快速网格准备时间解决低温电子显微镜
November 6th, 2021
在这里，我们提供了一个详细的协议，用于快速网格制作和快速混合和冻结的快速网格制作设备，以进行时间解决的实验。
您好，欢迎收听此 JoVE"视频。我们想向您介绍我们在这里为快速网格制作而建立的设置，这是一项在利兹开发的经过时间解决的研究。请注意，这不是一个标准系统，但我们希望通过向您详细介绍我们所做的所有事情和参数，您将能够在您自己的实验室中开发类似的系统。
里士满协议中提供了设备的详细描述。在这里，我们将为快速网格准备和时间解决的 EM 提供分步指南。根据我们的经验，蛋白质浓度应为每毫升或更高两毫克。该协议要求最小体积约50微升。
打开设备。然后打开控制 PC 并启动控制软件。通过按每个注射器泵上的初始化按钮，初始化所有注射器泵。
打开强力计电源，将其设置为 9 伏特，并启动示波器控制软件。产生喷雾需要加压氮气。打开氮气瓶，将压力设置为 2 条。
确保所有注射器泵阀处于负载位置。为此，将所有阀门切换到控制软件中分配，然后返回加载。将所有注射器设置为零。
在此阶段，系统中的任何气泡都应被清除。要做到这一点，注射器可能需要拧开，手动去除气泡，当不再包含气泡时，注射器会再次安装。液体处理系统通常储存在水中。
在加载样品之前，系统与缓冲器平衡。这是通过用多余的缓冲器清洗管子来完成的。将至少 200 微升缓冲器的管子放在注射器上。
管子的顶部必须穿孔才能连接它。使用控制软件使用注射器，吸气适量的缓冲器，在 50 到 100 微升之间。切换阀一以分配。
将所有液体都用注射器一体分配。将阀门一返回到负载位置，然后按下注射器一上的初始化按钮，为下一个洗涤周期系统做好准备。这些步骤通常重复三次，以确保彻底清洗管子。
接下来，喷嘴被定位。将 EM 网格置于下垂的臂中。将网格放置在喷嘴前。
使用控制软件分配缓冲器。如果喷嘴和网格对齐，液体在喷洒后应长时间积聚。如有必要，调整喷嘴位置，然后再次检查液体在网格上积聚的位置。
接下来，调整乙烷杯的位置。钳子的尖端应大致到达乙烷杯的中心。执行测试运行以确保所有设置正确。
关闭湿度室。确保柱塞的路径清晰。吸气单次运行到注射器中所需的缓冲体积。
切换阀一以分配。通过按控软件中的运行开始运行。检查注射器泵一个正在移动，在这种情况下两秒钟，网格在适当的延迟后暴跌，1.5秒在这里。
跑步结束后，将柱塞手臂上的压力设置为所需的值。按 OK'in 控制软件以释放从下垂的手臂的压力。现在乙烷杯很酷，充满了液体乙烷。
使用前发光放电网格。典型的发光放电在 0.1 毫巴空气中的 10 毫安时为 90 秒。然后，管子与样品平起平准。
如果可用的样品量较低，管子可能与只有一个死体积等价。吸气样品。通常死体积约为30微升。
切换阀一以分配。通过管子和喷嘴分配样品。然后吸气单次运行所需的样本量。
切换阀一以分配。检查相对湿度是否达到预期值。我们通常以 60% 或更高的速度准备网格。
这可能需要几分钟的时间。将拿着发光网格的钳子放在下垂的手臂上。将强力计滑动放在起始位置，为速度测量做好准备。
设置示波器软件中速度测量的触发器。放置液体乙烷杯，并靠近湿度室。确保柱塞的路径清晰。
在控制软件中启动运行。运行完成后，按 OK'in 控制软件以释放从下垂的手臂的压力。打开湿度室，松开手臂和钳子之间的连接。
向上移动下垂的手臂，同时保持网格在液体乙烷。然后将网格转移到液氮中并储存起来。保存示波器测量。
手动重置强力计滑块和柱塞的位置。重复协议以准备复制网格。时间解决的实验也以类似的方式进行。
由于混合步骤中的稀释，需要更高的库存浓度进行时间解决实验。对于时间已解决的实验，请使用所有三个注射器。管子连接到注射器泵和喷嘴。
此处使用的微流体喷嘴还包含混合元件。请注意，较长的管子将给出更大的死体积和洗涤平衡步骤需要更多的缓冲和样品。用缓冲器和样品分别对所有注射器进行均衡。
通常，注射器一用于样品A'和注射器2和3用于样品B'后，管子是平衡的，加载样品A到注射器一和样品B到注射器二和三。然后，将阀门切换一到三以分配。在控制软件中启动运行。
请注意，需要不同的运行脚本进行时间解决的实验。不同的时间延迟可以通过两种方式实现。通过调整柱塞速度，可以更改从混合到冻结的时间延迟。
更快的暴跌速度将导致更短的时间延迟。或者，通过调整喷嘴的垂直位置来改变喷雾乙烷距离。增加距离将导致更长的时间延迟。
在低放大度的电子显微镜中，典型的网格看起来像这样。如前所述，薄冰区域适合数据采集。在更高的放大倍率下，颗粒应清晰可见。
使用 apoferritin 等测试标本，单个网格中相对较小的数据集足以以三到四个安格斯特罗姆分辨率进行重建。对于时间已解决的实验，我们从不同的时间点或网格收集数据集。将数据组合到 3D 分类中，然后将粒子追溯到其时间点是很有用的。
这样，数据可以提供有关反应动力学的结构信息和信息。最后，我们希望您喜欢该视频。我们希望，通过 JoVE 论文中的详细描述以及视频，您将能够通过快速网格制作进行自己的实验，这已被证明可以缓解突变造成的一些问题，或帮助在空气-水界面上进行交互，所有你需要进行自己的时间解决研究，尝试并捕获其中一些非平衡状态。
所以，快乐网格制作。
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概述
本文介绍了一种使用快速网格制作装置的详细协议，该装置专为快速网格准备和时间分辨实验而设计。重点是提供逐步指南，以便在各种实验室中进行类似的设置。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 结构生物学
背景
- 快速网格制作对于时间分辨研究至关重要。
- 该协议基于Richmond协议。
- 蛋白质浓度对成功的实验至关重要。
- 该协议需要至少50微升的体积。
研究目的
- 开发用于时间分辨实验的快速网格制作系统。
- 为研究人员提供复制设置的全面指南。
- 提高结构研究中网格准备的效率。
使用的方法
- 使用快速网格制作装置。
- 网格准备的逐步协议。
- 时间分辨电子显微镜（EM）技术。
- 蛋白质浓度和样品体积的优化。
主要结果
- 成功实施快速网格制作装置。
- 在时间分辨研究中展示了网格准备的效率。
- 提供了关于最佳蛋白质浓度的见解。
- 促进了其他实验室开发类似系统。
结论
- 快速网格制作装置适用于时间分辨实验。
- 详细的协议可以帮助研究人员进行类似的工作。
- 未来的研究可以在这种方法的基础上进行增强的结构分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid grid preparation for cryo-EM enables the capture of transient molecular states, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D. By reducing the time from sample mixing to freezing to as little as 10 ms, this approach supports high-resolution structural analysis of short-lived intermediates, informing target validation and lead identification. The protocol's reproducibility and adaptability position it as a scalable capability for enterprise discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of dynamic protein conformations and reaction intermediates.
- Supports mechanistic de-risking by revealing transient structural states relevant to function.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cryo-EM grids suitable for high-throughput structural screening.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for comparative analysis across conditions.
- Enables rapid assessment of compound-induced structural changes in proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant mechanisms for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing high-resolution data on functional states.
- Enables integration of structural insights into preclinical model selection and biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This rapid grid preparation protocol fits from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and screening-based workflows in structural biology.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing by capturing non-equilibrium states for mechanistic clarity.
- Screening: Provides standardized, reproducible grids for downstream cryo-EM analysis and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of structural changes and reaction kinetics across time points.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by linking structural intermediates to functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable protocol for diverse protein systems and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing high-resolution, time-resolved structural data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM instrumentation and sample handling.
- Needs access to microfluidic dispensing, precise timing controls, and cryogenic infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible grid quality and data comparability.
- Adaptable to various protein systems but may require optimization for sample concentration and ice thickness.
- Increased ice thickness at higher speeds may limit data quality for some applications.
