颗粒模板乳化实现无需微流控的液滴分析

与定量PCR相比，数字液滴PCR具有更高的准确性和灵敏度。本方法操作简便，仅需最少的设备且无需专业技术。粒子模板乳化是一种无需微流控技术的乳化方法，不需要任何专用设备。

此外，乳化过程在数秒内发生，并随容器体积扩大而相应放大。对于商用微珠，取0.5克适用于颗粒模板乳化（PTE）的干燥聚丙烯酰胺颗粒，加入至50毫升锥形管中的30毫升无菌水中，充分混匀。室温孵育30分钟。

进行微流控微珠制备时，将一毫升光刻胶倒入三英寸硅片的中心，随后以500 RPM转速旋转30秒，再以1250 RPM转速旋转30秒。将硅片置于设定为95摄氏度的加热板上15分钟，以蒸发溶剂。用盖玻片将光掩模固定在硅片上，并在准直的紫外LED光源下曝光2.5分钟。

将晶圆置于设定为95摄氏度的加热板上，进行5分钟的曝光后烘烤。将光刻胶硅片浸入100%PGMEA溶液中，显影时间最长可达15分钟。用新鲜的100%PGMEA冲洗晶圆，随后用100%异丙醇冲洗。

将晶圆风干，然后在95摄氏度的热板上干燥一分钟，随后放入洁净的三英寸培养皿中。按10:1的比例混合PDMS硅胶基础剂与固化剂，再将混合后的PDMS置于真空干燥器中脱气，直至观察不到气泡。将脱气后的PDMS倒入培养皿中，确保硅晶圆完全浸没。

对硅片和聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行脱气处理，然后将硅片放入设定为65°C的烘箱中至少固化60分钟，使PDMS固化。使用解剖刀从培养皿中切下含有微流控结构的PDMS块。使用0.75毫米的活检打孔器在PDMS块上打出入孔和出孔。

然后，通过反复使用包装胶带粘贴并撕下，去除方块表面的灰尘和颗粒物。用100%异丙醇冲洗玻璃载片以清洁表面，随后使其自然风干。使用等离子体键合仪，以1毫巴的氧气等离子体对方玻片和PDMS进行处理，处理时间为1分钟。

将经等离子体处理的PDMS（微结构面朝下）贴合到经等离子体处理、表面朝上的载玻片上，完成PDMS与玻璃载片的粘附。将载玻片置于65 °C的烘箱中至少30分钟，以完成键合。对所有微流控通道进行氟化表面处理，以确保表面具有疏水性，随后将器件在65 °C下烘烤至少10分钟。

将含有聚丙烯酰胺（PAA）和氢氟醚（HFE）溶液的注射器分别装入注射泵中。使用聚乙烯管将两支注射器连接至微流控装置。运行液滴生成装置，并在15毫升收集管中收集1毫升液滴，随后在室温下孵育3小时以完成聚合。

孵育后，用移液枪移除下层油相。向15毫升收集管中加入1毫升含20% PFO的HFE油，作为化学破乳剂。混匀后，在2000 × g条件下离心15毫升收集管2分钟。

用移液管去除下层液体，并重复此步骤一次。向15毫升收集管中加入2毫升2%的山梨醇单油酸酯正己烷溶液，涡旋混匀。以3000 × g离心3分钟，然后用移液管吸除上清液，以去除表面活性剂溶液。

重复此步骤两次。加入5 mL TEBST缓冲液，充分混匀，然后在3000 × g离心3分钟，用移液器吸除上清液。重复此操作三次，然后在5 mL TEBST缓冲液中重悬。

通过在6000 × g下离心1分钟使聚丙烯酰胺颗粒沉淀，从而为颗粒模板乳化法做准备。然后用移液器吸除上清液，并将沉淀重悬于无菌水中。重复此步骤三次，以确保彻底去除任何残留的TEBST。

按照文稿中的描述，在一个新的15毫升离心管中制备分散相，使用PCR预混液、相应的引物和荧光素水解探针。将离心管置于管式旋转仪上，在室温下轻轻振荡孵育5分钟。在6000 × g条件下离心分散相1分钟，然后移除上清液。

向沉淀中加入一微升酿酒酵母基因组DNA，通过移液或用力轻弹充分混匀。向管中加入200微升含2%氟化表面活性剂的HFE油，用于乳化。通过移液或轻弹管壁使沉淀悬浮，随后在3000 RPM条件下涡旋振荡30秒。

让乳液静置一分钟，然后移除底部油相的100微升，并用新鲜的含2%氟表面活性剂的HFE油补足相同体积。轻轻翻转离心管数次以混匀。重复此步骤三次或更多次，直至去除微小的卫星液滴。

静置两到五分钟之后，移除底部的油相。用含5%氟化表面活性剂的氟碳油补足该体积。将100微升样品加入200微升PCR管中，并将PCR管放入热循环仪中。

将样品移液至计数载玻片上进行荧光成像，并对样品进行成像。颗粒模板乳化法可获得极佳的单分散性。在去除过量上清液后加入稳定表面活性剂，随后涡旋样品以生成乳液。

生成的液滴由颗粒核心和含有反应所需试剂、样品分子或细胞的水相样品组成。带有模板颗粒的多分散液滴表明涡旋不充分。另一个问题是产生过多的卫星液滴，这会降低包封效率。

卫星液滴的体积不应超过总包封样品体积的10%。可通过用新鲜油洗涤乳液去除卫星液滴。在数字PCR中，当含有扩增靶标的液滴变为荧光时，可展示PTE的应用价值，从而实现对靶标的直接定量。

当目标分子稀少时，荧光液滴产生的阳性信号较少；而当目标分子丰富时，阳性信号则较多。使用市售的聚丙烯酰胺颗粒可重复获得这些结果，并在相同范围内实现准确测量。去除分散相中的上清液对于样品的封装至关重要。

了解沉淀和上清液的体积有助于识别两者之间的界面。如有疑问，应优先多去除一些上清液。