Name: 小鼠膝盖外展肌肉功能的体内测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 了解小鼠膝盖伸肌功能的体内测量方法，该无创方案通过电刺激和双模式杠杆系统测量等长峰值强直扭矩，适用于纵向评估肌肉骨骼损伤、骨关节炎及肌肉适应性的临床前研究。

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我们感谢Rosario Maroto提供的技术支持。本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所，项目编号为R01 AR072061（CSF）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有实验程序均经肯塔基大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 仪器设置
<ol>
	<li>确认设备已按照制造商的规格连接。</li>
	<li>如尚未安装，将300D-305C-FP电机与膝关节伸展装置连接至809C动物平台。</li>
	<li>开启水泵并设置温度为37 °C，以开始加热平台。</li>
	<li>若计算机尚未开启，请先开启计算机，随后开启高功率双相刺激器和双通道双模式杠杆系统。</li>
	<li>将异氟烷倒入蒸发器，至最大填充刻度线。</li>
</ol>
2. 软件设置
<ol>
	<li>打开软件（详见材料表）。</li>
	<li>为结合使用即时刺激功能与实时数据监测器以优化探针位置（步骤4），请选择准备实验，然后选择配置即时刺激（图1）。将脉冲频率（Hz）设为125，脉冲宽度（ms）设为0.2，脉冲数量设为1，串频率（Hz）设为0.5，运行时间（s）设为120。</li>
	<li>选择文件并打开实时数据监测器。</li>
	<li>为进行抽搐实验（步骤5）和力矩-频率实验（步骤6），请选择一个已预先编程的研究方案，该方案应包含适当的抽搐实验和膝关节伸展力矩-频率实验（具体见下文步骤5和步骤6）。
	<ol>
		<li>选择相应的实验小鼠，或选择添加新动物，并输入与力矩数据一同存储的小鼠信息。</li>
		<li>选择下一个实验或上一个实验，以在抽搐协议与力矩-频率序列之间切换。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠准备
<ol>
	<li>将单只小鼠放入麻醉室中。</li>
	<li>打开氧气瓶阀门，调节氧气流速至 1 L/min，并使用 2.5% 异氟烷。</li>
	<li>确保小鼠在麻醉室内，盖紧盖子，直至其完全失去意识。通过捏足趾无足部反射来确认意识完全丧失。</li>
	<li>将已麻醉的小鼠仰卧置于加热平台上，头部置于鼻罩中，维持氧气流速为 1 L/min，异氟烷浓度为 2.5%。</li>
	<li>使用电动剪刀剃除右侧后肢的毛发。用酒精棉片和小型吸尘器清除剃毛区域的毛发，并将清除的毛发从后肢及平台处彻底清理干净。&#160;</li>
	<li>将后肢上部牢固地夹住，位置位于膝关节后方（图 2）。 
	注意：确保夹持不影响膝关节的活动范围。</li>
	<li>将后肢下部放入膝关节伸展装置中，使胫骨前侧轻轻接触可调节的塑料部件（此时Force In通道读数应在 0 至 -1.0 mN*m 之间）。根据小鼠后肢下部的大小，可用手术胶带缠绕在可调节塑料部件的底部，以确保腿部稳定放置。 
	注意：定制塑料部件的详细图像和尺寸见补充图 1。</li>
	<li>调节平台上的旋钮，确保膝关节弯曲至 60°。</li>
	<li>在小鼠躯干上方轻轻贴一条胶带固定于平台上，以防止在膝关节最大程度伸展时产生代偿性移动。</li>
</ol>
4. 电极放置
<ol>
	<li>将电极置于膝关节近端2-4 mm处的皮下，位置正对股四头肌/膝伸肌（图2）。电极间距应约为1-2 mm。</li>
	<li>为确定电极的最佳放置位置，使用即时刺激功能并结合实时数据监测器。将电流强度设为50 mA，进行重复性肌肉抽搐，以确认膝关节伸展（膝伸肌会产生负向的抽搐曲线）。在即时刺激过程中调整探针位置，使实时数据监测器窗口中测得的膝关节伸展抽搐力矩达到最大值。 
	注意：图3展示了典型的即时刺激输出结果，证实了膝关节伸展。 补充视频1和补充视频2展示了未安装电机臂时的实时及慢动作膝伸肌抽搐过程，便于直观确认膝关节伸展。</li>
	<li>在使用即时刺激引发重复性抽搐时，用食指触诊膝屈肌以确认拮抗肌未被激活。为最大程度刺激膝伸肌，可能需要根据小鼠的身体组成以及股神经和膝伸肌运动点在解剖位置上的细微差异，调整探针位置。 
	注意：肌肉运动点是指神经的运动分支进入肌腹的位置，该处对电流传导的阻力最小，因而对电刺激的反应性最高14,15。在临床电刺激应用中，通常使用笔式电极进行扫描，找到在最低注入电流下即可引发肌肉抽搐的部位，从而确定运动点14,15。准确识别肌肉运动点对于实现最佳的神经肌肉电刺激至关重要15。在人类临床试验中，股四头肌的运动点通常位于肌肉远端的一半区域14。为在小鼠中实现最佳膝伸肌刺激，本实验采用电极放置结合即时刺激的方法，尽可能接近通常位于膝伸肌远端一半区域的运动点位置。电极放置位置存在一定变异（从相对表浅到较深），只要能产生最大力矩即可，而即时刺激功能有助于实现最优的电极定位。</li>
</ol>
5. 确定最佳电流
<ol>
	<li>确定最佳探针位置后，进行一系列渐进式抽搐实验，以确定扭矩-频率实验所需的最优电流强度，目标是找到能够产生最大抽搐扭矩输出的最低电流。首先将电流设置为 50 mA，然后点击 运行实验 以产生一次单次抽搐。点击 分析结果 以显示扭矩输出。记录 最大力 下显示的、已扣除基线的抽搐扭矩值。 
	注意：选择反转 力通道 的选项，以将负扭矩测量值转换为正扭矩。</li>
	<li>将电流增加至 60–70 mA，并重复单次抽搐实验。记录 最大力 下显示的、已扣除基线的抽搐扭矩值。</li>
	<li>以类似方式继续进行一系列抽搐实验（每次递增约 10–20 mA），直至抽搐扭矩不再增加（达到平台期或开始下降）。抽搐实验系列示例见 表 1。</li>
	<li>记录产生最高抽搐扭矩时所用的最低电流值。该电流将在接下来的力-频率实验中保持恒定。典型的峰值抽搐曲线如 图 4 所示。</li>
</ol>
6. 扭矩-频率实验以确定最大等长强直收缩扭矩
<ol>
	<li>在软件中（参见材料表），选择预设的膝关节伸展扭矩-频率实验程序，并确保以下设置：刺激持续时间：0.35 s，频率序列：10 Hz、40 Hz、120 Hz、150 Hz、180 Hz、200 Hz，脉冲/收缩之间的休息时间：120 s 
	注意：采样率为 10,000 Hz（默认设置）。</li>
	<li>运行实验、分析结果，并手动记录每次频率下“最大力”（Max Force）显示的扭矩值（需减去基线，并确保力信号通道已反转，因为膝伸肌收缩会产生负向扭矩）。将所记录的最大“最大力”值记为峰值等长强直性扭矩。扭矩-频率数据示例见表2，图5展示了在 120 Hz 时达到峰值等长强直性扭矩的代表性强直收缩曲线。</li>
</ol>
7. 实验终止
<ol>
	<li>完成扭矩-频率实验后，进行一次后续的单次收缩，并与相同电流下的初始峰值单收缩进行比较，以评估肌肉损伤或疲劳程度。 
	注意：在某些损伤和疾病模型中，骨骼肌的易疲劳性增加是预期现象，并不表示实验装置或小鼠本身存在问题。</li>
	<li>所有扭矩测量完成后，轻柔地移除电极探针，并松开膝关节夹具。</li>
	<li>关闭异氟烷，将小鼠从鼻罩中取出。</li>
	<li>将小鼠放回放置在加热垫上的合适笼子中。在小鼠恢复意识期间进行监测。 
	&#8203;注意：小鼠通常应在2-3分钟内恢复意识并开始活动。</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>实验结束后从分析软件中提取数据（参见材料表）。
	<ol>
		<li>打开分析软件。</li>
		<li>在软件中选择获取数据。</li>
		<li>选择实验进行的日期及相应的小鼠编号。</li>
		<li>选择感兴趣的频率（所有抽搐实验以及张力-频率实验中的每个频率均会列出）。</li>
		<li>选择肌肉分析。</li>
		<li>确认已勾选使用基线校正。 
		注：基线张力由软件计算为前100个采样点的平均值，并从绝对最大张力值中减去。</li>
		<li>记录最大值下方列出的张力数值。 
		注：此处展示的数据未经滤波；但可根据需要在软件中选择滤波器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，如步骤6.2所述，可在分析结果窗口中，实时手动记录每个张力-频率数据点/收缩过程中最大力下方显示的张力输出。
	<ol>
		<li>确认已减去基线，且力信号通道已反转。</li>
		<li>将数据输入电子表格，用于进行体重归一化计算（张力/体重，单位为克）、绘图及感兴趣的统计分析。本研究使用统计软件绘制张力-频率曲线并计算曲线下面积。 
		注：张力数据的单位为 mN·m（毫牛顿·米）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为生成强直收缩曲线，需从分析软件中导出每个频率的完整数据。
	<ol>
		<li>重复上述步骤8.1.1–8.1.4。</li>
		<li>选择导出数据。</li>
		<li>选择原始滤波后数据，并保存至指定位置。可使用MATLAB从导出的文本文件生成强直收缩曲线，或进行进一步分析。 
		&#8203;注：如有需要，可提供用于从文本文件生成强直收缩曲线的MATLAB代码。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 双模式杠杆系统校准
<ol>
	<li>在首次使用前校准系统，以确保数据的准确性和可靠性，并使用数据采集软件和已知重量定期重复校准。
	<ol>
		<li>开放数据采集软件。</li>
		<li>点击 设置选项卡 并选择 通道设置.</li>
		<li>选择 305C-FP 列于下方 我的仪器.</li>
		<li>点击 校准选定项 打开 校准编辑器 窗口。</li>
		<li>为校准长度，输入一系列包含正负电压的测试电压（例如 -3、-2、-1、0、1、2、3 V）。
		<ol>
			<li>点击 设置 第一行。</li>
			<li>点击 读取.</li>
			<li>以毫米为单位精确测量杠杆臂的长度，并输入到对应的框中。</li>
			<li>对下一个电压重复上述步骤。</li>
			<li>记录完所有电压后，单击 计算校准因子 （以毫米/伏特为单位记录）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用一组呈线性递增的已知质量砝码来校准力的大小。
		<ol>
			<li>调整电机位置，使其置于实验台或桌面边缘，杠杆臂与台面平行并悬于台外，以便悬挂重物。</li>
			<li>用橡皮筋将第一个砝码悬挂在杠杆臂上。在下方 施加的力，输入已知重量（单位为克），并计入橡皮筋的质量。</li>
			<li>选择 读取.</li>
			<li>至少对 3 个已知重量重复上述步骤。</li>
			<li>选择 计算校准因子.</li>
			<li>为验证计算结果，选择校准数据并进行曲线拟合以绘制校准曲线 绘制 Cal.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为校准力输出，输入校准电压（最高10伏特）
		<ol>
			<li>单击校准电压旁边的“设置”按钮。</li>
			<li>对每条电压线重复上述步骤。</li>
			<li>用手指轻轻按压杠杆臂，直至 推出力 不再发生变化，电机臂开始移动。</li>
			<li>保持此位置。选择 阅读.</li>
			<li>对每条电压线重复上述步骤。</li>
			<li>选择 计算校准因子.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Bobowik, P., Wiszomirska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+dependence+of+muscle+strength+measurements+and+the+risk+of+falls+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Rehabilitation+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic dependence of muscle strength measurements and the risk of falls in the elderly.</a> Internation Journal of Rehabilitation Research. 43 (4), 330-336 (2020).</li>
</ol>

Matthew Borkowski 任职于 Aurora Scientific Inc.，这是一家可能从研究结果中获益的公司，同时他也是该公司的高管。

在啮齿类动物模型中对肌肉功能进行测量和分析，对于推断运动、损伤、疾病及治疗干预所引起的组织学和分子水平骨骼肌适应性变化具有重要的转化意义。本文展示了一种利用市售设备在小鼠中可靠且重复地评估膝伸肌最大力量的方法，其中仅有一个定制部件——用于固定后肢胫骨前部的可调节塑料件，该部件可被复制。
常用的机能评估工具已被广泛用于对同一只小鼠的运动功能进行重复评价，例如力竭性跑台运动、转棒实验、倒挂网格实验和抓力测试。然而，尽管这些评估方法能够提供有价值的信息，但它们均涉及心肺功能和行为学成分，这可能会干扰对与这些运动表现指标相关的神经肌肉功能的准确评估。此外，许多此类功能评估在不同程度上包含了耐力、协调性和平衡性等要素，从而限制了对肌肉力量的清晰解读。啮齿类动物肌肉的产力能力可在体外（in vitro）、原位（in situ）或在体（in vivo）条件下进行测量，每种方法各有其优势与局限性。具体而言，在体外评估中，肌肉被完全分离并从动物体内取出，因而不受灌注或神经支配的影响19。这种方法可提供一个高度可控的环境以评估肌肉的收缩能力，但在测试过程中，肌肉的存活依赖于氧气和营养物质的被动扩散，从而限制了可研究肌肉的尺寸。原位测试保留了肌肉的神经支配和血液供应，但与体外测试一样，仅适用于单次终末性评估20。最后，在体测试的侵入性最小，肌肉保持在其天然环境中，通过经皮电极插入运动神经附近以实现对肌肉的电刺激。在体方法的一个显著优势在于能够进行纵向的、跨时间的重复检测21,22,23。
在活体（&#160;in vivo）条件下评估肌肉峰值收缩力，可最佳地测量最大肌力，因为小鼠的正常解剖结构和生理状态得以保持完整，且该方法可在同一小鼠干预前后或整个生命周期内重复使用。具体而言，小鼠膝伸肌力量的活体测量是与人类研究最具转化相关性的啮齿类肌力评估方法，因为最大膝关节伸展力矩在人类中常被测量，并被视为肌力测试的金标准，且与多种功能和健康结局密切相关24,25,26,27。此外，随着年龄增长以及多种损伤和疾病的发生，均可观察到膝伸肌病理变化1,2,4,5,6，但长期以来，尚难以在小鼠中纵向评估这些状况对膝伸肌力量的影响。
尽管该方法可用于纵向测定膝伸肌峰值力矩，但仍需考虑本方案的某些局限性。力矩-频率方案中未包含40 Hz至120 Hz之间的较低频率，这可能限制了在损伤或疾病状态下检测力矩-频率曲线左移或右移的能力。然而，采用此力矩-频率方案，我们已能够检测前交叉韧带（ACL）损伤模型中以及C57BL/6野生型小鼠与超生理肌肉质量转基因小鼠模型之间峰值强直力矩的改变（图8）。我们注意到，使用“辅助手”或类似装置固定电极可能有助于实验，因为肌肉收缩可能导致电极轻微移动。尽管在逐步收缩过程中未观察到电极明显移位，但电极轻微移动的可能性仍不能排除，这可能影响肌肉刺激效果。此外，本实验未在刺激方案中同步进行肌内肌电图（EMG）记录；然而，若实验模型需要且条件允许，加入EMG测量是可行的。
在骨科损伤和疾病的鼠类模型中评估膝伸肌力量，将有助于开展具有重要临床转化意义的临床前研究。本方案利用任何实验室均可获得的商用设备，实现对小鼠最大膝伸肌力量的精确且可重复的评估。

骨骼肌是一种高度可适应的组织，其质量和结构会因多种刺激（如运动、营养、损伤、疾病、衰老和失用）而发生代偿性改变。许多研究人类骨骼肌适应性的研究采用多种方法来同时测量骨骼肌的大小及其对功能的影响，因为作为金标准的肌力评估在人体受试者中易于重复进行。
在临床研究中，膝伸肌和屈肌力量的评估最为常见&#160;。已有大量人体研究报道了衰老、运动、骨科损伤、膝骨关节炎、慢性疾病及失用等情况下膝伸肌力量的变化1,2,3,4,5,6,7。然而，在机制性啮齿类动物研究中，可重复且非侵入性分析膝伸肌（股四头肌）力量的方法相对有限。既往已有研究建立了用于测定大鼠体内股四头肌收缩力的方法8；但该方法需要大量自制非商业化设备。鉴于目前已开发出多种用于研究膝关节损伤/骨关节炎后肌肉骨骼结局的啮齿类动物模型9,10,11,12,13，亟需一种非侵入性评估股四头肌力量的方法。
此外，研究骨骼肌适应分子机制的啮齿类动物实验通常采用小鼠模型，因为小鼠的基因修饰更为简便；许多药理学干预研究也倾向于使用小鼠，原因是小鼠体重较轻，按体重给药所需的药物剂量更少，从而降低了实验成本。本文报道一种利用市售设备（经轻微改造）在同一只小鼠体内随时间重复、无创测量膝伸肌功能的方法，该方法有助于不同实验室之间的结果重现，并可更直接地与人类肌肉力量的研究结果进行比较。

<table><tbody><tr><td>1300A：三合一整体动物系统 - 小鼠</td><td>Aurora Scientific Incorporated</td><td>300D-305C-FP：带定制膝关节伸展装置的双模式电机，605A：动态肌肉数据采集与分析系统，701C：电刺激器，809C：&lt;em&gt;in-situ&lt;/em&gt; 小鼠装置</td><td></td></tr><tr><td>6100 动态肌肉控制 LabBook 软件</td><td>Aurora Scientific Incorporated</td><td>DMC v6.000</td><td></td></tr><tr><td>611A 动态肌肉分析</td><td>Aurora Scientific Incorporated</td><td>DMA v5.501</td><td></td></tr><tr><td>BravMini 毛发修剪器</td><td>Wahl Clipper Corporation</td><td>ASIN: B00IN24ILE</td><td></td></tr><tr><td>眼用润滑膏</td><td>Optixcare</td><td>货号：142422</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Covetrus</td><td>NDC: 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>V-1 台式实验动物麻醉系统</td><td>VetEquip 吸入式麻醉系统</td><td>货号：901806</td><td></td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>GraphPad Software, LLC</td><td>版本 8.3.0 (328)</td><td></td></tr></tbody></table>

活体小鼠膝伸肌功能的测量

In vivo Measurement of Knee Extensor Muscle Function in Mice

骨骼肌在应对各种条件和刺激时表现出可塑性，从而介导同时发生的负面和正面功能适应。在临床和科研实验室中，人类最大肌力通常通过纵向测量进行评估，其中膝伸肌群的功能结果报道最为广泛。膝伸肌复合体的病理变化在衰老、骨科损伤、疾病和失用情况下均有明确记载；膝伸肌力量与功能能力及损伤风险密切相关，突显了可靠测量膝伸肌力量的重要性。在临床前啮齿类动物研究中，可重复的活体膝伸肌力量评估为探索骨关节炎或膝关节损伤的研究提供了有价值的功能终点。本文报道一种活体、非侵入性的实验方案，可用于在不同时间点重复测量小鼠膝伸肌的等长峰值强直力矩。我们通过在多只小鼠中重复评估，展示了使用该新方法测量膝伸肌力量的一致性结果。

力矩-频率曲线利用较低频率产生多个分离的等长抽搐，其力矩相对较低，并随着频率逐渐升高，导致抽搐融合，形成等长强直收缩，从而获得峰值强直力矩。本方案中膝关节伸展的峰值强直力矩的力-频率曲线从10 Hz开始，引发3次分离的抽搐。在40 Hz时出现抽搐的部分融合，峰值强直力矩在120–180 Hz之间达到（图5）。
图6展示了来自雌性C57BL/6小鼠的代表性膝关节伸展力矩-频率曲线。在基线水平对三只不同的小鼠进行了测试，并在2周后对每只小鼠重复实验，以评估结果的可重复性。力矩-频率曲线以原始力矩值呈现（图6A），同时也以相对于小鼠体重归一化的原始力矩值呈现（图6B）。重复观察显示，三只小鼠在两次实验之间间隔2周休息期的情况下，结果具有可比性。除原始力矩数据外，还应考虑经体重归一化的力矩数据，因为体重的轻微波动可能影响功能输出，而仅分析原始力矩值时未考虑这一因素。此外，经体重归一化的力矩数据有助于对体型不同的小鼠进行比较。力矩也可归一化为肌肉湿重或肌纤维横截面积，我们此前已对此有所报道16。
图7A展示了基于4只独立C57BL/6小鼠完整力-频率实验（10 Hz、40 Hz、120 Hz、150 Hz、180 Hz、200 Hz）中经体重归一化的等长力矩数据计算所得的曲线下面积，结果显示相同小鼠重复实验间的总力矩输出相似，变异系数介于5.6%至8.8%之间。图7B所示的峰强直力矩是最简化的数据报告形式，其定义为120–200 Hz范围内重复强直等长收缩所产生的最大力矩值。在6–8月龄雌性C57BL/6小鼠中，峰强直力矩输出具有可比性（图7B），相同小鼠纵向评估的变异系数介于4.8%至8.7%之间。峰强直力矩与人类研究中的金标准力量评估方法——最大等长力矩——最为相近。
此外，膝伸肌最大强直力矩方案是检测多种小鼠模型中力量差异的有效工具。图8展示了非损伤的健康6月龄C57BL/6雌性小鼠（黑线）与肌抑素/GDF8基因敲除的超生理性肥大小鼠模型（蓝线）在膝伸肌力量上的显著差异。我们还展示了C57BL/6小鼠在前交叉韧带手术切断后第7天的峰值强直力矩曲线（红线），显示损伤后峰值力矩下降近50%，远超出未损伤小鼠重复测试中观察到的变异系数范围。与人类研究数据17,18一致，前交叉韧带切断后力量显著降低。所有小鼠均为雌性，年龄相近（6–8个月）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>收缩实验</td>
			<td>电流 (mA)</td>
			<td>扭矩 (mN•m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>1.279</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>70</td>
			<td>1.341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>90</td>
			<td>1.36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>110</td>
			<td>1.362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>*130</td>
			<td>1.449</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>150</td>
			<td>1.436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>140</td>
			<td>1.333</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：抽搐序列示例。 * 表示最佳电流/电流强度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>频率 (Hz)</td>
			<td>扭矩 (mN•m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>1.385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>1.869</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120</td>
			<td>*18.765</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150</td>
			<td>18.375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180</td>
			<td>17.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>17.548</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：扭矩-频率曲线数据示例。 * 表示峰值强直收缩扭矩。
<img alt="实验的波形显示、数据处理和参数控制信号处理设置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：数据采集软件设置。 带有实时数据监控的数据采集软件设置示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于电生理研究的啮齿类动物固定装置，显示记录设备和电极。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠装置与电极放置。（A-B）小鼠仰卧位，通过加热平台上的鼻罩接受麻醉。将后肢上部在膝关节后方牢固夹紧，以允许膝关节自由活动。调节机械臂使膝关节弯曲约60°。通过针状电极刺激股神经运动点，以激活膝伸肌收缩。小鼠装置从侧面（A）和俯视（B）展示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示力与位置关系的数据分析图、随时间变化的实验结果、实时监测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：确定实现等长膝关节伸展的最佳电极放置位置。 使用“即时刺激”功能以50 mA进行重复刺激，并在“实时数据监测”界面中观察到的连续负性抽搐反应。红色箭头指示前三个膝关节伸展抽搐。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="动态肌肉分析图；力和位置随时间变化；ACL研究软件界面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：用于确定最佳电流强度的代表性单收缩曲线。 在力-频率实验中，必须通过逐步增加电流强度并重复进行单收缩实验，确定引发最大单收缩等长力矩所需的最低电流强度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理数据分析；显示电压轨迹的示意图；实验结果分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：同一只小鼠在扭矩-频率实验过程中具有代表性的强直收缩扭矩曲线。 （A）10 Hz时产生的次最大等长强直收缩扭矩。（B）40 Hz时的次最大等长强直收缩扭矩。（C）120 Hz时达到峰值的等长强直收缩扭矩输出。（D）150 Hz时的等长强直收缩扭矩。（E）180 Hz时的等长强直收缩扭矩。（F）200 Hz时的等长强直收缩扭矩。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示小鼠重复实验结果的扭矩-频率曲线图；对比分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：典型的扭矩-频率曲线数据。（A-B）在3只不同小鼠中两个不同时间点（第1周和第3周）的扭矩-频率曲线，以原始峰值扭矩（A）和按体重归一化的原始峰值扭矩（B）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="比较四只小鼠样本的曲线下面积（AUC）和强直收缩峰值扭矩的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：曲线下面积（AUC）和强直收缩峰值扭矩的代表性数据。（A）4只独立小鼠的AUC，以归一化至体重的原始扭矩表示。（B）相同4只小鼠的强直收缩峰值扭矩，以归一化至体重的原始峰值扭矩表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="扭矩随时间变化的曲线图；C57BL/6、C57BL/6 ACL-T、GDF8 KO 的扭矩响应；运动控制分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图8：多种小鼠模型膝伸肌的峰值强直收缩扭矩。 代表性峰值扭矩强直收缩曲线来自明显肥大的转基因小鼠模型（GDF8 KO）、未受伤的健康C57BL/6小鼠（小鼠2）以及前交叉韧带横断术后7天的C57BL/6小鼠（ACL-T）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充材料 图1定制塑料件的尺寸。 红色插图显示深度尺寸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 1：无运动臂状态下膝伸肌的实时抽搐。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/Supplementary%20video%201.mov" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 2：无电机臂时膝伸肌抽搐的慢动作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/Supplementary%20video%202.mov" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

量化膝伸肌最大肌力对于理解衰老、疾病、损伤及康复过程中的功能适应至关重要。我们提出了一种新方法，用于重复测量体内膝关节伸展的等长峰值强直性扭矩。

骨骼肌可塑性在应对无数条件和刺激时介导了同时发生的正负向功能适应。在……

膝伸肌力量是临床研究中常见的功能评估指标。然而，在啮齿类动物研究中，用于重复评估膝伸肌（尤其是股四头肌）力量的方法相对有限。本无创性方案可用于测量小鼠膝伸肌的等长峰值强直力矩，并可进行纵向重复测量。我们的方法支持开发临床前模型，以改善损伤后或骨关节炎患者的恢复情况。鉴于已开发出多种用于研究膝关节损伤或骨关节炎后肌肉骨骼结局的啮齿类动物模型，目前亟需一种无创评估股四头肌力量的方法。视觉演示对于确保数据完整性至关重要，我们将展示如何优化电极放置位置，以最大程度地刺激膝关节伸肌。开始实验前，请检查所有设备是否已根据制造商的规格正确连接。将双负荷肌肉杠杆电机与膝关节伸展装置连接至动物平台，将水泵温度设置为37摄氏度并开启，然后依次打开计算机、高功率双相刺激器和双通道双模式杠杆系统，并向蒸发器中加入异氟烷至最高填充刻度线。为优化探头放置位置，在仪器软件中选择“准备实验”和“配置即时刺激”，并将脉冲频率设置为125赫兹，脉冲宽度设置为0.2米每秒，脉冲数量设置为1，刺激串频率设置为0.5赫兹，运行时间设置为120秒。接下来，选择“文件”并打开实时数据监测器。要进行抽搐和扭矩频率实验，请选择一个先前已编程的研究方案，该方案需包含相应的抽搐和膝关节伸展扭矩频率实验。选择相应的实验小鼠，或选择“添加新动物”，并提供与扭矩数据一同存储的小鼠相关信息。然后，选择“下一个实验”或“上一个实验”，以从收缩刺激方案切换到频率-张力关系序列。麻醉后，通过检查足底反射消失确认小鼠已进入镇静状态，并将其仰卧置于加热平台上，头部固定于鼻罩中。使用电推剪剃除右侧后肢的毛发。清理小鼠和平台上的毛发后，将上段后肢在膝关节后方牢固夹紧。夹紧后，将下段后肢放入膝关节伸展装置中，使胫骨前侧轻轻接触可调节的塑料部件，并用手术胶带缠绕在可调节塑料部件的底部，以固定腿部。然后调节平台上的旋钮，使膝关节弯曲至60度角，并用一条胶带覆盖小鼠躯干，以防止在最大程度伸展膝关节时产生代偿性移动。将电极皮下插入膝关节上方股四头肌和膝伸肌区域，位置位于膝关节近端2至4毫米处，电极间距约为1至2毫米。为确定最佳电极放置位置，在软件中选择“即时刺激”和“实时数据监测”，并将电流设置为50毫安，以产生重复性抽搐，通过观察负向抽搐曲线确认伸展反应。为获得最大膝关节伸展抽搐力矩，需在实时数据监测窗口中观察反应的同时调整探头位置。在使用即时刺激产生重复抽搐的过程中，用食指触诊小鼠膝关节屈肌群，以确认拮抗肌未被激活。为实现膝伸肌的最大刺激，必要时重新调整探头位置。确定最佳探头放置位置后，将电流设置为 50 毫安，并选择“运行实验”以产生单次肌肉抽搐。选择“分析结果”以显示扭矩输出，并记录“最大力”下减去基线后的抽搐扭矩值。重复实验，直至抽搐力矩达到稳定或开始下降。每次实验时将电流增加至10至20毫安，并记录相应的抽搐力矩。记录产生最大抽搐力矩时所需的最低电流值。该电流将用于力-频率实验。为确定最大等长强直性扭矩效应，选择膝关节伸展的预编程扭矩-频率实验，设置刺激持续时间为 0.35 秒，频率序列为 10、40、120、150、180 和 200 赫兹，脉冲与收缩之间的休息时间为 120 秒。然后，点击“运行实验”和“分析结果”，并手动记录每个频率下的扭矩值，注意将力通道反转，因为膝关节伸肌收缩会产生负向扭矩。记录最大力值作为等长强直性扭矩的峰值。在扭矩-频率实验结束后，进行一次后续单次刺激收缩，并将此次单次收缩与相同电流强度下的初始峰值单收缩进行比较，以评估是否存在组织损伤或疲劳。当所有扭矩测量完成后，轻柔地移除电极探头和膝关节处的夹具，将小鼠放入带有加热垫的恢复笼中，并持续监测直至其完全恢复卧位。在此代表性分析中，在10赫兹的初始电流刺激下引入了三次分离的抽搐。在40赫兹时观察到部分抽搐融合，而在120至180赫兹时达到最大强直力矩输出。在本实验中，分别在初始评估时（零时间点）和两周后，获得了三只小鼠的膝关节伸展力矩-频率曲线。如观察所示，在两个时间点，原始扭矩值以及按小鼠体重归一化的原始扭矩值在统计学上相似，证实了该分析的可重复性。如本图所示，通过对四只不同小鼠的完整扭矩-频率实验中采用体重归一化的等长扭矩数据进行曲线下面积分析，对同一动物重复分析后获得了相似的总扭矩值。每只动物的最大强直收缩扭矩输出也显示出极小的变异性。膝伸肌最大强直力矩方案是检测多种小鼠模型中力量差异的有效工具。例如，在本分析中，可观察到非损伤的野生型小鼠与具有超生理肥大表型的转基因小鼠模型在膝伸肌力量上存在显著差异。此外，在野生型动物中，前交叉韧带手术切断七天后，其最大力矩下降了近50%。最佳电极放置对于获得有意义且可重复的结果至关重要。膝伸肌肌肉疲劳是身体功能的重要指标，包括重复的次最大收缩，未来评估将进一步增强该方法在临床前模型中的转化意义。研究肌肉适应机制的实验常利用小鼠模型，因其基因修饰操作简便。该技术为在这些临床前模型中重复测量体内膝伸肌功能提供了一种无创方法。

in-vivo-measurement-of-knee-extensor-muscle-function-in-mice

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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使用压力应用测量法评估小鼠膝关节痛觉过敏

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活体小鼠膝伸肌功能的测量

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