Name: 颗粒模板化乳化可实现无微流体液滴检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 了解颗粒模板化乳化技术，这是一种无需微流控设备的液滴检测方法，适用于单细胞分析和酶进化研究。该方法操作简便，无需专业培训即可实现高效乳化，为生物学研究提供了更易获取的实验工具。

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本研究开发该方案得到了美国国立卫生研究院（R01-EB019453-02）、国家情报总监办公室情报高级研究计划活动（通过Raytheon BBN Technologies Corp，合同号N66001-18-C-4507）、Chan-Zuckerberg Biohub研究员项目以及美国国防高级研究计划局（通过德克萨斯A&M大学）的资助。&amp;#38;M大学（W911NF1920013）以及通过约翰斯·霍普金斯大学应用物理实验室获得的美国疾病控制与预防中心资助（75D30-11-9C-06818（CDC3））。本文所表达的观点和结论均为作者个人意见，不应被解读为上述机构或美国政府的官方政策，无论明示或暗示。尽管文中存在版权标注，美国政府仍被授权为政府用途复制和分发重印本。

1. 用于颗粒模板乳化法的水凝胶颗粒制备。
用于颗粒模板乳化法的水凝胶颗粒可通过两种不同的方法制备。
<ol>
	<li>使用市售颗粒的制备方法
	<ol>
		<li>将 0.5 g 可与 PTE 兼容的干燥聚丙烯酰胺颗粒（例如 Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad)，直径 45–90 µm）加入 50 mL 锥形管中的 30 mL 无菌水中，充分混匀。室温孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微流控技术制备颗粒 
	注意：可使用市售液滴生成器（例如 QX200 Drop Generator (Bio-Rad)、RayDrop (Fluigent) 等）或定制微流控设计来制备适用于 PTE 的聚丙烯酰胺颗粒。
	<ol>
		<li>定制模具的制备
		<ol>
			<li>使用计算机辅助设计（CAD）软件设计软光刻掩模。将光掩模以 10 µm 分辨率打印在电路板胶片上。</li>
			<li>在 3 英寸硅片中心滴加 1 mL 光刻胶。使用匀胶机以 500 rpm 旋转 30 秒，随后以 1250 rpm 旋转 30 秒，形成厚度为 50 µm 的光刻胶层。将硅片置于设定为 95 °C 的加热板上 15 分钟，以蒸发溶剂。</li>
			<li>用盖玻片将光掩模固定在硅片上，并在平行光路下用 190 mW、365 µm 的紫外 LED 照射 2.5 分钟。随后将硅片置于设定为 95 °C 的加热板上进行曝光后烘烤 5 分钟。</li>
			<li>将涂有光刻胶的硅片浸入 100% 丙二醇单甲醚乙酸酯（PGMEA）溶液中显影，时间最长不超过 15 分钟。用新鲜的 100% PGMEA 冲洗硅片，再用 100% 异丙醇冲洗。自然风干硅片。</li>
			<li>将硅片置于设定为 95 °C 的加热板上干燥 1 分钟，以去除残留的异丙醇。将硅片放入洁净的 3 英寸培养皿中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>定制微流控装置的制备
		<ol>
			<li>按质量比 10:1 混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）硅胶基质与固化剂。将混合后的 PDMS 置于真空干燥器中抽真空脱气，直至无可见气泡。</li>
			<li>将脱气后的 PDMS 倒入培养皿中覆盖模具，确保硅片完全浸没。再次对硅片和 PDMS 进行脱气处理，以去除倾倒过程中可能产生的气泡。</li>
			<li>将硅片与 PDMS 放入设定为 65 °C 的烘箱中固化至少 60 分钟。使用手术刀从培养皿中切下带有微流控结构的 PDMS 块。操作时需格外小心，避免损伤硅模具上的微结构。</li>
			<li>使用 0.75 mm 活检打孔器在 PDMS 块上 punch 出与微流控装置对应的进样口和出样口。通过反复粘贴和撕下包装胶带的方式清除 PDMS 表面的灰尘和颗粒物。</li>
			<li>用 100% 异丙醇冲洗 50 mm × 75 mm 的载玻片，并自然风干表面。使用等离子体键合仪，在 1 mbar 的 O2 等离子体条件下处理 1 分钟，对载玻片和 PDMS（微结构面朝上）进行等离子体处理。</li>
			<li>将经等离子体处理的 PDMS（微结构面朝下）贴合到经等离子体处理的载玻片（处理面朝上）。将载玻片放入设定为 65 °C 的烘箱中至少 30 分钟，以完成键合。</li>
			<li>对所有微流控通道进行氟化表面处理，以确保表面疏水性并防止润湿。将装置在 65 °C 下烘烤至少 10 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>模板颗粒的制备
		<ol>
			<li>配制聚丙烯酰胺（PAA）溶液，包含 6.2% 丙烯酰胺、0.18% N,N′-亚甲基双（丙烯酰胺）和 0.3% 过硫酸铵。将该溶液装入带有 28G 针头的 1 mL 注射器中。</li>
			<li>配制不溶性连续相溶液，包含 5%（w/w）氟表面活性剂和 1% N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）的氢氟醚（HFE）油溶液，用于液滴的生成与稳定。将该溶液装入新的 1 mL 注射器中。</li>
			<li>将装有 PAA 溶液和 HFE 溶液的注射器分别装入注射泵（例如 NE-501）。使用聚乙烯管将两个注射器连接至微流控装置，一端插入注射器，另一端插入装置。连接前需对泵进行预启动，以排除管路中的空气。 
			注意：根据型号不同，注射泵可通过内置输入、厂商软件或自定义脚本进行控制（脚本可从 https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program 获取）。</li>
			<li>运行液滴生成装置，PAA 和 HFE 油的流速分别设为 300 µL/h 和 500 µL/h。收集 1 mL 液滴至 15 mL 收集管中，室温孵育 3 小时以完成聚合。孵育结束后，用移液器吸除下层油相。</li>
			<li>向 15 mL 收集管中加入 1 mL 含 20%（v/v）全氟辛醇（PFO）的 HFE 油作为化学破乳剂。混匀后，在 2000 × g 条件下离心 2 分钟。用移液器吸除 PFO/HFE 上清液。重复一次。</li>
			<li>向 15 mL 收集管中加入 2 mL 含 2% 吐温单油酸酯（sorbitan monooleate）的正己烷溶液，涡旋混匀。在 3000 × g 条件下离心 3 分钟。用移液器吸除上清液以去除表面活性剂/正己烷溶液。重复两次。</li>
			<li>加入 5 mL TEBST 缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，274 mM NaCl，5.4 mM KCl，20 mM EDTA，0.2% Triton X-100），充分混匀。在 3000 × g 条件下离心 3 分钟。用移液器吸除上清液。重复三次。</li>
			<li>用 5 mL TEBST 重悬颗粒。该溶液可于 4 °C 长期保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 颗粒模板乳化法。
在制备模板颗粒后，使用PTE将样本和试剂包裹在液滴中。
<ol>
	<li>通过在 6000 × g 条件下离心 1 分钟使聚丙烯酰胺颗粒沉淀，以用于颗粒模板乳化；离心后用移液器吸除上清液，并用无菌水重悬颗粒。重复此步骤 3 次，以确保彻底去除任何残留的 TEBST。</li>
	<li>使用血细胞计数板（或等效设备）测定模板颗粒的浓度和直径。通过测量像素下的直径并将其转换为微米来计算单个颗粒的直径。可使用血细胞计数板（或等效设备）作为校准载玻片，测量已知网格距离的像素值，从而建立像素与微米之间的换算关系。</li>
	<li>在新的 1.5 mL 微离心管中，根据 表 1 使用 PCR 主混合液、相应的引物和荧光素水解探针配制分散相。将混合物置于试管旋转仪中，在室温下以轻柔振荡（10 rpm）孵育 5 分钟，以确保各组分均匀分布。 
	​注意：颗粒的体积和目标浓度基于泊松加载原则。一般规则是，颗粒数量应比待包封样品的数量高一个数量级。对于浓度未知的样品，需进行系列稀释，以确保实现泊松加载。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>体积</td>
			<td>试剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 μL</td>
			<td>颗粒（450 颗粒/μL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 μL</td>
			<td>2x PCR 预混液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 μL</td>
			<td>10 μM 正向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 μL</td>
			<td>10 μM 反向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 μL</td>
			<td>10 μM 探针</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 μL</td>
			<td>Triton X100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45.2 μL</td>
			<td>无核酸酶水</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 数字化滴式PCR中与PTE联用的PCR预混液的配制。
<ol start="4">
	<li>将分散相在6000 × g 条件下离心1分钟，并移除上清液。记录所提取上清液的体积，并结合2.3中计算的总分散相体积，确定沉淀体积。 
	注意：所提取上清液的量会因颗粒堆积程度、直径和浓度而异，预期最小体积为300 µL。</li>
	<li>向步骤2.4所得沉淀中加入1 µL浓度为1.62 pg/µL的Saccharomyces cerevisiae基因组DNA，并通过移液或剧烈轻敲充分混匀。 
	注意：过量的水相成分可能降低包封效率。若样品体积超过沉淀体积的1%，需对样品进行浓缩。若无法浓缩样品，则应根据样品体积相应调整PCR主混合液及最终沉淀体积。PTE技术可实现对小体积（10 µL）至大体积（2 mL）模板颗粒的乳化。PCR主混合液（2.3）和油相（2.6）可根据颗粒沉淀的目标体积（2.3）和实测体积（2.4）按比例调整。</li>
	<li>向离心管中加入200 µL含2%氟化表面活性剂的HFE油，作为乳化用的不溶性连续相。通过移液或轻敲/弹击管壁确保沉淀完全悬浮。随后在3000 rpm条件下涡旋振荡30秒。 
	注意：不同品牌和型号的涡旋振荡器，其3000 rpm对应的设置可能有所不同。</li>
	<li>静置乳液1分钟。移除底部100 µL油相，并用等体积新鲜的含2%氟化表面活性剂的HFE油替换。轻轻翻转离心管数次以混匀。重复此步骤3–5次，或直至小的卫星液滴被完全去除。</li>
</ol>
3. 数字化液滴PCR及分析。
<ol>
	<li>静置 2-5 分钟后，移除底部的油相。用氟碳油中的 5% 氟化表面活性剂（例如 FC-40）补足该体积。</li>
	<li>使用宽口吸头，小心将 100 µL 样品移入 200 µL PCR 管中。将 PCR 管放入热循环仪，并按照 表 2 运行程序。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>持续时间</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>50 °C</td>
			<td>90 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>重复步骤 2 至 4，共 34 次</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>保持</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 使用PTE乳液进行数字滴式PCR的热循环条件。
<ol start="3">
	<li>使用宽孔枪头将样品移液至计数板上，用于荧光成像。采用荧光显微镜对样品进行成像，激发波长为 490 nm，发射检测波长为 525 nm。</li>
	<li>定量分析荧光阳性液滴数（Np）和总液滴数（NT），利用阳性液滴比例（Np/NT）及泊松统计学验证模板分子的存在，并计算其数量（λ）： 
	<img alt="放射性衰变公式 λ=-ln(1-Np/NT)；方程表示；物理学、数学。" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"></li>
	<li>通过以下公式计算 95% 置信区间（zc = 1.96）： 
	<img alt="置信区间方程；数学公式；统计分析工具。" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 2"></li>
	<li>根据步骤 2.5 中加入的样品体积（ν，单位为 µL），使用下方给出的公式计算样品浓度（分子数/µL）。通过技术重复样测定样品浓度的均值和标准偏差。 
	<img alt="浓度公式 λ/ν，用于光谱分析和化学计算的方程图像。" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 3"></li>
</ol>

<ol><li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%3A+A+tool+for+biology%2C+chemistry%2C+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology.</a> Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li>
<li>Gielen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput-directed+enzyme+evolution+by+absorbance-activated+droplet+sorting+%28AADS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+USA%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).</li>
<li>Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+genome-wide+studies+involving+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing.</a> Biomicrofluidics. 11 (2), 021501(2017).</li>
<li>Olmedillas-López, S., García-Arranz, M., García-Olmo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+emerging+Applications+of+Droplet+Digital+PCR+in+Oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).</li>
<li>Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Digital+PCR+in+Detecting+Human+Diseases+Associated+Gene+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+droplet+digital+PCR+for+non-invasive+prenatal+diagnosis+of+phenylketonuria%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).</li>
<li>Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Droplet+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Emerging Droplet Microfluidics.</a> Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).</li>
<li>The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+hits+its+stride%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9, 541-544 (2012).</li>
<li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).</li>
<li>Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-Templated+Emulsification+for+Microfluidics-Free+Digital+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology.</a> Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).</li>
<li>Panda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop-flow+lithography+to+generate+cell-laden+microgel+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles.</a> Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).</li>
<li>Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+microparticle-based+system+for+pooled+assays+of+small+molecules+in+cellular+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

PTE 通过涡旋使颗粒将样品封装成单分散的液滴。除了操作简单和易于获取之外，PTE 还具有多种额外优势，包括能够瞬时生成大量液滴。此外，该过程可在封闭的离心管中进行，无需将样品转移至微流控装置，从而简化整体操作流程，并减少样品污染或损失的风险。模板颗粒还提供了一种手段，可用于设计最终液滴反应的内容。例如，可通过调控颗粒的尺寸、化学性质和润湿性，实现对特定生物分子或细胞的靶向捕获；同时，可在颗粒表面展示酶、活性物质或核酸等功能基团，以促进反应，如用于单细胞测序或功能表征。尽管该方法具有灵活性，但其应用仍存在一些重要限制。例如，目前尚无法像微流控技术那样在液滴形成后添加组分，因此所有反应组分必须在封装前加入；这就要求试剂在液滴生成前保持相容性和稳定性，对于不稳定的组合，通常可通过在冰上快速混合并乳化样品来解决。或者，也可使用可通过光或热等外部刺激触发的反应性组分13。因此，PTE 为非专业人员提供了一种灵活且可扩展的液滴分析方法。结合其固有的简便性和灵活性，PTE 非常适用于多种液滴应用的实施与开发。

液滴微流控技术利用皮升级液滴中的分隔作用，相较于整体反应，可提高检测的灵敏度和准确性，在化学筛选、蛋白质工程和下一代测序中具有广泛应用1,2,3。例如，数字液滴聚合酶链式反应（ddPCR）相比整体定量聚合酶链式反应（qPCR）具有更高的准确性，可用于癌症中的遗传变异分析、致病突变的检测以及产前诊断4,5,6。然而，液滴微流控技术的一个挑战在于需要使用微流控装置对样品进行分隔；尽管微流控技术能够精确控制液滴特性，但其构建和操作需要专门的技术 expertise7,8。因此，基于液滴的方法目前主要局限于专业实验室，或在极少数情况下，仅限于有商用仪器可用的应用场景9,10。为了拓展液滴检测技术的应用，必须克服对专用微流控仪器的需求这一障碍。
本文介绍了一种无需微流控技术的单分散液滴反应方法——颗粒模板乳化法（Particle Templated Emulsification, PTE）。在PTE中，通过简单的涡旋操作，模板颗粒即可将样品包裹进载油中的液滴内（图1）。在体系混合过程中，水相部分逐渐断裂形成尺寸不断减小的液滴，直至每个液滴中仅包含一个颗粒；此时液滴无法进一步分裂，因为分裂将导致颗粒破裂。样品以壳层形式包裹在颗粒周围，从而实现对分散的细胞、试剂或功能基团的包封（图1D）。因此，PTE仅需常规涡旋仪即可完成液滴反应，无需特殊设备或专业技术。此外，液滴生成仅需数秒，相较于微流控技术所需的数分钟甚至数小时显著缩短；且产物量与容器体积成正比，而非依赖设备运行时间，因而具有极佳的可扩展性。这些优势使PTE成为在多种微流控技术难以应用的场景下开展液滴分析的理想选择。本文中，我们演示了PTE的操作流程，并将其应用于数字滴定PCR（ddPCR）实验。
<img alt="ddPCR 工作流程示意图：PCR 试剂、油相混合、涡旋乳化、液滴数字 PCR 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1．颗粒模板乳化过程概述。（A）将模板颗粒与试剂混合。（B）离心后去除多余的试剂。（C）在加入油相之前加入模板分子。（D）涡旋振荡产生包含单个模板分子的液滴。（E）随后进行热循环和成像，实现对目标模板的数字液滴分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 µm 注射器滤器</td><td>Milipore Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm 活检打孔器</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-全氟-1-辛醇（PFO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl，pH 8.0</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>27 号针头</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>3&quot; 硅片，P 型，未使用测试级</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>3D 打印离心机注射器支架</td><td>(定制)</td><td>(定制)</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺溶液，40%，用于电泳，无菌过滤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058-100ML</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel（氟化表面处理剂）</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 氟化油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>N,N&amp;prime;-亚甲基双丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Novec-7500 工程流体（HFE 油）</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>氟化表面活性剂</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td></td></tr><tr><td>PGMEA 显影液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td></td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>CadArt Services</td><td>(定制)</td><td></td></tr><tr><td>Platinum 多重 PCR 预混液（Taq 预混液）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Span 80（单油酸山梨醇酯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 光刻胶</td><td>Kayaku</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100（辛基苯基聚氧乙烯醚）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20（聚山梨酯 20）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Platinum 多重 PCR 预混液（Taq 预混液）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>酵母 FWD</td><td>IDT</td><td>5&amp;prime;-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3&amp;prime;</td><td></td></tr><tr><td>酵母 REV</td><td>IDT</td><td>5&amp;prime;-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA&lt;br/&gt; AC-3</td><td></td></tr><tr><td>酵母探针</td><td>IDT</td><td>5&amp;prime;-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk&lt;br/&gt; FQ/-3&amp;prime;</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL AUTO</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS LED 模块，GFP</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;AMEP4651</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 试剂盒 1.1 磅（PDMS 基液和固化剂）</td><td>&amp;nbsp;Dow Corning</td><td>DC4019862</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td></td></tr><tr><td>酿酒酵母基因组 DNA</td><td>Milipore</td><td>69240-3</td><td></td></tr><tr><td>扩展型等离子清洗仪（等离子键合仪）</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002 (230V)</td><td></td></tr></tbody></table>

颗粒模板乳化实现无需微流控的液滴分析

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

与在体相中进行的反应相比，在单分散液滴中进行的反应具有更高的准确性和灵敏度。然而，形成可控液滴所需的微流控技术对非专业人员构成了使用障碍，限制了其广泛应用。本文中，我们介绍了一种无需微流控设备即可生成单分散液滴的方法——颗粒模板乳化法。通过使用模板化水凝胶微球，仅需简单的涡旋操作即可将样品包封于单分散液滴中。我们以无微流控的数字PCR为例，验证了该方法的有效性。

<img alt="微流控液滴生成、显微镜图像、乳化过程、详细的液滴分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2。利用颗粒模板乳化法将样品封装到液滴中。 （A）用于颗粒模板乳化的模板颗粒。（B）离心后模板颗粒沉淀与上清液的分离。（C）由颗粒模板乳化法生成的液滴，其中（D）可识别出水相外壳。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在PTE中，乳液的单分散性由模板颗粒的单分散性决定，因为液滴的直径略大于颗粒。因此，均一的颗粒对于实现可控的PTE包封至关重要11。目前已有多种方法可用于制备均一的模板颗粒，包括化学法（溶胶-凝胶法、乳液聚合法）、流体动力学法（膜乳化法、均质法）以及过滤法。其中，微流控方法尤其能够实现极佳的单分散性（图2A），并可进一步对颗粒进行工程化设计，以增强其在PTE中的功能12。此外，模板颗粒也可直接购买，但其均一性虽然足够使用，通常仍低于微流控法制备的颗粒11。
进行PTE时，先将颗粒与待包封的样品混合（图1A），然后通过离心和移液去除多余的上清液（图1B），PCR管底部颗粒沉淀的照片展示了该步骤的效果（图2B）。随后加入含有稳定表面活性剂的包封油相（图1C），轻柔移液混匀后涡旋振荡30秒（图1D），以形成乳液（图2C）。所得液滴包含一个颗粒核心以及由初始样品组成的水相外壳，其中含有反应所需的试剂、目标分子和细胞（图2D）。与液滴微流控包封类似，诸如小珠或细胞等独立实体被随机包封，且符合泊松分布；但由于PTE物理机制的特性，几乎所有液滴都包含一个模板颗粒。
<img alt="液滴微流控实验结果；液滴形成的显微镜图像；带有标记液滴的试管。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3．颗粒模板乳化液滴的识别与纯化。（A）由于涡旋振荡不充分，每个液滴中包含多个颗粒，导致液滴生成不均一的示例。（B）颗粒模板乳化后预期出现的卫星液滴和主液滴，以及（C）水包油相的分离情况。（D）油相洗涤后得到的乳状液。（E）在颗粒模板乳化过程中因残留上清液过多而产生大量卫星液滴的情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
即使在成功的PTE中，也会存在双核或三核液滴，尽管只要其出现频率很低，通常对反应的贡献可忽略不计。在保持足够外壳数量的同时，实现多核液滴的低频出现，需要对工艺参数进行优化，包括表面张力、颗粒间黏附力、样品黏度、容器尺寸以及涡旋功率和时间。例如，若乳化过程未充分优化，可能产生多分散性液滴，并含有大量模板颗粒（图3A），表明涡旋作用不足以使样品完全乳化。在此类情况下，可添加去污剂以降低颗粒间黏附力并减小表面张力，或提高涡旋功率或延长涡旋时间。另一个常见问题是产生过多的卫星液滴，即微小的空液滴（图3B）。由于样品与载油之间的界面张力及流变特性，PTE乳化过程中卫星液滴的生成有时难以避免。然而，它们通常源于乳化前未充分去除多余的样品（图2B），或因涡旋功率过高，导致液滴外壳被剥离。在成功的PTE乳化中，卫星液滴所占总体积应不超过约10%（图3C）11。在此水平下，它们对反应的贡献通常可忽略，可不予考虑。出于美观目的，可通过新鲜油洗涤去除乳液中的卫星液滴（图3D）。
<img alt="细胞膜通透性的荧光显微镜观察；细胞摄取实验结果示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4．基于颗粒模板乳化数字液滴PCR的评估。 （A）液滴的荧光成像可识别出呈阳性的荧光液滴和呈阴性的非荧光液滴。（B）利用数字液滴PCR检测稀有模板或低浓度模板。（C）模板过量封装导致每个液滴中模板分子数量不一。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了展示PTE的应用价值，我们利用它进行了无需微流控的数字PCR11。通过该过程，我们将含有S. cerevisiae基因组DNA的样品进行包封，并进行了热循环。在数字PCR中，含有扩增靶标的液滴会发出荧光，而未含有靶标的液滴则保持低荧光。因此，荧光液滴的存在即指示靶标的存在，通过计数阳性液滴可直接对靶标进行定量（图4A）。荧光液滴的数量与靶分子数量成正比：当靶标稀少时，阳性液滴较少（图4B）；当靶标丰富时，阳性液滴较多（图4C）。与封装其他离散组分类似，靶标的封装遵循泊松分布，因此可将阳性液滴的比例转换为靶标浓度（图4D），从而证明了利用PTE实现数字PCR的能力11。
<img alt="微滴荧光显微镜图像；比例尺 200 μm；样品分散分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5．使用市售PAA进行数字微滴PCR的演示。 （A）微滴的荧光成像可识别无荧光信号的阴性微滴。（B）利用数字微滴PCR检测模板的低浓度。（C）利用数字微滴PCR检测模板的高浓度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
使用市售的聚丙烯酰胺颗粒可重复获得这些结果（图5），并证明了PTE能够利用市售聚丙烯酰胺颗粒进行标准数字PCR，在相同范围内实现准确测量。
补充文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/S1.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

油包水液滴检测在分析化学、酶进化和单细胞分析中具有重要应用价值，但通常需要微流控技术来生成液滴。本文中，我们描述了一种基于颗粒模板的乳化方法，这是一种无需微流控设备即可进行液滴检测的技术。

在单分散液滴中进行的反应相较于在整体溶液中进行的相同反应具有更高的准确性和灵敏度。然而，……

与定量PCR相比，数字液滴PCR具有更高的准确性和灵敏度。本方法操作简便，仅需最少的设备且无需专业技术。粒子模板乳化是一种无需微流控技术的乳化方法，不需要任何专用设备。此外，乳化过程在数秒内发生，并随容器体积扩大而相应放大。对于商用微珠，取0.5克适用于颗粒模板乳化（PTE）的干燥聚丙烯酰胺颗粒，加入至50毫升锥形管中的30毫升无菌水中，充分混匀。室温孵育30分钟。进行微流控微珠制备时，将一毫升光刻胶倒入三英寸硅片的中心，随后以500 RPM转速旋转30秒，再以1250 RPM转速旋转30秒。将硅片置于设定为95摄氏度的加热板上15分钟，以蒸发溶剂。用盖玻片将光掩模固定在硅片上，并在准直的紫外LED光源下曝光2.5分钟。将晶圆置于设定为95摄氏度的加热板上，进行5分钟的曝光后烘烤。将光刻胶硅片浸入100%PGMEA溶液中，显影时间最长可达15分钟。用新鲜的100%PGMEA冲洗晶圆，随后用100%异丙醇冲洗。将晶圆风干，然后在95摄氏度的热板上干燥一分钟，随后放入洁净的三英寸培养皿中。按10:1的比例混合PDMS硅胶基础剂与固化剂，再将混合后的PDMS置于真空干燥器中脱气，直至观察不到气泡。将脱气后的PDMS倒入培养皿中，确保硅晶圆完全浸没。对硅片和聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行脱气处理，然后将硅片放入设定为65°C的烘箱中至少固化60分钟，使PDMS固化。使用解剖刀从培养皿中切下含有微流控结构的PDMS块。使用0.75毫米的活检打孔器在PDMS块上打出入孔和出孔。然后，通过反复使用包装胶带粘贴并撕下，去除方块表面的灰尘和颗粒物。用100%异丙醇冲洗玻璃载片以清洁表面，随后使其自然风干。使用等离子体键合仪，以1毫巴的氧气等离子体对方玻片和PDMS进行处理，处理时间为1分钟。将经等离子体处理的PDMS（微结构面朝下）贴合到经等离子体处理、表面朝上的载玻片上，完成PDMS与玻璃载片的粘附。将载玻片置于65 °C的烘箱中至少30分钟，以完成键合。对所有微流控通道进行氟化表面处理，以确保表面具有疏水性，随后将器件在65 °C下烘烤至少10分钟。将含有聚丙烯酰胺（PAA）和氢氟醚（HFE）溶液的注射器分别装入注射泵中。使用聚乙烯管将两支注射器连接至微流控装置。运行液滴生成装置，并在15毫升收集管中收集1毫升液滴，随后在室温下孵育3小时以完成聚合。孵育后，用移液枪移除下层油相。向15毫升收集管中加入1毫升含20% PFO的HFE油，作为化学破乳剂。混匀后，在2000 × g条件下离心15毫升收集管2分钟。用移液管去除下层液体，并重复此步骤一次。向15毫升收集管中加入2毫升2%的山梨醇单油酸酯正己烷溶液，涡旋混匀。以3000 × g离心3分钟，然后用移液管吸除上清液，以去除表面活性剂溶液。重复此步骤两次。加入5 mL TEBST缓冲液，充分混匀，然后在3000 × g离心3分钟，用移液器吸除上清液。重复此操作三次，然后在5 mL TEBST缓冲液中重悬。通过在6000 × g下离心1分钟使聚丙烯酰胺颗粒沉淀，从而为颗粒模板乳化法做准备。然后用移液器吸除上清液，并将沉淀重悬于无菌水中。重复此步骤三次，以确保彻底去除任何残留的TEBST。按照文稿中的描述，在一个新的15毫升离心管中制备分散相，使用PCR预混液、相应的引物和荧光素水解探针。将离心管置于管式旋转仪上，在室温下轻轻振荡孵育5分钟。在6000 × g条件下离心分散相1分钟，然后移除上清液。向沉淀中加入一微升酿酒酵母基因组DNA，通过移液或用力轻弹充分混匀。向管中加入200微升含2%氟化表面活性剂的HFE油，用于乳化。通过移液或轻弹管壁使沉淀悬浮，随后在3000 RPM条件下涡旋振荡30秒。让乳液静置一分钟，然后移除底部油相的100微升，并用新鲜的含2%氟表面活性剂的HFE油补足相同体积。轻轻翻转离心管数次以混匀。重复此步骤三次或更多次，直至去除微小的卫星液滴。静置两到五分钟之后，移除底部的油相。用含5%氟化表面活性剂的氟碳油补足该体积。将100微升样品加入200微升PCR管中，并将PCR管放入热循环仪中。 将样品移液至计数载玻片上进行荧光成像，并对样品进行成像。颗粒模板乳化法可获得极佳的单分散性。在去除过量上清液后加入稳定表面活性剂，随后涡旋样品以生成乳液。生成的液滴由颗粒核心和含有反应所需试剂、样品分子或细胞的水相样品组成。带有模板颗粒的多分散液滴表明涡旋不充分。另一个问题是产生过多的卫星液滴，这会降低包封效率。卫星液滴的体积不应超过总包封样品体积的10%。可通过用新鲜油洗涤乳液去除卫星液滴。在数字PCR中，当含有扩增靶标的液滴变为荧光时，可展示PTE的应用价值，从而实现对靶标的直接定量。当目标分子稀少时，荧光液滴产生的阳性信号较少；而当目标分子丰富时，阳性信号则较多。使用市售的聚丙烯酰胺颗粒可重复获得这些结果，并在相同范围内实现准确测量。去除分散相中的上清液对于样品的封装至关重要。了解沉淀和上清液的体积有助于识别两者之间的界面。如有疑问，应优先多去除一些上清液。

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生物学

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