Name: 使用来自同一物种的抗体进行双标记免疫荧光研究宿主 - 病原体相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习使用同种来源的多克隆和单克隆抗体进行双重免疫荧光标记的技术，以研究宿主细胞与克氏锥虫的相互作用。该方法通过关键阻断步骤避免交叉反应，适用于抗体资源有限的寄生虫蛋白定位研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由圣保罗州研究支持基金会（FAPESP 2010/19547-1；2018/03677-5）向 MMAB 提供资助，由教学、研究与援助支持基金会（FAEPA）向 MMAB 提供资助，以及由巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES）——资助代码 001 提供支持。CG-C 获得了 CAPES 的硕士和博士奖学金，LAMT-S 获得了 CNPq 的博士奖学金。我们感谢 Elizabete R. Milani 在共聚焦显微镜方面的协助，以及 Dario Zamboni 博士提供了 LLC-MK2 细胞（圣保罗大学里贝朗普雷图医学院）。

1. 细胞与寄生虫培养
<ol>
	<li>在含有RPMI培养基的25 cm2&#160;细胞培养瓶中培养购自美国模式培养物集存库（CCL-7）的LLC-MK2（恒河猴肾上皮）细胞，培养基中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）以及抗生素（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），于37 °C、5% CO2条件下培养17。</li>
	<li>按照先前报道的方法18，用克氏锥虫（Y株）感染LLC-MK2细胞。</li>
	<li>收集感染后的LLC-MK2细胞上清液（5 mL）至15 mL细胞培养锥形离心管中，在22 °C下以500 × g离心10分钟以去除细胞碎片。将离心管置于37 °C环境中静置10分钟，使上清液中的上鞭毛体自由游动至液体上层。</li>
	<li>将上清液转移至新的锥形管中，在22 °C下以2500 × g离心15分钟。弃去上清液，将含有寄生虫的沉淀重悬于完全RPMI培养基中，通过血球计数板（Neubauer计数室）计数以确定细胞密度。</li>
</ol>
2. 对照免疫荧光实验方案
注意：固定后，含有盖玻片的培养板可在 1x PBS（pH 7.2）中于 4 °C 保存一周。保存时需确保细胞尚未经过通透化步骤。
<ol>
	<li>将LLC-MK2细胞（2 × 104）接种于24孔板中，每孔含有经紫外灭菌的圆形盖玻片，并加入RPMI培养基，培养16小时。</li>
	<li>对于感染组细胞，将含有T. cruzi（步骤1.4）的上清液按感染复数（MOI）10:1的比例加入各孔，感染6小时。用PBS溶液对含有感染和未感染细胞的盖玻片各清洗5次，随后用含2%多聚甲醛的1×PBS（pH 7.2）在室温（RT）下固定10分钟。</li>
	<li>用1×PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片3次，每次5分钟。</li>
	<li>用含0.2% IGEPAL CA-630的1×PBS（pH 7.2）在室温下对盖玻片进行通透处理，持续10分钟。</li>
	<li>用1×PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟。</li>
	<li>在室温下用封闭液（含2% BSA的1×PBS，pH 7.2）孵育盖玻片30分钟。</li>
	<li>在室温下，将盖玻片与小鼠单克隆抗hnRNPA1抗体（稀释比例1:200）或小鼠多克隆抗TcFAZ抗体（稀释比例1:100）在封闭液中孵育30分钟。</li>
	<li>用1×PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟。</li>
	<li>在室温下，将盖玻片与Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG F(ab')2（H+L）二抗（1:600稀释）以及Alexa 594标记的鬼笔环肽（1:300稀释）共同孵育30分钟，以标记宿主细胞中的肌动蛋白丝（F-actin），上述试剂均用封闭液稀释。</li>
	<li>用1×PBS（pH 7.2）洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>在载玻片表面滴加少量含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂。</li>
	<li>使用镊子将盖玻片轻轻倾斜放入封片剂中，避免产生气泡。待其干燥后，可根据需要对盖玻片进行封固。</li>
</ol>
3. 使用同一宿主产生的单克隆和多克隆抗体进行双重标记免疫荧光实验方案
<ol>
	<li>重复上述步骤 2.1 至 2.6。</li>
	<li>将含有感染和未感染细胞的盖玻片与实验室自制的小鼠多克隆抗 TcFAZ 抗体（1:100）在封闭液中稀释后，在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>在室温下，将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa Fluor 647 标记的山羊抗小鼠 IgG F(ab')2 (H+L) 抗体（1:600）孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>使用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠 IgG (H+L) 抗体（0.12 mg/mL），在室温下进行第二次封闭步骤，孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 pH 7.2 的 1× PBS 洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟；然后在室温下与小鼠单克隆抗 hnRNP A1 IgG2b 抗体（1:200）孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG2b 抗体（1:600）以及 Alexa 594 标记的鬼笔环肽（1:300）在室温下共同孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>重复上述步骤 2.8 至 2.10。</li>
</ol>
4. 添加来自不同宿主物种的第三种多克隆抗体的三重标记免疫荧光实验方案
注意：进行额外标记时，需注意IgG亚类和抗体同种型，并按以下顺序使用抗体：1. 小鼠多克隆抗体，2. 兔多克隆抗体，3. 第二封闭步骤，4. 小鼠单克隆抗体。应根据共聚焦显微镜所配备的激光器类型，选择合适的荧光素标记的二抗。
<ol>
	<li>重复上述步骤 2.1 至 2.6。</li>
	<li>在完成步骤 3.2 至 3.5（洗涤步骤）后，加入用封闭液稀释的兔多克隆抗体，在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa 647 标记的山羊抗兔 IgG 抗体（1:600）孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>使用用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠 IgG（H+L）（0.12 mg/mL）在室温下封闭 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟，然后与用封闭液稀释的小鼠单克隆 IgG 亚类抗体孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa 594 标记的特异性山羊抗小鼠 IgG 亚类抗体（1:600）孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。</li>
</ol>
5. 共聚焦成像采集
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜分析免疫荧光样品，物镜为63倍油镜，通过光电倍增管（PMT）和混合探测器（HyD）检测荧光信号。 
	注：本实验采用圣保罗大学里贝朗普雷图医学院共聚焦显微镜多用户实验室（LMMC）的设备设置。</li>
	<li>以分通道方式采集所有共聚焦图像，使用 Adobe Photoshop 进行图像处理。</li>
</ol>

<ol><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li>
<li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions%3A+basic+concepts+of+microbial+commensalism%2C+colonization%2C+infection%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li>
<li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585(2015).</li>
<li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li>
<li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+natural+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li>
<li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551(2015).</li>
<li>Tóth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545(2007).</li>
<li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243(2006).</li>
<li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143(2005).</li>
<li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67(2004).</li>
<li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197(1999).</li>
<li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331(1996).</li>
<li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47(1985).</li>
<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li>
<li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. dS., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreira%2C+BP+%22Microscopy+and+Imaging+Science%3A+Practical+Approaches+to+Applied+Research+and+Education%22">Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education</a>. Méndez-Vilas, A. 7, 374-378 (2016).</li>
<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1%2C+LLC-MK2%2C+and+LLC-MK2+%28NCTC-3196%29+and+their+utility+in+virus+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li>
<li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li>
<li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+Trypanosoma+cruzi%3A+Host+Cell+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394(2010).</li>
<li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li>
<li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li>
<li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li>
<li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li>
<li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hnRNP+A1%3A+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li>
<li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+subclasses+and+allotypes%3A+from+structure+to+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520(2014).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性或经济利益冲突。

本文介绍了一种利用同一宿主物种来源的两种不同抗体，在Trypanosoma cruzi感染细胞中进行双重免疫标记的实验方案。为了更详细地研究感染的影响，可利用该方案对标记宿主细胞内的结构（如细胞核或胞质细胞器）进行可视化。此外，该方法也可应用于包埋后超薄切片的免疫胶体金标记技术。该策略有助于克服在研究锥虫科原虫及其他寄生虫时可用抗体种类有限的难题。
此外，我们的实验方案显示，可在同一免疫荧光图像中同时标记细胞内寄生虫及其宿主细胞，实现两种真核生物的同时可视化，这与以往应用于不同类型组织的方案有所不同7,8,9,10,11,12,<sup class="...

在细胞水平上研究病原体与宿主细胞的相互作用，可为疾病发生机制提供关键信息，因为不同类别的病原体&#160;（如病毒、细菌和原生动物）&#160;能够感染大多数类型的宿主细胞1,2,3,4。该研究还有助于发现和鉴定潜在的治疗靶点，从而减缓或抑制病原体的生长。在活体条件下，机体产生的抗体负责识别自身成分、病毒抗原、细菌组分或其产物、真菌、寄生虫以及其他外来物质5。
为此，抗体是广泛使用的工具，主要用于了解细胞结构和蛋白质的定位与功能。多项使用多重抗体标记的研究表明，额外的封闭步骤有助于提高免疫定位的特异性。此外，大多数已报道的实验方案均采用特定的商业单克隆抗体，包括来自相同宿主物种的抗体6,7,8,9,10,11,12,13,14。
通常，双重标记免疫荧光技术使用来自不同物种的两种抗体，对目标细胞结构、病原体以及宿主细胞进行染色，以观察它们之间的相互作用。然而，当缺乏针对某些病原体的商业化单克隆或多克隆抗体时，进行双重标记就会遇到困难。尽管目前已有市售的抗体偶联试剂盒，可通过琥珀酰亚胺酯反应将一抗直接与荧光染料偶联15，但这些试剂盒往往价格昂贵，且需要足够量的抗体用于标记。鉴于上述限制，我们成功开发了一种双重免疫荧光方法，使用来自同一物种的两种不同一抗，用于研究Trypanosoma brucei中的蛋白质定位16。然而，对于包括Trypanosoma cruzi在内的胞内寄生虫，该方法尚未被证实可行。本文中，我们展示了如何利用来自同一物种且不发生交叉反应的一抗，对胞内T. cruzi寄生虫及其宿主细胞进行双重标记免疫荧光染色。此外，通过引入来自另一物种的第三种抗体，我们还建立了三重免疫荧光标记方法。这些方法在抗体来源受限时尤为有用，并可应用于任何类型的细胞。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 - IgG2b 抗体</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21141</td><td>羊抗小鼠</td></tr><tr><td>AffiniPure 兔抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch, USA</td><td>315-005-003</td><td>抗小鼠抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体</td><td>Life technologies, USA</td><td>A11017</td><td>羊抗小鼠</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 IgG1 抗体</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21125</td><td>羊抗小鼠</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21237</td><td>羊抗小鼠</td></tr><tr><td>抗 hnRNPA1 抗体 IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>R4528</td><td>小鼠抗体</td></tr><tr><td>抗 TcFAZ（T. cruzi FAZ 蛋白）抗体</td><td>本实验室</td><td>自制</td><td>小鼠抗体</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A2153-10G</td><td>白蛋白蛋白</td></tr><tr><td>去垢剂 Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>I3021</td><td>非离子型去垢剂</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td><td>12657-029</td><td>血清</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td><td>15140-122</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>鬼笔环肽 Alexa Fluor 594</td><td>Life technologies, USA</td><td>A12381</td><td>肌动蛋白标记物</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life technologies, USA</td><td>P36935</td><td>封片介质试剂</td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 1X 培养基</td><td>Corning, USA</td><td>10-040-CV</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T4049-100ML</td><td>生物试剂</td></tr></tbody></table>

使用同种来源抗体进行双重标记免疫荧光研究宿主-病原体相互作用

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

如今，已有多种分子工具可用于研究寄生虫与宿主细胞之间的相互作用。然而，在获取可识别寄生虫中特定细胞结构和蛋白质的商用单克隆或多克隆抗体方面仍存在一些限制。此外，可用于标记锥虫科原虫的商业抗体种类较少。通常，针对寄生虫的多克隆抗体需自行制备，且可能在与其他同种动物来源的抗体联合使用时带来更大挑战。本实验方案展示了如何利用同一种动物来源的多克隆和单克隆抗体进行双重标记免疫荧光染色，以研究宿主细胞与病原体之间的相互作用。实现双重标记免疫荧光的关键在于：首先孵育小鼠多克隆抗体，随后加入与任意荧光染料偶联的小鼠IgG二抗进行孵育。之后，必须增加一个额外的封闭步骤，以防止残留的初级抗体被下一个二抗识别。接着，在适当的时间点向样本中加入小鼠单克隆抗体及其特异性的IgG亚类二抗（与另一种荧光染料偶联）。此外，还可通过引入第三种不同物种来源的抗体实现三重标记免疫荧光染色。同时，细胞核和肌动蛋白等结构也可随后使用其特异性染料或标记物进行染色。因此，本文所述方法可适用于任何初级抗体来源受限的细胞体系。

在此，我们展示了当由于缺乏可识别锥虫体中特定结构和蛋白质的商业抗体而导致抗体来源有限时，如何通过免疫荧光研究宿主-寄生虫相互作用。
在锥虫科生物中， T. cruzi 具有最复杂的生活周期之一，涉及在脊椎动物和无脊椎动物宿主之间的一系列不同发育阶段 19. 在……期间 T. cruzi 生活周期，在哺乳动物感染的早期阶段，循环型前鞭毛体通过涉及寄生虫和脊椎动物宿主细胞中多种分子的过程侵入细胞 19,20. 为研究这些过程，本实验室常规自制针对特定蛋白质的多克隆抗体 T. cruzi, T. brucei 和 利什曼原虫属16,21,22...

本方案描述了如何使用同一物种来源的初级抗体进行双重标记免疫荧光，以研究宿主-病原体相互作用。此外，该方案还可包含来自不同宿主的第三种抗体。此方法适用于任何类型的细胞和病原体。

如今，已有多种分子工具可用于研究寄生虫与宿主细胞间的相互作用。然而，这些工具仍存在一些局限性……

在本实验方案中，可将来自同一宿主的两种抗体联合用于免疫荧光检测，以研究宿主细胞与病原体之间的相互作用。由于目前 commercially available 能够识别寄生虫中特定细胞结构和蛋白质的抗体数量有限，该方案具有重要应用价值。本方案是一种易于操作的双重标记免疫荧光方法，可同时使用同一物种来源的多克隆抗体和单克隆抗体。许多研究人员可能并未意识到这是可行的。当抗体来源有限时，该方法尤为适用。它可用于检测感染宿主细胞中病原体的宿主细胞蛋白，也可应用于自由生活的生物体。该方案十分简单，仅需在第一对和第二对抗体之间进行一次封闭步骤。本实验操作将由我实验室的卡米拉·加切特-卡斯特罗博士（Dr. Camila Gachet-Castro）和博士生莱斯·特拉哈诺-席尔瓦（Lays Trajano-Silva）进行演示。在用克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）感染LLC-MK2细胞三天后，从感染细胞中收集上清液至一个15毫升的细胞培养锥形管中。离心样品以沉淀细胞碎片，然后将离心管置于室温，使上清液中的动基体鞭毛虫游出。10分钟后，将上清液转移至新的锥形离心管中，再次离心样品并弃去上清液，随后用完全RPMI培养基重悬含有寄生虫的沉淀。在含有经紫外线灭菌的圆形盖玻片的24孔板中加入LLC-MK2细胞，并静置16小时使其贴壁。随后，为了感染细胞，将含有克氏锥虫（T. Cruzi）的上清液加入每个孔中，孵育6小时。接着，用PBS洗涤含有感染和未感染细胞的盖玻片5次，每次固定后，用含2%多聚甲醛的PBS固定细胞。10分钟后，用PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟，然后用非离子型去垢剂处理盖玻片10分钟以进行通透化。经过三次每次五分钟的 PBS 洗涤后，将盖玻片在封闭液中孵育 30 分钟，随后加入小鼠单克隆或多克隆抗体，继续孵育 30 分钟。PBS 洗涤后，将盖玻片在封闭液中与二抗及鬼笔环肽共同孵育 30 分钟，以标记宿主细胞中的肌动蛋白纤维。然后再次用 PBS 洗涤盖玻片三次，最后在载玻片表面加入少量含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。用镊子轻轻倾斜盖玻片，使其在溶液中缓慢浸入，以防止气泡产生。对于双重标记实验，在将盖玻片按前述方法在封闭液中孵育后，将其置于小鼠多克隆抗体中孵育30分钟。随后，用PBS洗涤盖玻片三次，每次5分钟，再将盖玻片与二抗孵育30分钟。随后用 PBS 洗涤三次，再用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠 IgG 进行第二步封闭。30 分钟后，再次用 PBS 洗涤盖玻片，然后与小鼠单克隆抗体孵育 30 分钟。接着，经过三次 PBS 洗涤后，将盖玻片与山羊抗小鼠 IgG 2B 抗体及鬼笔环肽共同孵育。然后进行三次 PBS 洗涤，按先前所示方法加入抗荧光淬灭封片剂。对于三重标记，在封闭盖玻片并用小鼠多克隆抗体孵育后，再与 goat anti-mouse 抗体孵育，随后在封闭液中加入兔多克隆抗体进行新的孵育，持续 30 分钟。接着再经过三次 PBS 洗涤，将盖玻片与 goat anti-rabbit 抗体孵育 30 分钟。接下来，用 PBS 洗涤三次后，加入用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠抗体，室温封闭 30 分钟。然后再次洗涤盖玻片，再与任意小鼠单克隆 IgG 亚类抗体在室温孵育 30 分钟。经过三次 PBS 洗涤后，将盖玻片与一对特异性的山羊抗小鼠 IgG 亚类抗体在室温孵育 30 分钟。孵育后，用 PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。使用配备 63X 油镜物镜的共聚焦显微镜观察免疫荧光样品，并通过光电倍增管和混合探测器检测荧光信号。随后以分通道采集所有共聚焦图像，并使用 Adobe Photoshop 进行图像处理。这些共聚焦显微镜图像展示了感染与非感染细胞的对照实验结果，突出了抗体在宿主细胞和内化寄生虫中的特异性。小鼠多克隆抗体抗克氏锥虫鞭毛附着区（FAZ）可识别寄生虫鞭毛上的克氏锥虫（T. cruzi）巨大蛋白，但在宿主细胞中无识别信号。使用一种仅识别宿主哺乳动物细胞而不识别寄生虫的商用小鼠单克隆抗体，观察到异质性核糖核蛋白A1在细胞核内的分布情况。此外，使用 DAPI 对宿主和寄生虫的细胞核以及寄生虫的动基体进行染色，并使用与 Alexa 594 偶联的鬼笔环肽对宿主的 F-actin 进行染色，从而证实了抗体的特异性。双重标记免疫荧光通过共聚焦显微镜分析宿主和寄生虫中蛋白质的分布情况。标记结果表明，采用该方法的抗体之间无交叉反应。综上所述，本文所述用于研究宿主-病原体相互作用的实验方案提供了一种基础且精细的技术，可适用于任意组合的抗体。该方法使免疫荧光技术更具成本效益，并可在可用抗体种类有限的情况下，帮助研究两种或多种目标蛋白的定位。

double-labeling-immunofluorescence-using-antibodies-from-same-species

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用来自同一物种的抗体进行双标记免疫荧光研究宿主 - 病原体相互作用

本视频展示了使用同一种属来源的两种不同一抗进行双重标记免疫染色，这两种一抗可特异性结合寄生虫和宿主的蛋白质。此外，通过使用针对这些一抗的标记二抗，可清晰区分宿主和寄生虫蛋白的信号，从而促进宿主-病原体相互作用的研究。...

一种双标记免疫荧光技术用于可视化感染细胞中的宿主与病原体蛋白

本视频展示了一种使用同一宿主物种来源的一抗进行多重免疫染色的实验方法。该方法中，肾上腺组织切片经历两步免疫染色过程：首先，切片用特异性识别皮质标记物的抗体进行染色；随后，去除已结合的抗体，再用特异性识别髓质标记物的抗体重新染色。...

使用同一种宿主来源的一抗进行多重免疫染色的方法

我们描述了一种利用特异性多克隆抗体标记活神经元表面蛋白的方法，该抗体针对细胞外表位。通过内吞作用被抗体结合并在细胞表面内化的蛋白，可与在孵育期间仍停留在表面或转运至表面的蛋白区分开来。...

活体培养神经元抗体孵育后细胞表面与内化蛋白的差异标记

本入门级实验方案以小胶质细胞和神经元成分的标记物为例，介绍了完成啮齿类动物脑组织免疫组织化学染色所需的试剂、仪器和操作技术。...

冷冻切片大鼠脑组织免疫组织化学染色初学者指南：小胶质细胞与神经元染色示例

本视频文章展示了一种全面的实验方案，可在同一组织切片中检测并定量成年海马神经发生的各个阶段。我们改进了一种方法，以克服在无法获得来自不同宿主物种的合适抗体时，间接多重免疫荧光技术所存在的局限性。...

使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

受体转运可调节细胞对配体的信号转导及反应性，并且其自身也响应细胞内的各种条件，包括配体诱导的信号通路。本文中，我们介绍一种强大且灵活的技术，通过免疫标记和共定位分析，定量评估药物诱导的受体转运。...

通过共定位分析追踪药物诱导的受体内在化后转运变化

已建立多种不同方法，用于在同一宿主物种来源的初级抗体基础上进行多重免疫染色。本文描述了在甲醛固定石蜡包埋的小鼠肾上腺切片上进行多重免疫染色时，采用微波介导的抗体剥离以及荧光素-酪胺来阻断抗体交叉反应性的方法。...

微波与荧光素-酪胺信号放大技术用于小鼠肾上腺多重免疫染色——使用同一宿主物种的非偶联一抗

这一简化的实验方案详细描述了从组织固定到利用荧光标记微生物，以检测和成像复杂组织样本中细菌的工作流程 原位 杂交...

通过荧光技术可视化肠道微生物群-宿主相互作用 原位 杂交、凝集素染色与成像

本方案描述了一种用于评估过敏性鼻炎大鼠模型的多色免疫荧光技术。...

过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织切片的免疫荧光标记 通过 多色免疫分析

本文描述了一种利用与旋转盘显微镜耦合的光镊对活体病原体进行单独选择、操控和成像的方法。光镊可对生物体实现空间和时间上的精确控制，并将其定位在宿主细胞附近。荧光显微镜则能够在对细胞干扰最小的情况下，捕捉动态的细胞间相互作用。...

使用光镊技术进行活细胞动态成像研究宿主-病原体相互作用

学习使用同种来源的多克隆和单克隆抗体进行双重免疫荧光标记的技术，以研究宿主细胞与克氏锥虫的相互作用。该方法通过关键阻断步骤避免交叉反应，适用于抗体资源有限的寄生虫蛋白定位研究。

使用同种来源抗体进行双重标记免疫荧光研究宿主-病原体相互作用

探索更多视频