以进行 dispensing（分配）。在控制软件中启动运行。请注意，时间分辨实验需要使用不同的运行脚本。可通过两种方式实现不同的时间延迟。通过调节推进器速度，可以改变从混合到冷冻的时间延迟。更快的 plunge 速度将导致更短的时间延迟。或者，可通过调节喷嘴的垂直位置来改变喷射乙烷的距离。增加距离将导致更长的时间延迟。在低倍电子显微镜下，典型的载网图像如下所示。如图所示，薄冰区域适合进行数据采集。在更高倍数下，颗粒应清晰可见。对于载铁蛋白脱辅基蛋白等测试样品，仅需从单个载网获取的相对较小的数据集，即可实现三到四埃分辨率的重构。对于时间分辨实验，我们从不同的时间点或载网收集数据集。将数据合并用于三维分类，然后将颗粒追溯至其对应的时间点，这种方法非常有用。通过这种方法，数据可提供结构信息以及反应动力学信息。总之，希望您喜欢本视频。我们希望，结合 JoVE 论文中的详细描述和视频内容，您将能够通过快速网格制备技术开展自己的实验，该方法已被证明可缓解由突变引起的一些问题，或有助于在气-水界面处的相互作用，为您开展自主的时间分辨研究提供所需条件，以尝试捕获那些非平衡态。 那么，祝您愉快地制作表格。

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