用于药物发现的人视网膜类器官毒性筛选

该协议提供了一种临床前方法，以发现和验证直接在人类视网膜组织内代谢性视网膜疾病的药物治疗。该技术将人体组织中代谢的复杂性与细胞培养的多功能性和通量相结合。我们已经使用该测定法获取治疗视网膜退行性疾病MacTel的临床前数据，使用一种常见且安全的脂质改变药物非诺贝特，该药物目前正在进行临床安全性试验。

这种方法可以应用于导致疾病的任意数量的常见视网膜应激源，包括营养缺乏、缺氧、光毒性和其他有毒脂质。在培养的第 24 周，检查类器官是否在类器官外部形成基本片段。到第26周到第28周，外段应该已经形成了厚厚的一层。

当可以观察到增厚的怀疑者段时，将一毫摩尔脱氧SA储备溶液稀释至0.51。在三毫升视网膜分化培养基中加入一微摩尔和两微摩尔浓度加。使用解剖显微镜和无菌探针，选择四组大小和形状大致相同的类器官，每组至少五个类器官，并将这些组分成超低附着 6 孔板的单个孔。

收集完所有类器官后，从每个孔中去除尽可能多的培养基，并向每个孔中加入一种浓度的脱氧SA溶液。将载体对照添加到第四组类器官中。培养两天后，用适当的新鲜脱氧SA或对照稀释液替换培养物上清液。

培养四天后，嵌入冷冻切片并根据标准方案对类器官进行染色，以评估每种培养物中的细胞死亡。染色后，使用5至10倍放大倍率定位切片类器官切片中完整，结构良好的区域，并在对类器官的代表性横截面进行采样的平面中。该切片应具有至少几个细胞厚的光感受器的独特外核层，以及没有恢复和染色的独立且独特的细胞核层。

构图并将放大倍率增加到 20 倍。然后，再次构图幻灯片，用尽可能多的感光层填充图像。设置 Z 平面并设置 Z 范围的上限下限，以对切片的整个深度进行成像。

然后在Z-stack采集中对荧光团的所有三个通道进行成像，并将图像保存为保留每像素面积比的文件格式。要量化每个样品中的死细胞数量，请在斐济打开图像堆栈。在生物格式的导入选项窗口中，确认未选中拆分为单独窗口部分下的框，然后选择图像、堆栈和 Z 项目以创建新图像进行量化。

选择显示恢复和染色的图像通道，并使用多边形选择工具勾勒出图像中感光器的连续区域。单击分析和设置测量值，然后选择面积框。单击分析和测量，以测量光感受器的面积，以计数垂死的细胞。

测量结果将显示在弹出窗口中。要计数所选感光器区域中的细胞凋亡阳性细胞核，请右键单击点工具以选择多点工具，然后选择与DAPI阳性细胞核重叠的细胞凋亡阳性染色并恢复和染色。在通道之间切换以验证阳性细胞。

然后将细胞凋亡阳性细胞的数量除以面积，以获得每个类器官光感受器内细胞死亡的标准化值。确定诱导靶细胞死亡的脱氧SA浓度后，使用无菌探针选择三组大小和形状大致相同的类器官，每组至少五个类器官。并将这些组添加到超低附着6孔板的各个孔中。

将目标细胞死亡浓度的脱氧SA、补充有目标药物或对照培养基的脱氧SA的靶细胞死亡浓度加入到适当的孔或类器官中。两天后，用适当浓度的新鲜处理或对照培养基替换每个孔中的上清液。培养四天后，如图所示评估培养物的细胞死亡情况。

在这项代表性分析中，用四种浓度的脱氧SA处理由非黄斑毛细血管扩张2型控制诱导的多能干细胞系产生的视网膜类器官。响应脱氧SA的细胞死亡是浓度依赖性的，并且可以在低至50纳摩尔的脱氧SA中检测到。测试的最高浓度诱导了强大的细胞死亡，同时仍然保持视网膜类器官的完整性。

用20微摩尔非诺贝特处理可防止脱氧SA诱导的视网膜类器官光受体毒性，治疗4天后显着减少约80%的细胞死亡。请记住选择形态良好且健康的类器官，以确保在视网膜细胞中进行测定。可以处理类器官以进行RNA收集，以量化基因表达，从而可以评估应激信号并验证毒性作用和救援。

使用这种技术，我们已经能够测定类器官中多种不同脂质的下游代谢，开辟了人类视网膜中脂质代谢的研究。