使用同种来源抗体进行双重标记免疫荧光研究宿主-病原体相互作用

在本实验方案中，可将来自同一宿主的两种抗体联合用于免疫荧光检测，以研究宿主细胞与病原体之间的相互作用。由于目前 commercially available 能够识别寄生虫中特定细胞结构和蛋白质的抗体数量有限，该方案具有重要应用价值。本方案是一种易于操作的双重标记免疫荧光方法，可同时使用同一物种来源的多克隆抗体和单克隆抗体。

许多研究人员可能并未意识到这是可行的。当抗体来源有限时，该方法尤为适用。它可用于检测感染宿主细胞中病原体的宿主细胞蛋白，也可应用于自由生活的生物体。

该方案十分简单，仅需在第一对和第二对抗体之间进行一次封闭步骤。本实验操作将由我实验室的卡米拉·加切特-卡斯特罗博士（Dr. Camila Gachet-Castro）和博士生莱斯·特拉哈诺-席尔瓦（Lays Trajano-Silva）进行演示。在用克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）感染LLC-MK2细胞三天后，从感染细胞中收集上清液至一个15毫升的细胞培养锥形管中。

离心样品以沉淀细胞碎片，然后将离心管置于室温，使上清液中的动基体鞭毛虫游出。10分钟后，将上清液转移至新的锥形离心管中，再次离心样品并弃去上清液，随后用完全RPMI培养基重悬含有寄生虫的沉淀。在含有经紫外线灭菌的圆形盖玻片的24孔板中加入LLC-MK2细胞，并静置16小时使其贴壁。

随后，为了感染细胞，将含有克氏锥虫（T. Cruzi）的上清液加入每个孔中，孵育6小时。接着，用PBS洗涤含有感染和未感染细胞的盖玻片5次，每次固定后，用含2%多聚甲醛的PBS固定细胞。10分钟后，用PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟，然后用非离子型去垢剂处理盖玻片10分钟以进行通透化。

经过三次每次五分钟的 PBS 洗涤后，将盖玻片在封闭液中孵育 30 分钟，随后加入小鼠单克隆或多克隆抗体，继续孵育 30 分钟。PBS 洗涤后，将盖玻片在封闭液中与二抗及鬼笔环肽共同孵育 30 分钟，以标记宿主细胞中的肌动蛋白纤维。然后再次用 PBS 洗涤盖玻片三次，最后在载玻片表面加入少量含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。

用镊子轻轻倾斜盖玻片，使其在溶液中缓慢浸入，以防止气泡产生。对于双重标记实验，在将盖玻片按前述方法在封闭液中孵育后，将其置于小鼠多克隆抗体中孵育30分钟。随后，用PBS洗涤盖玻片三次，每次5分钟，再将盖玻片与二抗孵育30分钟。

随后用 PBS 洗涤三次，再用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠 IgG 进行第二步封闭。30 分钟后，再次用 PBS 洗涤盖玻片，然后与小鼠单克隆抗体孵育 30 分钟。接着，经过三次 PBS 洗涤后，将盖玻片与山羊抗小鼠 IgG 2B 抗体及鬼笔环肽共同孵育。

然后进行三次 PBS 洗涤，按先前所示方法加入抗荧光淬灭封片剂。对于三重标记，在封闭盖玻片并用小鼠多克隆抗体孵育后，再与 goat anti-mouse 抗体孵育，随后在封闭液中加入兔多克隆抗体进行新的孵育，持续 30 分钟。接着再经过三次 PBS 洗涤，将盖玻片与 goat anti-rabbit 抗体孵育 30 分钟。

接下来，用 PBS 洗涤三次后，加入用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠抗体，室温封闭 30 分钟。然后再次洗涤盖玻片，再与任意小鼠单克隆 IgG 亚类抗体在室温孵育 30 分钟。经过三次 PBS 洗涤后，将盖玻片与一对特异性的山羊抗小鼠 IgG 亚类抗体在室温孵育 30 分钟。

孵育后，用 PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。使用配备 63X 油镜物镜的共聚焦显微镜观察免疫荧光样品，并通过光电倍增管和混合探测器检测荧光信号。随后以分通道采集所有共聚焦图像，并使用 Adobe Photoshop 进行图像处理。

这些共聚焦显微镜图像展示了感染与非感染细胞的对照实验结果，突出了抗体在宿主细胞和内化寄生虫中的特异性。小鼠多克隆抗体抗克氏锥虫鞭毛附着区（FAZ）可识别寄生虫鞭毛上的克氏锥虫（T. cruzi）巨大蛋白，但在宿主细胞中无识别信号。使用一种仅识别宿主哺乳动物细胞而不识别寄生虫的商用小鼠单克隆抗体，观察到异质性核糖核蛋白A1在细胞核内的分布情况。

此外，使用 DAPI 对宿主和寄生虫的细胞核以及寄生虫的动基体进行染色，并使用与 Alexa 594 偶联的鬼笔环肽对宿主的 F-actin 进行染色，从而证实了抗体的特异性。双重标记免疫荧光通过共聚焦显微镜分析宿主和寄生虫中蛋白质的分布情况。标记结果表明，采用该方法的抗体之间无交叉反应。

综上所述，本文所述用于研究宿主-病原体相互作用的实验方案提供了一种基础且精细的技术，可适用于任意组合的抗体。该方法使免疫荧光技术更具成本效益，并可在可用抗体种类有限的情况下，帮助研究两种或多种目标蛋白的定位。