利用实时活体多光子显微镜观察聚焦超声联合微泡治疗以增强血脑屏障通透性

在微泡存在的情况下进行超声照射已成为一种有效方法，可暂时且局部地增加血脑屏障的通透性。正常情况下，血脑屏障会阻碍多种脑部疾病潜在药物的递送。经超声作用后，注射的微泡开始振荡，并对血管壁产生应力，从而打开紧密连接，最终使药物得以穿过血脑屏障。在临床前模型中，超声联合微泡治疗的效果通常通过对比增强磁共振成像或体外研究染料的外渗情况来评估。

这种方法的缺点是无法获取超声暴露期间及暴露后即刻的实时响应。活体多光子脑成像技术为实时研究这些效应提供了可能。在接下来的视频中，我们将逐步介绍如何在小鼠颅骨上安装颅窗，并使用安装在颅骨上的环形换能器进行超声微泡治疗。

该操作可实现同步超声处理与活体多光子成像。首先，准备开颅窗手术及超声微泡治疗所需的材料。在本视频中，我们展示了一种急性非复苏性开颅窗手术。

进行慢性恢复颅窗手术时，需要无菌的器械和材料、无菌的手术环境以及适当的药物。术前应给予麻醉和镇痛处理。去除头部的毛发。

将动物置于立体定位仪中。在尾静脉插入导管，用于右旋糖酐和微泡注射。使用热源维持动物核心温度为37摄氏度。

此处我们使用一个装有温水的手套。为去除头皮，用镊子提起两眼之间的皮肤，并沿矢状缝剪开。用棉签去除覆盖在颅骨外表面的骨膜。

随后在颅骨上标记颅窗的预期位置，并沿轮廓开始钻孔。为防止钻孔过程中颅骨过热，使用注射器将生理盐水滴加到颅骨表面，或用浸有生理盐水的外科海绵进行冷却。钻孔与冷却操作应交替进行。

通过轻轻按压骨岛检查钻孔进展。使用镊子移除骨岛。使用预先用生理盐水浸泡过的外科海绵保持脑组织湿润。

安装颅窗时，将一滴生理盐水滴加到盖玻片的一侧，并将其移至颅骨的孔洞上方。在盖玻片周围边缘涂抹一层胶水，以将其固定在颅骨上。待胶水完全干燥后，将琼脂糖溶液滴加到颅窗上，然后将换能器放置在上方。

施加稳固的压力，使换能器与颅窗之间的琼脂糖尽可能少。当琼脂糖冷却至类似果冻的稠度时，切除换能器盖玻片边缘多余的琼脂糖。沿换能器盖玻片的周边涂抹一层胶水，将其粘附于颅骨上。

待胶水完全干燥后，将动物置于显微镜物镜下方。确保物镜不会与换能器或盖玻片发生碰撞。在多光子显微镜中选择一个视野区域。

设置血管成像扫描并开始超声照射。本方案中，我们使用一个驱动频率为0.82兆赫、机械指数以0.2至0.4进行10毫秒脉冲循环、脉冲重复频率在1至4赫兹之间的环形换能器。每公斤体重注射1毫升剂量的Sonovue微泡。

可通过荧光葡聚糖从血管内空间渗出至血管外空间的现象来检测超声微泡治疗是否成功，该现象表明血脑屏障通透性增加。为了评估葡聚糖渗漏的动力学特征，以此作为药物递送的代表性模型，可使用 MATLAB 等工具分析血管内与血管外空间之间的信号强度。为了评估超声微泡治疗所诱导的血管变化，可在超声微泡治疗前、治疗中和治疗后测量目标血管的直径。

可以使用 ImageJ、FIJI 或编程工具等软件进行图像分析。本研究中采用 Imaris 进行血管的分割与分类。结合环形换能器的活体多光子显微镜脑成像技术，能够在高空间和时间分辨率下实时监测超声微泡治疗所诱导的效应。

可以获得定量和定性数据，用于研究例如外渗动力学和血管变化。本文介绍的实验方法可应用于多种研究模型及各种超声应用。