Name: 用于药物发现的人视网膜类器官毒性筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解利用人视网膜类器官进行药物筛选的计算方法，通过Fiji软件图像分析评估非诺贝特对脱氧鞘脂诱导的光感受器毒性的保护作用。该临床前平台为视网膜退行性疾病治疗发现提供高效工具。

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由Lowy医学研究所资助。我们感谢Lowy家族对MacTel项目的支持。我们感谢Mari Gantner、Mike Dorrell和Lea Scheppke在学术方面的贡献以及对稿件准备工作的协助。

<ol><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li>
<li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li>
<li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down%2C+mice+are+not+just+small+humans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).</li>
<li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li>
<li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+pathways+in+neurodegeneration%2C+from+genetics+to+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li>
<li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2%3A+the+Melbourne+collaborative+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li>
<li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li>
<li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li>
<li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Muller%27s+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li>
<li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li>
<li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li>
<li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li>
<li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients%3A+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li>
<li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047(2014).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li>
<li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+Therapy%22%5BJournal%5D)">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156(2018).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

分化方案的差异 
自从Yoshiki Sasai团队发明自形成视杯以来20，许多实验室已开发出生成视网膜类器官的方案，这些方案几乎在每一步都可能存在差异5,18,19,21。Capowski等人提供了一份详尽的方案列表22。本文所提供的分化方案是一种简单且干预较少的方法，可为任何尝试分化成熟视网膜类器官的实验室提供良好的起点。鼓励使用者探索并采用本方案的各类改进版本。常见的方案优化步骤包括胚状体（EBs）的生成与早期分化，以及使用BMP4、DKK-1或视黄酸等分化因子以提高效率5,19,<sup class=...

在细胞培养和动物模型中模拟人类疾病，为药理学治疗药物的发现、优化和验证提供了宝贵的工具，推动候选药物向获批疗法的转化。尽管体外实验与非人类的体内模型组合长期以来一直是药物研发流程中的关键组成部分，但它们往往无法准确预测新型候选药物的临床表现1。目前迫切需要发展能够弥合简单的人体细胞单层培养与临床试验之间差距的技术。近年来，自组织的三维组织培养技术——类器官（organoids）取得了显著进展，其对所模拟组织的模拟保真度不断提高，使其成为临床前药物研发流程中极具前景的工具2。
与非人类的体内模型相比，人类细胞培养的一个主要优势在于能够复制人类代谢所特有的复杂性，而这种复杂性即使在人类与小鼠等高等脊椎动物之间也可能存在显著差异3。然而，这种特异性可能因组织复杂性的降低而被削弱；视网膜组织即为一例，其中多种细胞类型高度交织，并在不同细胞亚型之间形成独特的共生性代谢相互作用，这种相互作用无法通过单层细胞培养来重现4。人类类器官结合了复杂人体组织的模拟特性以及细胞培养的可及性和可扩展性，有望克服这些疾病建模平台的局限性。
由干细胞衍生的视网膜类器官在模拟人类神经视网膜这一复杂组织方面已显示出高度的保真性5。这使得视网膜类器官模型成为研究和治疗视网膜疾病的一项颇具前景的技术6,7。迄今为止，视网膜类器官中的疾病建模主要集中在单基因遗传性视网膜疾病上，即利用携带致病性遗传变异的诱导多能干细胞（iPSC）系来生成类器官7。这些突变通常具有高外显率，并表现为发育过程中的表型异常。相比之下，针对衰老相关疾病的建模研究仍较为有限，这类疾病中，遗传突变和环境应激因素作用于已正常发育的组织。衰老相关的神经退行性疾病可能涉及复杂的遗传背景以及环境应激因素的共同作用，而这些因素本身难以通过短期的细胞培养模型进行有效模拟。然而，在许多情况下，这些复杂疾病最终会汇聚于共同的细胞或代谢应激通路，若能在完全发育成熟的人体组织上进行测试，将有助于深入理解衰老相关神经退行性疾病的发病机制8。
晚发性黄斑变性病——2型黄斑毛细血管扩张症（MacTel）是遗传性复杂的神经退行性疾病的一个典型例子，这类疾病最终汇聚于共同的代谢缺陷。MacTel是一种少见的与年龄相关的视网膜变性疾病，会导致黄斑区光感受器和Müller胶质细胞的丧失，进而引起中心视力进行性下降9,10,11,12,13。在MacTel患者中，尚未明确的、可能为多因素的遗传模式导致循环丝氨酸水平普遍降低，从而引起一类称为脱氧鞘脂（deoxysphingolipids, deoxySL）的神经毒性脂质种类增加14,15。为了证实deoxySL在视网膜中的毒性作用，并验证潜在的药物治疗方法，我们建立了本实验方案，用于在人视网膜类器官中检测光感受器毒性14。
本文概述了一种用于分化人视网膜类器官、建立基于类器官的毒性与挽救检测方法并量化结果的具体方案。我们提供了一个成功案例，其中确定了疑似致病因子脱氧鞘脂（deoxySL）对组织特异性的毒性，并验证了一种安全的通用药物非诺贝特在治疗deoxySL诱导的视网膜毒性中的潜在应用价值。先前的研究表明，非诺贝特可促进deoxySL的降解，并降低患者体内循环的deoxySL水平，但其在减轻deoxySL诱导的视网膜毒性方面的有效性尚未得到验证16,17。尽管本文展示的是一个具体实例，该方案仍可用于评估任意数量的代谢性或环境应激因素以及潜在治疗药物对视网膜组织的影响。

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>125 mL 锥形瓶</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>1-脱氧鞘氨醇</td><td>Avanti</td><td>860493</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂（不含维生素 A）</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Beaver 6900 微型刀片</td><td>Beaver-Visitec</td><td>BEAVER6900</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-蔗糖</td><td>VWR</td><td>97061-432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo-fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II，粉末</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸</td><td>Gibco</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG，Alexa Fluor Plus 555 标记</td><td>Thermo-fisher</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS，热灭活</td><td>Corning</td><td>45001-108</td><td></td></tr><tr><td>非诺贝特</td><td>Sigma</td><td>F6020</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素标记</td><td>Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel，生长因子减少型</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% 甲醛</td><td>Thermo-fisher</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Recoverin 抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 无菌一次性真空滤器</td><td>MilliporeSigma</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Plus-O.C.T. 包埋剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 冷冻模具</td><td>EMS</td><td>62534-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附 6 孔板</td><td>Corning</td><td>29443-030</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附 75 cm² U 型培养瓶</td><td>Corning</td><td>3814</td><td></td></tr><tr><td>真空过滤系统</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>蜡笔（ImmEdge）</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂）</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

用于药物发现的人类视网膜类器官毒性筛选

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

类器官为研究疾病机制和治疗方法提供了一个极具前景的平台，能够在人类组织的背景下直接开展研究，同时兼具细胞培养的灵活性和高通量优势。成熟的类人视网膜类器官被用于筛选针对年龄相关性视网膜变性疾病——2型黄斑毛细血管扩张症（MacTel）的潜在药物治疗方法。
我们最近发现，MacTel 可能由一类非典型脂质——脱氧鞘脂（deoxysphingolipids, deoxySLs）水平升高引起。这类脂质对视网膜具有毒性，可能导致 MacTel 患者出现感光细胞丢失。为了筛选能够防止脱氧鞘脂对感光细胞产生毒性的药物，我们利用非 MacTel 来源的诱导多能干细胞（iPSC）系生成了人类视网膜类器官，并将其培养至有丝分裂后阶段，使其发育出视网膜中所有神经谱系来源的细胞，包括功能成熟的感光细胞。随后，将视网膜类器官暴露于一种脱氧鞘脂代谢物中，并通过免疫组织化学方法检测感光细胞层的细胞凋亡情况。利用该毒性模型，我们筛选了可防止脱氧鞘脂诱导的感光细胞死亡的药理化合物。通过靶向候选策略，我们发现非诺贝特（fenofibrate）——一种常用于治疗高胆固醇和高甘油三酯的药物——也可防止脱氧鞘脂在视网膜细胞中引起的毒性作用。
毒性筛选成功鉴定出一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准、可预防感光细胞死亡的药物。由于所采用的疾病模型具有高度相关性，该发现可直接用于后续研究。该平台可轻松改造，用于测试多种代谢应激因素及潜在的药理学干预手段，从而推动未来视网膜疾病治疗方案的发现。

视网膜类器官由一条非MacTel对照iPSC系生成。类器官在培养至26周后被挑选并分配至不同的实验组。通过给予不同浓度的脱氧鞘氨醇（deoxySA）处理，以确定deoxySA是否对光感受器细胞具有毒性。共测试了0至1 µM的四种deoxySA浓度（图2），处理持续8天，每隔一天更换一次培养基。细胞死亡反应呈deoxySA浓度依赖性，在低至50 nM的deoxySA浓度下即可检测到毒性效应（图2D）。在所测试的最高浓度1 µM deoxySA下，毒性效应显著，同时仍能维持视网膜类器官的整体结构完整性（图2B，D）。而更高浓度（5 µM）的deoxySA则导致类器官在数天内发生解体（数据未显示）。deoxySA剂量反应实验的结果确定了后续毒性研究中的最优deoxySA浓度。1 µM deoxySA剂量可引起显著的细胞死亡，但未出现如5 µM时所观察到的毒性过饱和现象。
为了检...

本文介绍了一种逐步生成成熟人类视网膜类器官的实验方案，并将其应用于光感受器毒性检测，以筛选针对年龄相关性视网膜变性疾病——2型黄斑毛细血管扩张症（MacTel）的潜在药物候选分子。

类器官为研究疾病机制和治疗方法提供了一个极具前景的平台，能够在人类组织的背景下直接开展研究，兼具灵活性与……

本方案提供了一种在人体视网膜组织中直接发现和验证代谢性视网膜疾病药物治疗的临床前方法。该技术结合了人体组织代谢的复杂性与细胞培养的灵活性和高通量特性。我们已利用该检测方法获得了非诺贝特（一种常见且安全的调节脂质药物）治疗视网膜变性疾病MacTel的临床前数据，目前该药物正处于临床安全性试验阶段。该方法可应用于多种导致视网膜疾病的常见应激因素，包括营养缺乏、缺氧、光毒性以及其他有毒脂质。在培养至第24周时，检查类器官外侧是否形成初步的外节段结构。至第26至28周时，外节段应已形成较厚的层次结构。当观察到增厚的疑片区段时，将一毫摩尔的脱氧SA储备液稀释至0.51、1和2微摩尔浓度，溶于3毫升视网膜分化培养基中。在解剖显微镜下，使用无菌探针挑选出四组大小和形态大致相同的类器官，每组至少包含五个类器官，并将各组分至超低吸附6孔板的独立孔中。收集完所有类器官后，尽可能吸除每个孔中的培养基，并向每个孔中加入一种浓度的脱氧SA溶液。向第四组类器官中加入溶剂对照。培养两天后，将培养上清液更换为相应的新鲜脱氧SA溶液或对照稀释液。培养四天后，包埋冷冻切片并根据标准方案对类器官进行染色，以评估每种培养物中的细胞死亡情况。染色后，使用5至10倍放大倍数定位类器官切片中结构完整、形态良好且处于能够代表类器官横截面的平面上的区域。该切片应具有明显、至少数个细胞厚度的光感受器外核层，以及另一个独立且清晰的、不表达recoverin且无染色的细胞核层。调整图像框架并将放大倍数增加至20倍。然后再次调整玻片位置，使感光细胞层尽可能充满整个图像。设置Z平面，并设定Z轴范围的上下限，以获取切片全深度的图像。然后以Z轴层扫方式采集三种荧光染料的所有三个通道图像，并将图像保存为能够保持像素面积比例的文件格式。为了定量每份样品中的死细胞数量，在Fiji中打开图像堆栈。在Bio格式的导入选项窗口中，确认“拆分为多个窗口”部分下的所有复选框均未选中，然后选择图像、堆栈和Z轴投影，以生成用于定量分析的新图像。选择显示恢复和染色情况的图像通道，使用多边形选择工具勾勒出图像中感光细胞的连续区域。点击“分析”菜单，选择“设置测量”，并勾选“面积”选项。然后点击“分析”菜单中的“测量”，以测量感光细胞的面积，并计数正在死亡的细胞。测量结果将显示在弹出窗口中。要计数所选视感光细胞区域中凋亡阳性的细胞核，请右键单击点工具以选择多点工具，然后选择与DAPI阳性细胞核重叠的凋亡阳性染色信号，并确认染色。通过切换不同通道来验证阳性细胞。然后将凋亡阳性细胞数量除以面积，以获得每个类器官中光感受器细胞死亡的标准化数值。在确定诱导目标细胞死亡的脱氧唾液酸（deoxySA）浓度后，使用无菌探针挑选出三组大小和形状大致相同的类器官，每组至少包含五个类器官。并将这三组类器官分别加入超低吸附6孔板的独立孔中。向相应的孔或类器官中加入目标细胞死亡浓度的脱氧唾液酸（deoxySA）、目标细胞死亡浓度的脱氧唾液酸补充待测药物或对照培养基。两天后，将每孔中的上清液更换为适当浓度的新鲜处理液或对照培养基。培养四天后，按照所示方法评估细胞死亡情况。在此代表性分析中，采用非2型黄斑毛细血管扩张症对照诱导多能干细胞系生成的视网膜类器官，经四种浓度的脱氧鞘氨醇（deoxySA）处理。细胞死亡反应呈脱氧鞘氨醇浓度依赖性，在低至50纳摩尔脱氧鞘氨醇浓度下即可检测到细胞死亡。最高测试浓度可诱导显著的细胞死亡，同时仍维持视网膜类器官的结构完整性。使用20微摩尔的非诺贝特处理可防止脱氧唾液酸（deoxySA）在视网膜类器官的光感受器中诱导的毒性，在处理四天后使细胞死亡显著减少约80%。请务必选择形态良好且健康的类器官，以确保实验在视网膜细胞中进行。类器官可用于RNA提取以定量基因表达，从而评估应激信号，并验证毒性效应及挽救效果。利用该技术，我们能够检测类器官中多种不同脂质的下游代谢，从而开启了人类视网膜脂质代谢的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于药物发现的人视网膜类器官毒性筛选

高通量小干扰RNA筛选是一种重要工具，有助于更快速地阐明化学性角膜上皮损伤的分子机制。本文介绍了用于氢氟酸和氯化苦诱导角膜上皮损伤的高通量筛选暴露模型与方法的建立及验证。...

高通量siRNA筛选氯化苦和氟化氢诱导的角膜上皮细胞损伤

采用自组织方法，我们开发了一种通过添加COCO显著提高感光细胞生成的方案。...

由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

本方案介绍并描述了从成年小鼠获取的视网膜外植体的分离、解剖、培养和染色步骤。该方法作为一种离体（ex...

成年小鼠视网膜外植体作为 离体 研究视网膜神经血管疾病的模型

本方案描述了一种用于中高通量类器官药物筛选的半自动化方法，以及一种不依赖显微镜型号的自动化图像分析软件，可用于定量和可视化分析多参数的单个类器官药物反应，以捕捉肿瘤内异质性。...

利用宽场活细胞成像进行大规模及单肿瘤类器官分析的多参数类器官药物筛选

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。...

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

本方案描述了一种优化的三维神经视网膜诱导系统，可减少视网膜类器官的黏附与融合，具有高重复性和高效率。...

由人多能干细胞生成神经视网膜

小胶质细胞是视网膜中独特的常驻免疫细胞，在多种视网膜变性疾病中发挥关键作用。建立视网膜类器官与小胶质细胞的共培养模型，有助于更深入理解视网膜疾病的发病机制及发展过程。...

利用小胶质细胞构建视网膜类器官

该方案结合光学透明化与免疫标记技术，实现对整体视网膜类器官的全体积共聚焦成像。该方法可保持三维结构，从而实现对关键神经元通路的精细可视化，有助于深入研究视网膜成熟过程、空间组织特征，及其在疾病建模和个体化医学中的潜在应用。...

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

我们实验室制备的荧光纳米颗粒可用于成像生物系统中的离子浓度和离子流，例如细胞在信号传导过程中以及生理稳态下间质液中的离子动态。...

用于生物系统中离子浓度检测的荧光纳米颗粒

GENPLAT：一个用于生物质酶发现与酶组合优化的自动化平台

了解利用人视网膜类器官进行药物筛选的计算方法，通过Fiji软件图像分析评估非诺贝特对脱氧鞘脂诱导的光感受器毒性的保护作用。该临床前平台为视网膜退行性疾病治疗发现提供高效工具。

用于药物发现的人类视网膜类器官毒性筛选

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